Summary
단백질 정제의 과정에서 사용될 적합한 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 (혼성 집적회로) 미디어를 식별하는 자동화된 방법을 설명하고있다. 방법은 자동화된 버퍼 블렌딩, 동적 시료 루프 주입, 순차 열 선택, 다중 파장 분석 및 분할 분획 eluate 컬렉션을 포함하여 중간 압력 액체 크로마 토그래피 시스템을 활용합니다.
Abstract
정화 단백질 (예 : 젤 여과, 친화력, 그리고 이온 교환) 다른 색층 방법와는 달리, 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 (혼성 집적회로)는 일반적으로 가장 적합한 색층 매체를 선택하기 위해 실험적 결정 (심사 또는 "정찰"로 칭함)가 필요합니다 주어진 단백질 1 정화입니다. 여기에 제시된 방법은 단백질 정제에 사용되는 최적의 혼성 집적회로 미디어를 찾는다는 뜻에 대한 자동 접근 방식을 설명합니다.
혼성 집적회로가 소수성의 차이를 기반으로 원유 lysate에서 단백질 및 기타 biomolecules를 분리시킵니다. 친화성 크로마 토그래피 (AC)와 이온 교환 크로마 토그래피 (IEX)와 마찬가지로, 혼성 집적회는 색층 프로세스를 통해 진행됨에 따라 관심 단백질을 집중시킬 것입니다. 최고의 혼성 집적회로에 의해 정화에 적합 단백질은 소수성 표면 영역 및 2 M의 탄약을 초과하는 농도를 방해하기 위해 노출을 견딜 수있는 사람을 포함nium 황산 ((NH 4) 2 SO 4). 혼성 집적회로 종종 친화 태그가 부족한 단백질을위한 정제 방법으로 선택하고, 교류를위한 따라서 적합하고, IEX는 충분한 정화를 제공하는 데 실패하면된다. 단백질 표면의 소수성 moieties 일시적으로 불활성, 움직이기 힘드는 매트릭스를 결합 무극 성 리간드에 바인딩. 단백질과 리간드 사이의 상호 작용이 단백질 - 리간드 상호 작용을 강화하고 움직이기 힘드는 단백질 (즉, 열은 내부 구속) 2를 만들기 높은 이온 농도로, 크로마 토그래피 칼럼을 통해 흐르는 버퍼의 소금 농도에 크게 의존합니다. 소금 농도 감소로 단백질 리간드 상호 작용 없어져요, 단백질 다시 컬럼에서 모바일 및 elutes된다. 여러 혼성 집적회로 미디어가 미리 포장 컬럼에서 상업적으로 사용할 수있는 여러 소수성 리간드 (예 : octyl S-부틸, 부틸, 그리고 페닐) 각각 포함하는 하나 사양의 아가로 오스 비즈로 밀도를 변화에서 크로스는-연결된ific 직경 3. 정찰 자동 열은 혼성 집적회로 미디어가 앞으로 더 철저한 최적화 실험을 위해 고용 및 단백질 정제 4를 운영해야하는 결정하기위한 효율적인 접근을 허용합니다.
여기를 정화하는 특정 단백질은 재조합 녹색 형광 단백질 (GFP)입니다 있으나, 접근은 하나 이상의 소수성 표면 영역과 다른 단백질 정화에 맞게 조정될 수 있습니다. GFP가 자외선 5로 노출시의 안정성, 397 nm의에서 독특한 빛의 흡광 피크, 그리고 형광에 의한 유용한 모델 단백질로서의 역할을합니다. 야생 형 GFP를 포함하는 세균성 lysate는 높은 소금 버퍼에 준비된 바이오 방사선 DuoFlow 매체 압력 액체 크로마 토그래피 시스템에로드하고, 다른 혼성 집적회로 미디어를 포함하는 HiTrap 혼성 집적회로 컬럼에 adsorbed되었다. 단백질은 칼럼에서 eluted과 인라인 및 사후 운영하는 검출 방법에 의해 분석되었다. 버퍼 블렌딩, 동적 시료 루프 주입, 순차 열umn 선택, 다중 파장 분석 및 분할 분획 eluate 컬렉션은 실험적 접근 방식의 시스템과 재현성의 기능을 향상시켰습니다.
Protocol
1. 버퍼 및 샘플 준비
- 기술 노트 : 모든 버퍼 냉장해야하며 별도로 명시하지 않는 한이 프로토콜의 각 단계가, 얼음 또는 4 ° C에서 수행되어야합니다. 낮은 기온이 정화되는 단백질의 저하를 방지하고 최적 작동 조건을 보장하기 위해 필수적입니다. 혼성 집적회로 미디어는 상온에서 운영하는 경우에 다른 분리 결과를 얻을 수 있으며, 크로마 토그래피 시스템은 4 ° C 차가운 방 또는 차가운 상자에서 작동해야합니다.
- 다음 버퍼 500 ML 준비 : 200 MM를 싫어 2 PO 4 (버퍼 A1), 200 MM 2 HPO 4 나, (버퍼 A2), 그리고 4.8 M (NH 4) 2 SO 4 (버퍼 B2). 탈이온수 (버퍼 B1)도 사용됩니다. 가스를 제거하다 버퍼 최적 색층 작동 조건을 보장합니다. 시스템 극대화는 저염 인산염 용출 버퍼를 생성하는 A1과 A2 버퍼를 함께 혼합되며, 그 버퍼의 B1과 B2 조화를 이루 것입니다높은 소금 암모늄 황산 시작 버퍼 (2.4 M (NH 4) 2 SO 4) 생성합니다.
- 버퍼 B2의 10 ML 함께 정화되는 단백질을 포함하는 세포 lysate 10 ML 혼합에 의해로드되는 샘플의 20 ML을 준비합니다. 세포 lysate 샘플 솔루션의 최종 암모늄 황산 농도가 시작 버퍼가 대략 상응하는 약 2.4 M (NH 4) 2 SO 4이어야합니다. 세포 lysate는 sonication 또는 10 분 3700 1 밀리그램 / ML 라이 소 자임하고 원심 분리 × g의 추가 다음에 TE 버퍼에 세균 세포 펠렛을 (10 MM 트리스 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0) resuspending으로 준비하실 수 있습니다.
- 솔루션에서 미립자 물질을 제거 필터 0.45 μm의 주사기를 묶는 낮은 단백질을 통해 lysate-버퍼 혼합물을 필터링합니다. 그것이 시스템에로드 준비가 될 때까지 얼음에 샘플을 유지.
2. DuoFlow 크로마 토그래피 시스템의 물리적 설치 및 배관
- 모든 장치의 전원을 확인하고 통신 연결이 만들어집니다. 장치는 생물 학적 DuoFlow 크로마 토그래피 소프트웨어 수동 제어 창에서 볼 수 있어야합니다. 장치의 요약은 표 1에 나열되어 있습니다. 시스템 및 배관 다이어그램의 그림은 그림 2에 있습니다.
- 포트 번호는 논리적 순서를 따라하는 등 펌프 워크 스테이션 및 시스템 극대화 포트 밸브에 대한 전기적 연결을 첨부합니다. 나중에 참조할 수 있도록 각 포트 번호와 각 밸브를 레이블. 펌프 워크 스테이션 및 시스템 극대화가 컴퓨터 / 컨트롤러 및 크로마 토그래피 시스템 간의 주요 통신 연결 역할을합니다. 어느 장치에 연결시 밸브가 자동으로 인식하고 소프트웨어에 표시됩니다.
- 기술주의 : 수동 모드에서 크로마 토그래피 시스템을 운영하는 동안 밸브가 독립적으로 제어됩니다. 밸브를 전환할 때 특히 버프를 시작하기 전에, 원하는 흐름 경로가 구성되었는지 확인하는데주의를 기울여야어 흐름.
- 버퍼 A1, A2, B1, B2 및 잠수함에 테플론 튜빙. 버퍼의 적절한 볼륨이 전체 프로토콜에 사용할 수 있으며, 튜빙은 가라 앉 남아 계속 확인하십시오. 500 A1 버퍼의 ML, A2와 B2 및 버퍼 지하 1 패 준비하는 것은 적절한 것이다.
- 그림 2에서와 제조 업체의 지침에 따라 그림과 같이 수직 샘플 밸브 및 동적 샘플 루프를 실었습니다. 가능한 튜브의 최소 길이를 사용하여 샘플 밸브 입구 (3 순위)에 샘플 루프를 연결합니다. 이것은 샘플 로딩 과정에서 샘플 희석을 최소화합니다.
- 튜브 샘플 사이의 길이, 샘플 로딩 펌프, 및 샘플 로딩 밸브 입구 (위치 2)를 최소화합니다. 이것은 샘플 루프를로드하는 데 필요한 시료의 양을 줄어 듭니다.
- 각 페어로, 1 / 16 "OD의 픽 튜빙 8 동일 크기의 쌍을 준비 1/4-28 female-to-1/4-28 여성 연합에서 함께 합류했습니다. 두 칼럼의 위치 1-8로 쌍을 연결 선택 밸브. 7 노조s은 나중에 테스트할 크로마 토그래피 컬럼으로 대체됩니다 컬럼 선택 밸브 위치 2-8에 온라인으로 연결되어 있습니다. 노조 소속 1과 연결된 인라인은 크로마 토그래피 칼럼 바이패스로 유지됩니다.
- 기술 참고 사항 : 튜브의 각 쌍 열 선택 밸브 모두에 같은 위치에 연결되어 있는지 확인합니다.
- 4 파장 UV / VIS 검출기 (QuadTec) 램프와 고정 파장 280 nm의 자외선 감지기 램프 모두를 켭니다. 이 프로토콜에 대한 QuadTec로 측정되는 파장은 214 nm의, 280 nm의, 그리고 397 nm의를 포함합니다. 고정 파장 자외선 감지기와 QuadTec 모두와 280 nm의 측정은 시스템 이중화를 제공하고 데이터 유효성을 보장합니다.
- 모든 감지기를 확인은 제조 업체의 지침에 따라 조정됩니다. backpressure 레귤레이터는 감지기에서 공기 방울 축적을 줄이기 위해 필요하며 경보기의 다운 스트림지만 산도 모니터의 상향 스트림을 설치해야합니다.
- 여기에 제시된 시스템은 두 fractio이 포함되어 있습니다사후 운영 eluate 분석에 상당한 편의를 제공 N 수집. 분획 수집, 스트림 분배기 밸브, 그리고 그림 2에서 그림과 같이 스플리터 컨트롤러를 연결합니다. 분획 수집기가 96 잘 microtiter 접시에 100 μl eluate의 분수를 수집합니다 위치 2로 연결되어있는 동안 분배기 밸브의 1의 위치를 연결된 분획 수집기는 12 ML 문화 튜브에 900 μl eluate의 분수를 수집합니다.
- 순위 2 분획 수집기, 분배기 밸브 및 분배기 컨트롤러는 크로마 토그래피의 워크 스테이션의 오프라인 운영하고 있습니다. 스플리터 컨트롤러는 바이오 - 방사선 이코노 그라데이션 펌프 내에 포함되지만 장치의 펌프 구성 요소가 사용되지 않습니다. 분배기 밸브가 그것에 연결되어있는 경우 "% 분담"설정 옵션 이코노 기울기 펌프에 표시됩니다.
- 설정 %가 10으로 분담. 위치 1 분획 수집기는 eluate (900 μl / 분수)의 90 %를 수집되며, 순위가 2 분획 수집기는 수집합니다10 % (100 μl / 분수). 분획 수집 서로에 대응하기 위해 모두 수집가의 분수 번호있게 synchrony에 진출하게됩니다.
- microplate 드롭 헤드와 포지션이 분획 수집기에 표준 분획 수집기 드롭 헤드를 교체하십시오. microplate 드롭 헤드 50 % 작은 방울 크기 (즉, 25 μl 대신 표준 50 μl)의 컬렉션을 허용하고 ≤ 500 μl 분수를 수집했을 때 특히 유용 작은 구멍을 가지고 있습니다.
- 화면상의 제어판을 사용, 1 샘플 / 분의 속도로 접시 96 - 웰과 사전에 분수를 수집하는 포지션이 분획 수집기를 설정합니다. 스플리터 컨트롤러와 순위 2 분획 수집기는 첫 번째 크로마 토그래피 실행의 시작에 따라 수동으로 즉시 시작됩니다.
- 버퍼 B1과 포지션이 분획 수집 및 microplate 드롭 헤드를 플러시.
3. 마중물 시스템 라인, 프로그래밍 실행 방법, 그리고 EquilibratING 혼성 집적회로 열
- 시스템 극대화 유입 라인 degassed 버퍼 A1, A2, B1 및 B2, 주요 워크 스테이션 펌프로 빠져들으로 샘플 루프를 린스, 그리고 제조 업체의 지침에 따라 크로마 토그래피 시스템을 플러시. 모든 4 극대화 시스템 inlets 갖춘 마중물 단계 (A1, A2, B1 및 B2) 남아있는 공기 방울을 제거하는 순서를 유지해야합니다.
- 시스템을 준비하는 것은 생물 학적 소프트웨어를 통해 시스템 컨트롤러의 수동 조작이 필요합니다. 이전 버퍼 플로우를 시작하는 예제로드 밸브 및 열 선택 밸브의 정확한 위치를 확인합니다.
- 와 같은 단계 3.4-3.5에서 설명한 시스템을 통해 매뉴얼 1 ML / 용출 버퍼의 분 유량 (0 % B)를 시작할 준비합니다.
- 생물 학적 프로그램 소프트웨어의 설정 창에서 "암모늄 황산과 인산 버퍼"및 "버퍼 블렌딩 사용"을 선택합니다. A1 버퍼, A2, B1, 그리고 설정 창에 나열 B2 그 준비에 대응을 확인합니다.
- 수동으로 한 ML / 용출 버퍼 분 단위 유량을 설정(0 % B). backpressure을 관찰하라, 전도성, 자외선 tracings, 그리고 산도를 일관되고 정상 작동 한계 내에 남아있다. 이상은 사전 절차로 해결한다 공기 또는 열 차단을 나타냅니다.
- 5 ML의 용출 버퍼로 총 8 개의 컬럼 선택 라인을 플러시. 먼저 흐름을 막는 위치 2로 열 선택 밸브를 모두 설정하고 한 ML / 분 흐름, 0% B를 재개하여이 작업을 수행할 순위 3-8의 열 선택 라인에 대해 반복합니다.
- 열 선택 밸브의 위치 2-8 1 ML의 HiTrap의 혼성 집적회로 열을 연결합니다. 한 번에 하나의 컬럼으로 단계 3.8-3.13를 완료하십시오. 혼성 집적회로 열의가 어떤 선택 밸브 위치에 배치되는주의 깊게 살펴. 혼성 집적회로 열 매체 특성의 요약은 표 2에 나열됩니다.
- 바이오 방사선 DuoFlow 시스템에 GE 의료 HiTrap 컬럼의 물리적인 연결은 1/4-28을 활용하여 부품, M6, 그리고 Luer 피팅 일련의 필요합니다. 순위 2 열 선택 밸브를 연결 노조를 제거합니다.그림 3 그림과 같이 바이오 방사선 및 GE 헬스케어 설비를 lign.
- DuoFlow로 업스트림 칼럼 피팅을 첨부합니다. 단단히 업스트림 선택 밸브 피팅에 업스트림 열 부속품을 부착하여 열 또는 튜브에 공기 방울를 막고 피하십시오. 모든 공기는 퇴학 버퍼의 큰 방울이 존재 때까지 피팅을 통해 용출 버퍼를 실행합니다. 임시 버퍼 흐름을 중지합니다.
- 열 입구에 연결된 마개를 제거하고 칼럼의 맨 위에 저염 버퍼의 큰 방울 (0 % B)를 넣습니다. 상류 부속품에 열을 연결합니다. 열 입구와 버퍼의 드랍스 넘쳐 유입 피팅을 모두 갖는 것은 기포의 무료 연결을 보장합니다.
- 칼럼을 처음 사용중인 경우 열 배출구 끝을 뜯어보면. 다운 스트림 열 피팅 및 선택 밸브 튜브에 콘센트를 연결합니다. 모든 부품이 단단하게 고정되어 있는지 확인합니다.
- backpressure 한도 40 PSI로 설정합니다. 칼럼 W를 씻으한 ML / 분의 유량에서 용출 버퍼의 ith 5 열 권 (5 열 볼륨 = 5 ML) (0 % B). 산도까지 자외선 tracings 및 backpressure는 안정 있고, 필요한 경우 열 세차를 계속합니다.
- 10 컬럼 볼륨 (10 ML) 1 ML / 분의 유량에서 시작 버퍼 (100 % B)과 컬럼을 씻으십시오. 앞의 단계뿐만 아니라 전도성에 나열된 시스템 매개 변수가 안정 때까지 필요하다면 열 세차를 계속합니다.
- 위의 준비 혼성 집적회로 열에는 현재 샘플 로딩을위한 준비가되었습니다. 테스트할 모든 열 준비를하고 나면 수동으로 위치 1 (노조)에 열 선택 밸브를 전환하고 버퍼 흐름을 중지합니다.
4. 샘플 로딩
- 20 ML 샘플로 잠수함 샘플 유입 튜브는 동적 샘플 루프로 로딩 샘플의 과정을 시작합니다. 생물 학적 소프트웨어의 수동 설정 창에서 샘플 루프로드를 전환 / 위치 1 (샘플)과 처단하기위한 샘플 로딩 밸브로 밸브를 씻는다.
- 의 행동을 개시샘플 루프 로딩 펌프, 즉시 시료 후 때까지 1 ML / 분의 유량에서 펌프 튜브로 샘플을 그리는 것은 샘플 로딩 밸브에 도달합니다. 이것은 버퍼 및 / 또는 샘플 부하 라인에서 공기를 제거합니다.
- 로딩 펌프의 흐름을 중지하고로드하기 위해 퍼지에서 샘플 로딩 밸브를 전환합니다. 샘플의 10 ML은 동적 샘플 루프 들어가게되었습니다 때까지 1 ML / 분의 유량에서 샘플 루프 로딩 펌프를 다시 시작합니다.
- 최대 10 연속 혼성 집적회로 열 정찰 실행에 대한 충분한 샘플이 이제 동적 샘플 루프에로드됩니다.
5. 소프트웨어 방식 프로그래밍 및 열 조사하고 프로토콜을 실행
- 생물 학적 소프트웨어 설치 창에서, 표 1에서 별표로 표시된 시스템 장치를 선택합니다.
- 검정 6으로 혼성 집적회로 열을 선택합니다. 프로그램 선형 내림차순 소금 기울기와 6 열 정찰 방법, 같은 표 3에서 그림. 방법은 프로그램 modificat입니다생물 학적 소프트웨어 혼성 집적회로 열 설정의 이온과가 현재 응용 프로그램에 최적화되었습니다.
- 6-열이 정찰 방법 분획 수집기 제한으로 인해 권장합니다. 프로그램 메서드가 큰 분수 볼륨을 수집하도록 조정하는 경우에는 모두 7 열은 탐사하실 수 있습니다. 정찰 기능을 선택하면 이후의 편집을 방지로 프로그램이, 그렇지 않으면 완료될 때까지 탐색 단계를 추가하지 마십시오.
- 정찰 실행을 시작합니다. 수동으로 시작 버퍼를 시작 (100 % B) 흐름, 1 ML / 분. 12 ML 문화 튜브 분획 수집기 (위치 1) 각각 96 - 웰 플레이트 분획 수집기 (위치 2), 사이 90% -10 %의 eluate 스트림 - 분할가 개시 스플리터 컨트롤러에서 시작을 누릅니다. 기술주의 : 96 - 웰 플레이트 분획 수집기는 생물 학적 소프트웨어에서 오프라인으로 운영하고 기억합니다.
- 프로그램 방법을 실행합니다. 즉시 프로그램 메서드 실행을 시작 후, 오프라인 96 - 웰 플레이트 fractio의 화면상의 제어판에서 시작을 누르면N 컬렉터. 두 분획 수집이 100 % 동기가 아닌 경우 수동으로 두 번째 분수 수집 관에 다른 분획 컬렉터 발전으로 오프라인 96 - 웰 플레이트 분획 수집기를 진행.
- 예상 런타임 매개 변수를 확인하는 실시간 디스플레이를 관찰. Backpressure, 전도도, 그리고 % B는 (그림 4) 실행 조건의 컬럼 대 컬럼 재현성을 보장하기 위해 모니터링할 수 있습니다 매개 변수를 실행하고 있습니다. 밸브 포지셔닝, 산도, 그리고 샘플 로딩도 모니터링해야합니다. 자외선 tracings는 용리 봉우리를 통해 흐름과 유사한을 확인 비교할 수 있습니다.
- 관심있는 단백질 (예 : "타겟 단백질")의 용출 프로파일과 정화를 식별하는 인라인 및 사후 운영 eluate 분석 기법을 활용.
- GFP를 포함하는 시료의 경우 397 nm의에서 단백질의 독특한 자외선 흡광도를 사용하여 인라인 용출을 관찰. 상대를 멀리 추정 추적 일반적으로 단백질 280 나노미터 흡광도를 추적 GFP 전용 397 나노미터 흡광도를 비교그리고 다른 혼성 집적회로 미디어되는 사용하여 정제는 (그림 5) 탐사.
- GFP와 다른 표적 단백질의 포스트 런타임 분석은 여러 가지 방법을 통해 수행할 수 있습니다. 96 - 웰 플레이트 분수 5-50의 μl의 Aliquots은 신선한 플레이트로 전송하고 엘리사이나 서양의 얼룩에 의해 특정 단백질 함량에 대한 assayed, 각 분획의 총 단백질 함량이 기존의 SDS-PAGE 또는를 사용하여 분석할 수 있습니다 Experion microfluidic 전기 영동 시스템. GFP 형광은 자외선 (그림 6)을 사용하여 12 ML 문화 튜브에서 감지가 가능하다.
- 가장 유망한 혼성 집적회로 매체의 식별이 샘플에 포함된 다른 단백질에 상대적으로 GFP의 용출의 비교에 의해 결정됩니다. 가장 유망한 혼성 집적회로 매체와 정화가 입력한 및 시작 버퍼와 산도의 농도 등 다른 매개 변수에 따라 최적화할 수 있습니다.
- 기술주의 : 실험의 결론에서 (degassed 버퍼 B1으로 모든 유입 라인 배치H 2 O)와 철저히 물이 펌프, 밸브 및 모든 튜브를 헹굴. 크로마 토그래피 시스템과 혼성 집적회로 열 청소 및 장기 저장을위한 제조 업체의 지침을 따르십시오.
6. 대표 검색 결과 :
대표 혼성 집적회로 소금 기울기, 전도성, 그리고 정찰 달리기 컬럼의 압력은 그림 4에 표시됩니다. 와 같은 높은 소금 버퍼 라인에서 그려진 버퍼의 백분율로 측정 염분 농도 (파란색 선)에서 변화가 혼성 집적회 방법론의 전형이다. 소금 농도가 감소로 단백질은 열 elute에 바인딩. 관찰 소금 농도에 해당하는 전도성 (적색 라인), QuadTec 및 자외선 감지기에 따라 인라인 즉시 측정됩니다. 소금 기울기 및 전도성 tracings 사이에 오프셋이 시스템을 통해, 버퍼 입구에서 여행하고, 전도성 모니터하기 위해 버퍼에 필요한 시간을 나타냅니다. 샘플 실행, T 내내그는 시스템 압력 (회색 라인)와 산도는 비교적 일정하게 유지됩니다.
그림 5는 순차 혼성 집적회로 열 정찰 실행의 chromatograms를 보여줍니다. 총 단백질 (280, 파란색 라인)과 GFP (397 녹색 라인)의 인 - 라인 감지는 각각, 280 nm의 및 397 nm의에서 빛의 흡광도를 측정하여 수행됩니다. 그것은 대략 상대 GFP의 풍요로움과 두 줄을를 비교하여 각 탐색 실행을위한 분리 수 있습니다. GFP는 친화력과 용출 프로파일의 여러 도의 변화와 함께 테스트를 거친 혼성 집적회로 컬럼에 바인딩. 미래 purifications에 대한 선호 혼성 집적회로 칼럼의 선정은 날카로운 GFP의 용출 피크 및 기타 단백질에서 가장 큰 분리를 생산하고 열을 식별을 기반으로합니다.
그림 6에서 실행을 정찰 분수 10, 12, 14, 16, 그리고 페닐 FF (높은 서브)의 18 문화 튜브는 주위 방 아래 시각 있었다 (형광등) 빛과 울트라바이올렛 (UV) 라이트. 튜브는 특성 GFP 방출 스펙트럼을 관찰하기 위해서는 두 얼굴을 앞으로 (왼쪽 패널)과 하향식 (오른쪽 패널)를 조회되었습니다. GFP는 (녹색) 명확하게 자외선 이미지 모두에서 분수 14 감지된다. 이 포스트가 운영하는 데이터도 eluted GFP의 주요 피크를 포함하는으로 분수 14 식별 397 nm의 (397, 녹색 라인)에서 eluate의 흡광도를 측정하여 GFP의 인라인 감지와 함께 친절하게 일치합니다. 왼쪽 자외선 패널의 확산 청색은 빛의 자외선 램프로부터 방출된다.
1 그림. 이 프로토콜의 도식 표현. 관심있는 단백질이 포함된 세균성 lysate (GFP, 표적 단백질)을 준비 크로마 토그래피 시작 버퍼로 높은 소금 버퍼 동등한로 희석하고 여과한다. 액체 크로마 토그래피 시스템이 준비되면 시료가로드되고 대상 단백질이 다른 단백질로부터 분리된 내가 포함된미리 포장 혼성 집적회로 열에 포함된 소수성 크로마 토그래피 매체를 사용하여 lysate 그렇죠. 분리 방법은 미디어가 최고의 GFP 분리를 제공하는 결정하기 위해 여러 크로마 토그래피 미디어를 (칼럼 정찰로 지칭)를 사용하여 여러 번 반복됩니다. eluted 단백질 (eluate)는 인라인 크로마 토그래피 시스템에 포함되어있는 감지기를 사용하고 그것이 이후의 (후 실행) 분석을위한 작은 분수로 수집 분석됩니다. 인라인 및 사후 운영 GFP 활동의 분석 및 분리, 최적의 혼성 집적회로 컬럼 및 색층 매체를 기반으로 식별됩니다.
표 1.이 프로토콜에 사용되는 키 크로마 토그래피 시스템 구성 요소.
그림 2. 고용 바이오 방사선 DuoFlow 중간 고압 액체 크로마 토그래피 시스템의 다이어그램. 싸이의 주요 특징fractionated eluate의 순차 열 실행을위한 시료의 자동 로딩 버퍼 블렌딩, 다른 크로마 토그래피 컬럼의 자동 선정, eluate의 인라인 분석 및 탠덤 컬렉션을 포함 줄기. 자세한 내용은 텍스트 및 표 1을 참조하십시오.
혼성 집적회로 미디어의 표 2. Biophysical 특성은 테스트했습니다. HiTrap의 혼성 집적회로 칼럼 이름은 리간드, 리간드 밀도, 그리고 비드 크기를 나타내는 것입니다.
* FF는 = 빠른 흐름, HP가 = 높은 성능을 제공합니다. 큰 구슬 크기는 리간드 바인딩 용량과 유량을 증가시킵니다. 작은 구슬 크기 색층 해상도를 증가시킵니다. 제조 업체에서 제공하는 문학에서 파생된 정보.
그림 3. 바이오 방사선 DuoFlow system.To 업스트림 1/4-28 Delrin 너트로 GE 의료 HiTrap 혼성 집적회로 열 연결차 물미 (A1), 남성 Luer 대 여성 1/4-28 피팅 (B1)과 남성 16분의 1 "-여성에 Luer 피팅 (C) 연결됩니다. 피팅이 나서 HiTrap 칼럼에 연결됩니다 버퍼로 플러시하고 모든 거품을 제거하는 데. 열 배출구는 여성 16분의 1 "와 남자 M6 피팅 (D)에 연결되어 남성 Luer 대 여성 M6 피팅 (E), 그리고 여성 Luer 대 여성 1 / 4-28 피팅 (B 2). 이 온 회중은 하류 1/4-28 Delrin 너트와 물미 (2)에 연결되어 있습니다. 위쪽 패널 피팅은 분리 보여줍와 낮은 패널 피팅은 조립 보여줍니다.
| # 단계 | 볼륨 (ML) | 설명 | 매개 변수 | |
| 일 | 0.00 | 전체 실행 중에 1.0 ML의 분수를 수집 | ||
| 2 | 0.00 | 스위트채널 열 | 혼성 집적회로 열 한 (위치 2) | |
| 3 | 0.00 | Isocratic 흐름 | 산도 : 6.80 100 % B | 볼륨 : 2.00 ML 흐름 : 1.00 ML / 분 |
| 4 | 2.00 | 제로 기준 | QuadTec | |
| 5 | 2.00 | 제로 기준 | 자외선 감지기 | |
| 6 | 2.00 | 샘플을 주사 | 샘플로드 동적 루프 | 자동 밸브를 주사 볼륨 : 0.50 ML 흐름 : 1.00 ML / 분 |
| 7 | 3.00 | Isocratic 흐름 | 산도 : 6.80 100 % B | 볼륨 : 5.00 ML 흐름 : 1.00 ML / 분 |
| 8 | 8.00 | 선형 그라데이션 | 산도 : 6.80 백퍼센트 B -> 0 %의 B | 볼륨 : 10.00 ML 흐름 : 1.00 ML/ 분 |
| 9 | 18.00 | Isocratic 흐름 | 산도 : 6.80 0 % B | 볼륨 : 3.00 ML 흐름 : 1.00 ML / 분 |
| 10 | 21.00 | Isocratic 흐름 | 산도 : 6.80 100 % B | 볼륨 : 5.00 ML 흐름 : 1.00 ML / 분 |
| 11 | 26.00 | 스위치 열 | 노동 조합 (위치 1) | |
| 끝 | 26.00 | 프로토콜의 끝 | 5 추가 혼성 집적회로 열이 자동으로 반복 (위치 3-7) | |
| 유형을 찾다 | 실행 횟수 : 6 | 단계 개수 탐사 : 1 | ||
고용 혼성 집적회로 탐색 방법에 대한 표 3. 생물 학적 소프트웨어 프로토콜.
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그림 4. 대표 혼성 집적회로의 소금 그라데이션, 전도성 및 열 압력. 소금 농도 (파란색 라인) 감소로 전도성 (적색 라인)뿐만 않습니다. 소금 기울기 및 전도성 tracings 사이의 오프 세트는 버퍼 입구에서 전도성 모니터에 여행을 버퍼에 필요한 시간을 나타냅니다. 시스템 압력 (회색 라인)은 정찰 실행 기간 동안 비교적 일정하게 유지됩니다.
순차 HiTrap의 혼성 집적회 칼럼 그림 5. 컴파일된 chromatograms는 점을 척후. 총 단백질 (280, 파란색 라인)과 GFP (397 녹색 라인)의 인 - 라인 감지는 각각, 280 nm의 및 397 nm의에서 빛의 흡광도를 측정하여 수행됩니다. 실험이 시리즈에서는 날카로운 GFP의 용출 피크는 페닐 FF (높은 서브) C로 관찰되었다olumn. 페닐 FF (높은 하위) 항목은 또한 GFP와 다른 단백질 사이의 가장 큰 분리를 제공할 나타났다. 추가 한 ML의 HiTrap 혼성 집적회로 열이 (페닐 FF (낮은 하위)), 부틸 빠른 흐름 (부틸 FF), 부틸-S 빠른 흐름 (부틸-S FF), 그리고 octyl 빠른 흐름 (octyl FF)에 포함된 페닐 빠른 흐름 낮은 치환을 검사 .
그림 6. 샘플 eluate에서 GFP 대표 이후의 실행 시각화. Eluate의 분수는 1/minute의 속도로 수집되었으며, 각각 GFP 내용에 대해 분석했다. 이 대표하는 그림에서 실행을 정찰 분수 10, 12, 14, 16, 그리고 페닐 FF (높은 서브)의 18 문화 튜브 주위 방 (형광등) 빛과 자외선 (UV) 라이트 아래에서 시각 있었다. 튜브는 두 얼굴을 앞으로 (왼쪽 패널)과 하향식 (오른쪽 패널)를 조회되었습니다. 왼쪽 자외선 패널의 확산 청색은 빛의 자외선 램프로부터 방출된다. GFP는 (녹색) 명확 Frac에 감지자외선 영상 모두에서 기 14. 위쪽 패널은 총 단백질 (A280, 파란색 라인)과 GFP (397, 녹색 선) 시각되고 5 분수의 크로마토 그램의 tracings를 나타냅니다.
Discussion
액체 크로마 토그래피 기법 7 생화 학적, 면역 6을 수행하는데 필요한 고도로 정제된 단백질을 준비하고, 구조적 8 연구를 위해 귀중한를 입증했습니다. 혼성 집적회로 정화 방법은 가장 많이 선호하는 매체의 경험적 결정을 요구하고, 리간드 구조, 리간드 밀도, 그리고 매트릭스 비드 속성은 모든 색층 결과 2, 3에 영향을 보여줘왔다. 정찰 자동 열은 이후의 최적화 및 단백질 정제 4 혼성 집적회 매체 선택을위한 효율적인 접근 방법입니다. 제시 자동화된 컬럼 탐색 방법을 쉽게 다양한 혼성 집적회로 단백질 정제 전략에 적용할 수 있습니다. 소금 농도, 소금의 선택, 소금 그라데이션, 그리고 산도의 변경은 더 정화 조건을 향상시킬 수 있으며, 이러한 필수 매개 변수를 변화의 효과는 이전에 13,14을 검토하고있다. 부분적으로 정화 대상 prote를 포함하는 혼성 집적회로 eluate안에는 더 이상 이러한 이온 교환 크로마 토그래피 (IEX) 또는 겔 여과 / 크기 배제 크로마 토그래피 9,10과 같은 보완 색층 기법을 사용하여 투석을 할 수 있습니다.
워낙 독특한 조명 흡광도 및 방출 특성 때문에, GFP의 용출 프로파일은 인라인 및 사후 운영하는 방식을 사용하여 확인할 수 있습니다. 이를 위해,이 프로토콜은 더 이상 관련이없는 대상 단백질이 GFP와 "태그가"되는, 재조합 GFP-융합 단백질의 정제에 맞게 조정 할 수 있습니다. GFP-태그가 대상 단백질은 자외선 11 위에서 설명한 혼성 집적회로 정화 전략 등 다양한 색층 접근법을 사용하여 정제로 감지가 가능하다. GFP 정화는 또한 현대 단백질 과학 기술 12 교육을위한 생화학 실험실에서 교육학 주식이되었다.
기본적인 혼성 집적회로 단백질 정제는 크게 덜 강력한 크로마 토그래피 싸이를 사용하여 수행할 수 있지만줄기, 여기서 제시된 계측이 유리한 결과를 얻기에 투입하기 위해 뚜렷한 장점을 가지고 있습니다. 고도로 자동화된 시스템을 활용의 주목할만한 장점이 실행 대 실행 조건 재현성, 시간 절감 효과를 개선하고, 시스템 10에 소개되는 공기의 기회를 감소 등이 있습니다. 시스템 극대화에 의해 촉진되고 시스템 제어 버퍼 블렌딩은, 버퍼 준비 및 실험 재현성의 향상 일관성을 허용합니다. 모든 정찰을위한 동적 샘플 루프에 충분한 샘플 하중을 설계하고 실행하는 것은 더욱 각 컬럼에 추가되는 샘플의 균일을 보장하고 중단하거나 다시로드 매뉴얼없이 순차적인 실행을 허용합니다. 칼럼쪽으로 샘플 루프에서 제어 샘플 주입 수동 샘플 로딩과 함께 발생할 수있는 다양성을 낮춥니다. 열 선택 밸브의 쌍은 시스템을 replumb 필요없이 연속 샘플 실행, 다른 혼성 집적회로 컬럼을 사용하여 각각에 대해 허용합니다. mul 공연 독특한 분광 프로필로 단백질을 시금 때 TI-파장 분석에 특히 유용합니다. GFP 외에도 cytochromes, flavoproteins 및 기타 헴 함유 단백질이 기술로부터 혜택을 누릴 수 있습니다. 전도율과 산도 모니터링 디바이스는 실시간 실험 조건의 확인을 위해 수 있습니다. 분할 분획 eluate 컬렉션은 향상된 분획 처리 가능하며 최소한의 샘플 볼륨 (예 : 엘리사, SDS-PAGE, 서부 얼룩 및 Experion microfluidic 전기 영동) 요구 이후의 운영 분석 방법에 대해 쉽게 전송이 가능합니다. 두 번째 분획 컬렉터 오프라인을 운영하는 것은 수동 동기화가 필요하지만, 그것은 분획 수집기 선택에 최대의 유연성을 허용합니다. 혼성 집적회로 정찰 칼럼 및 단백질 정제를 위해 이러한 강력한 크로마 토그래피 시스템을 활용하여 가장 중요한 단점은 초기 시간과 악기 수집 및 운영자 교육과 관련된 예산 지출을 포함합니다.
T "> 여기를 제시 프로토콜 바이오 방사선 DuoFlow 크로마 토그래피 시스템을 활용,. 그러나, 이러한 GE 헬스케어에서 악타의 복고 등 다른 제조 업체,에서 똑같이 강력 계장도 활용 수 있으며, 이에 상응하는 결과를 생산하는 능력이있다하더라도 비교 크로마 토그래피 시스템 정화 절차 또는 악기 수집을 시작하기 전에 고려해야하는 고유의 특성 (예를 들면 메소드 프로그래밍, 컴포넌트 명명법, 사업자 환경, 그리고 확장성 제한)가.Disclosures
크로마 토그래피의 시약을 선택하고 추가 장비는 바이오 - 방사선에 의해 제공되었다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 교부금 GM086822과 국립 과학 재단의 주요 연구 계장 보조금 DBI-0960313 국립 연구소에 의해 재정 지원되었다. 저자는 Drs를 감사드립니다. 존 미야케 & 도나 하디 (바이오 방사선)과 기술적 전문성을위한 제니퍼 Loertscher (시애틀 대학). 크로마 토그래피의 시약을 선택하고 추가 장비가 넉넉한 바이오 방사선에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 System | Bio-Rad | 7602257 | Includes system maximizer, mixer, F10 workstation, AVR7-3 valve, QuadTec UV/Vis detector with flow cell, BioFrac fraction collector, BioLogic software, and starter kit |
| AVR9-8 stream-select valve | Bio-Rad | 7600408 | |
| Diverter valve SV3-2 | Bio-Rad | 7500410 | |
| Stream splitter valve | Bio-Rad | 7410017 | |
| DynaLoop 25 Kit | Bio-Rad | 7500451 | |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Two fraction collectors used |
| BioFrac microplate drop head adapter | Bio-Rad | 74010088 | |
| BioFrac microtiter plate adapter | Bio-Rad | 7410017 | |
| UV Optics Module | Bio-Rad | 7500202 | |
| Halogen lamp | Bio-Rad | 7601331 | |
| Econo Gradient Pump | Bio-Rad | 7319001 | |
| Experion System | Bio-Rad | 7007001 | |
| Experion Pro260 Analysis Kit | Bio-Rad | 7007102 | |
| HiTrap HIC column selection kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes 7 x 1 ml pre-packed columns of HIC media for scouting |
| GE Healthcare-to-Bio-Rad column fittings | GE Healthcare | 18111251 and 18111257 |
References
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