Summary
Laterale vloeistof percussie (LFP), een uitgewerkt model van traumatisch hersenletsel bij muizen, is aangetoond. LFP vervult drie belangrijke criteria voor dierlijke modellen: validiteit, betrouwbaarheid en klinische relevantie. De procedure, bestaande uit chirurgische craniotomie, fixatie van de hub, gevolgd door inductie van letsels die zouden ontstaan bij focale en diffuse blessures, is beschreven.
Abstract
Traumatisch hersenletsel (TBI) onderzoek heeft bereikt nieuwe impuls door de toenemende bewustwording van letsels aan het hoofd, die leiden tot morbiditeit en mortaliteit. Op basis van de aard van de primaire letsel na TBI, complexe en heterogene secundaire gevolgen resultaat, gevolgd door regeneratieve processen 1,2. Primaire schade kan worden veroorzaakt door een directe contusie aan de hersenen van schedelbreuk of knippen en uitrekken van weefsel veroorzaakt verplaatsing van de hersenen als gevolg van beweging 3,4. De resulterende hematomen en snijwonden veroorzaken een vasculaire reactie 3,5, en de morfologische en functionele schade aan de witte stof leidt tot een diffuse axonale letsel 6-8. Extra secundaire veranderingen vaak gezien in de hersenen zijn oedeem en verhoogde intracraniale druk 9. Naar aanleiding van TBI zijn er microscopisch kleine veranderingen in de biochemische en fysiologische pathways met de release van excitotoxische neurotransmitters, het immuunsysteem bemiddelaars en zuurstofradicalen 10-12, wat uiteindelijk resulteert in lange termijn neurologische beperkingen 13,14. Dus het kiezen van geschikte diermodellen van TBI dat de huidige soortgelijke cellulaire en moleculaire gebeurtenissen in de menselijke en knaagdieren TBI is van cruciaal belang voor het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen letsel en reparatie.
Verschillende experimentele modellen van TBI zijn ontwikkeld om aspecten van TBI waargenomen bij de mens te reproduceren, onder wie drie specifieke modellen worden op grote schaal aangepast voor knaagdieren: vloeistof percussie, corticale invloed en het gewicht laten vallen / effect versnelling 1. De vloeistof percussie apparaat produceert een letsel door een craniectomy door het toepassen van een korte puls vloeistofdruk op de intacte dura. De puls wordt gemaakt door een slinger het slaan van de zuiger van een reservoir van vloeistof. De percussie produceert korte verplaatsing en vervorming van zenuwweefsel 1,15. Omgekeerd, corticale invloed letsel levert mechanische energie aan de intacte dura via een stijve botslichaam onder pneumatische druk 16,17. Het gewicht drop / invloed model wordt gekenmerkt door de val van een staaf met een specifieke massa op de gesloten schedel 18. Onder de TBI-modellen, LFP is de meest gevestigde en algemeen gebruikte model te evalueren gemengde focale en diffuse hersenletsel 19. Het is reproduceerbaar en is gestandaardiseerd, zodat voor het manipuleren van letsel parameters. LFP recapituleert verwondingen waargenomen bij mensen, dus waardoor het klinisch relevant, en maakt het mogelijk voor exploratie van nieuwe therapeutica voor de klinische vertaling 20.
We beschrijven het gedetailleerd protocol om LFP procedure uit te voeren bij muizen. De verwonding is toegebracht mild tot, matig met de hersenen regio's, zoals cortex, hippocampus en corpus callosum wordt het meest kwetsbaar. Hippocampus en motorisch leren taken zijn onderzocht na LFP.
Protocol
1. Craniectomy
- Een steriele chirurgische site is voorbereid, waaronder een stereotaxische afstemming instrument (Kopf Instruments) voor muizen met een muis gas verdoving kop houder (Kopf Instruments) aangesloten op een anesthesieapparaat met O 2 flush (Parkland Scientific) om voor continue inademing van isofluraan maken tijdens de operatie . Een warming pad bewaard bij 37 ° C bevindt zich onder de muis tijdens de operatie. Een chirurgische microscoop en de lichtbron nodig is. De experimentator moet dragen een laboratoriumjas, chirurgisch masker, voet over, handschoenen en hoofddeksel. Alle gereedschappen en materialen die de operatiewond contact moet worden gesteriliseerd.
- Een blessure hub, bestaande uit de vrouwelijke uiteinde van een Luer-Lok, wordt gemaakt door het afsnijden van het metalen uiteinde van een 20 g 1 ½ "naald (Becton Dickinson) met een scheermesje. De naaf moet worden gesneden met een lichte vertekening en hebben een ongeveer 3 mm binnendiameter opening. De trephine (zie stap 1.10) kan worden gebruikt voor het meten en fabriceren een blessure middelpunt van de juiste diameter. Een hub is niet nodig per dier. De hub zal worden gehecht aan de schedel en aangesloten op de LFP apparaat om de pols van de druk te leveren.
- Solid nylon koord (1,7 mm diameter, bijvoorbeeld onkruid trimmer lijn) wordt gesneden in ~ 1 mm dik schijven met behulp van een scheermesje. Nogmaals, is een schijf vereist per dier. Dit wordt gebruikt om de trephine te stabiliseren tijdens het uitvoeren van de craniectomy (zie stap 1.10).
- Muizen kunnen elke stam en leeftijd (we voornamelijk gebruik van C57BL / 6 leeftijd van 1 - 9 maanden). De muis is gewogen en verdoofd in een kleine inductie kamer (voorgevuld met 4-5% isofluraan in 100% O 2) gedurende minstens 1 minuut. Voor preventieve analgesie, is een injectie van buprenorphrine (0,1 mg / kg) gegeven intraperitoneaal en de muis wordt teruggeplaatst in de kamer voor een minuut. Analgeticum regime moet worden bevestigd door overleg met lokale dieren gebruik en onderhoud commissie.
- Het haar op de bovenkant van het hoofd van de muis is bijgesneden zo dicht mogelijk bij de huid mogelijk te maken. De muis is geplaatst in een stereotaxische afstemming instrument uitgerust met een bite-plated ontworpen om vluchtige gas anesthesie (Kopf Instruments) te beheren. Het niveau van de isofluraan gas wordt verlaagd tot 2% of van kracht. Ademhaling is visueel gecontroleerd tijdens de operatie. Andere fysiologische parameters, zoals bloed gassen (p O 2, p CO 2), bloed-pH of bloeddruk kan worden gemeten behulp van adequate apparatuur tijdens de procedure.
- Kunsttranen smeermiddel oogzalf wordt gelegd op de ogen van de muis met behulp van een katoenen applicator om te voorkomen dat ze uitdrogen. Povidon-jodium wordt toegepast op de huid tussen de ogen en hals met een katoenen applicator, gevolgd door 70% alcohol. De toepassing van povidon-jodium en alcohol wordt herhaald voor een totaal van 3 keer.
- Een middellijn hoofdhuid incisie wordt gemaakt van de ogen tot de nek met behulp van een scalpel (# 15 blad) en de huid teruggetrokken met een kleine bulldog klemmen (Fine Science Tools # 18050-28) om de schedel bloot te leggen en een duidelijke chirurgische gebied kan worden voorzien. De bulldog klemmen hangen af van de zijkanten van de schedel.
- Plaatselijke verdoving bupivacaïne (0,025% in zoutoplossing) wordt toegepast op de schedel met een katoenen applicator en de fascia is geschraapt van de schedel met de punt van tandheelkundige instrument of bot schraper (bijv., Fine Science Tools, # 10075-16).
- Een permanente marker wordt gebruikt om de schedel halverwege bregma en de lambda en tussen de pijlnaad en laterale rand boven de rechter hersenhelft (~ 2 mm rechts van de middenlijn) te markeren. Een druppel Loctite cyanoacrylaat lijm (Loctite Tak Pak 454) wordt in een plastic wegen boot en zijkant grijpen tang (Fine Science Tools, Dumont # 6) worden gebruikt om een schijf van onkruid stevige nylon koord (zie 1.3) duik in de lijm en druk vervolgens op de schijf op de markering op de schedel. Een tot twee druppels van de Loctite Accelerator wordt geleverd op de top van de schijf met behulp van een 1 ml spuit en 26 3 / 8 G naald naar de verharding van de lijm te veroorzaken. Test hechting van de schijf naar de schedel voordat u verder gaat.
- Plaats een 3 mm buitendiameter trephine (Research Instrumentatie Shop, de Universiteit van Pennsylvania) over de schijf en draai met de klok mee totdat je dwars door de schedel. Controleer regelmatig de trephine de voortgang van het boren te voorkomen te ver in de schedel en de schending van de dura. Er zal een verdunning van de schedel rond de omtrek van de schijf en de schedel flap verliest voelen wanneer licht gedrukt. Plaats de tandheelkundige gereedschap parallel / horizontaal aan de oppervlakte van de schedel te wrikken onder de schedel en het bot flap omhoog. Maak de bot van de schedel met een tang. Als er een kleine hoeveelheid van het bloeden, zonder compromissen van de dura, gebruik dan een katoenen applicator druk uit te oefenen totdat het bloeden stopt en te voorkomen dat het bot van het krijgen van stof op de dura. Echter, als er een bres in de dura, zodat herniatie zichtbaar is, moet het dier worden geëlimineerd uit het experiment door middel van humane euthanasie. Deze stap vereist voldoende ervaringhet bereiken van de gewenste chirurgische vaardigheid.
- Met behulp van een tang, onderhouden van de blessure hub in positie over de craniectomy in de schedel, zodat de bias van de naaf is uitgelijnd met de kromming van de schedel (dat wil zeggen hoe langer rand van het centrum ligt vlakbij de laterale rand van de schedel). Ondertussen, met behulp van een houten stok, knippen onder een hoek met een scheermes om een scherpe punt hebben, toe te passen superlijm gel rond de buitenranden van de naaf met de andere hand en het stabiliseren van de naaf tot het rechtop aangebracht over het gat. Voorzichtigheid is geboden niet te lijmen te krijgen op de top van de dura. Lijm op de dura zal leiden tot een verzwakking van het letsel.
- Met behulp van een kleine papieren bekertje, meng methyl-methacrylaat tandheelkundige acryl (Jet Acryl Liquid met Perm Reline / reparatiehars, Butler Schein) om een viskeuze oplossing te creëren. Gebruik een 1 cc spuit met geen naald aan cement toe te passen rondom de blessure hub. Het cement moet betrekking hebben op de bodem 2 mm van de verwonding naaf en de omliggende blootgesteld schedel. De schedel hechtingen worden afgesloten met de cement om ervoor te zorgen dat de vloeistof bolus van het letsel blijft binnen de schedelholte.
- Vul de naaf met een steriele 0,9% NaCl (zout) met behulp van een spuit en naald afgestompt. Het zout zorgt ervoor dat de dura vochtig tijdens de fase van herstel. Bovendien, als het letsel hub niet blijft gevuld, zal dat een lek in de naaf verbinding met de schedel te geven en een nieuwe hub moeten worden bijgevoegd. De muis moet worden gegeven een 0,25 ml injectie met steriele zoutoplossing IP, verwijderd uit de stereotaxische alignment instrument en geplaatst in een lege kooi zonder draad bar deksel op een warmhoudplaat. Leg een aantal hydragel op de bodem van de kooi en laat de muizen om te herstellen voor 1-2 uur.
2. Inductie van letsel
- Zet de oscilloscoop (Tektronix TDS 1001B, Twee Channel Digi-opslag Oscilloscoop 40 mHz, 500Ms.s) en versterker (Trauma Inducer Pressure Sensor Amplifier) die is aangesloten op de LFP apparaat. Bevestigen dat de LFP apparaat (Custom Design en Fabrication, Virginia Commonwealth University) en de hoge druk slangen (lengte 41cm, volume 2 ml, Baxter # 2C5643) aangesloten zijn gevuld met steriel water en vrij van luchtbellen. Aan het eind van de slang is een mannelijke Luer-Lok stuk. Met de Luer-Lok uiteinde van de slang gesloten, leveren testpulsen door het vrijgeven van de slinger. Het apparaat moet worden geprimed door het leveren van ongeveer 10 testpulsen. Bevestigen dat de slinger geeft een soepele signaal op de oscilloscoop en de versterker. Een rumoerige signaal geeft lucht in het systeem dat vooraf moet worden verwijderd om het leveren van de blessure pols. De duur van de puls moet ongeveer 20 msec. De transducer versterker geleverd met de LFP apparaat is gekalibreerd zodanig dat 10 mV = 1,0 pond per vierkante inch (PSI). Een atmosfeer (ATM) = 14,7 PSI. Geleverd letsel druk zijn meestal in het bereik van 0,9 tot 2,1 atmosfeer tot een reeks van de oprichtreflex reflex tijden en een toenemende sterfte door longoedeem te produceren. Lichte blessure wordt beschouwd als een oprichtende reflex tijd van 2 - 4 min en een 0 - 5% sterfte. Matig letsel wordt beschouwd als een oprichtende reflex tijd van 6 - 10 min en een 10 - 20% sterfte. Indien nodig, de hoek van de slinger te verhogen of verlagen van de intensiteit van de puls. De hoek van het starten van de slinger is het standpunt van ongeveer 10 graden. Na het aanpassen van de LFP-apparaat, moet u de Luer-Lok uiteinde van de slang te openen.
- De muis is geplaatst in de 4-5% isofluraan anesthesie kamer (vooraf opgeladen) tot een chirurgische vlak van anesthesie is bereikt. De muis wordt geplaatst op een platform naast de LFP apparaat en de hub is gevuld met een steriele zoutoplossing. De slang van de LFP apparaat met een mannelijke Luer-Lok is bevestigd aan de vrouwelijke Luer-Lok montage van de naaf. Het dier wordt op zijn kant en een keer een normale ademhaling hervat, maar voorafgaand aan het dier terug te winnen volledige bewustzijn (~ 2 min), de slinger van de LFP toestel is vrijgegeven aan een enkele puls met letsel veroorzaken. Het is belangrijk om niet te induceren van de blessure, terwijl het dier te verdoofd als het zou kunnen leiden tot ademhalingsproblemen en de dood. De exacte druk van de pols moet worden geregistreerd. Niet gewond, sham dieren ondergaan van dezelfde procedures, met uitzondering van de feitelijke vloeistof puls om letsel te veroorzaken.
- Het dier moet onmiddellijk worden verwijderd uit het LFP apparaat en op de rug naar de oprichtreflex reflex tijd te volgen. Nadat de muis heeft richtte zich, het is vervolgens kort verdoofd weer en het cement en de hub elkaar verwijderd uit de schedel met de hand. De hoofdhuid wordt dan afgesloten met Vetbond weefsel lijm (3M), hechtdraad of nietjes. Elke herniatie van de dura of occlusie van de hub wordt genoteerd. Een afgesloten hub zal produceren een verzwakt blessure van onbekende omvang. Het dier is terug geplaatst in de kooi op een warming pad tot de ambulante en keerde daarna terug naar zijn kooi.
3. Beoordeling van de motorische, cognitieve en histologische resultaten
- Het motor tekorten veroorzaakt door LFP kan worden bepaald met behulp van de rotarod-test, een indicator van geïntegreerde vestibulomotor en sensomotorische functie 21. Alle dieren moeten worden getest voorafgaand aan de schade aan een baseline lezen te bepalen en om de muizen wennen aan het paradigma. Muizen zijn getraind op de rotarod apparaat drie keer per dag met 1-uur intertrial interval voor de twee dagen voorafgaand aan het letsel. De latency om het evenwicht op een 36-mm buitendiameter, roterende staaf, die een rubber oppervlak heeft is gemeten. De snelheid neemt 4 tot 40 toeren per minuut meer dan een 180 sec interval. Elke proef eindigt wanneer het dier valt de rotarod.
- Op verschillende tijdstippen na letsel (meestal 1, 7 en 21 dagen), zijn de muizen opnieuw getest op het rotarod apparaat. Evaluatie van de rotarod testen nadat het letsel is gebaseerd op de individuele scores ten opzichte van hun baseline latency 22. De gemiddelde latency te vallen van de gewonde muizen is vergeleken met die van sham muizen.
- Cognitieve functie volgende LFP kunnen getest worden op een aparte set van muizen met behulp van de Morris Water Maze (MWM), een gevoelige maat voor posttraumatische ruimtelijke leer-en werkgeheugen bij knaagdieren 23. Muizen zijn gewend aan het paradigma en de testen voor basislijn reactie met behulp van een zichtbare platform test 4 dagen voor letsel. Een wit rond zwembad (1 m diameter) is gevuld met water en niet-giftige witte verf. Het platform is zichtbaar gemaakt met behulp van een vlag of een marker en er geen visuele cues op de muren. Meer dan 4 proeven, is de muis geplaatst in het kwadrant tegenover die van de zichtbare platform, en de latency naar het platform te vinden is gemeten. Maximale trial tijd is 60 seconden en de muis blijft of wordt geplaatst op het platform gedurende 15 sec bij het einde van elke proef. De intertrial interval is vijf minuten waarin de muis wordt verwarmd op een verwarmingselement. Het platform wordt verplaatst naar een ander kwadrant voor elk onderzoek en vier proeven zijn uitgevoerd.
- Voor de beoordeling van het leren, zijn muizen getraind op de MWM met behulp van een verborgen platform vast in een van de vier kwadranten op verschillende tijdstippen na letsel (meestal 1, 7 en 21 dagen). Zwart en wit signalen zijn geplaatst op de muren. Het kwadrant waarin de muis wordt geplaatst is pseudorandomly varieerde gedurende training en de tijd te vinden het platform is opgenomen. Maximale trial tijd is 60 seconden en de muis blijft of wordt geplaatst op het platform voor 15 sec en verwarmd gedurende 5 minuten tussen de proeven. Muizen worden onderworpen aan 8 proeven / dag gedurende 3 opeenvolgende dagen. Voor de beoordeling van het geheugen bewaren, worden de dieren onderworpen aan een 60 sec probe trial van de dag na de laatste training. Tijdens de probe trial, is het platform verwijderd om de bestede tijd en afstand gezwommen in het kwadrant waar het platform vroeger vast te stellen. Tot slot, is een zichtbare platform te testen gedaan om uit te sluiten mogelijke motorische en visuele tekorten die na het letsel ontwikkeld.
- Voor het bepalen van de histologische gevolgen van LFP letsel, wordt weefsel vastgesteld door intracardiale perfusie in 0,9% NaCl gevolgd door 4% paraformaldehyde op gewenste tijdstippen na letsel. Weefsel wordt 's nachts achtergevoegde bij 4 ° C en vervolgens cryoprotected in 10% en 30% sucrose en inbedding oplossing. Ingevroren seriële secties zijn gesneden op een cryostaat en verwerkt met behulp van diverse immuohistochemical en histologische technieken.
4. Representatieve resultaten:
De blessure veroorzaakt door de LFP toestel reproduceerbaar is van dier tot dier, in het bijzonder met voldoende chirurgische opleiding. Handhaving van de consistentie van het letsel, is de hoeveelheid druk geleverd aan de dura door het apparaat gecontroleerd. De slinger slaat een met water gevulde kunststof cilinder met hoge druk slangen en Luer-Lok fitting die is aangesloten op de hub letsel aangebracht op de craniectomy site op het dier (Figuur 1A). Voor een milde tot matig letsel, is de hoek van de slinger ingesteld op een druk variërend van 0,9 genereren - 2,1 atm en een oscilloscoop aangesloten op een versterker wordt gebruikt om de druk puls (figuur 1B) te visualiseren. Letsel produceert een scala aan oprichtreflex reflex tijden en een toenemende sterfte door longoedeem. Lichte blessure wordt beschouwd als een oprichtende reflex tijd van 2 - 4 min en een 0 - 5% sterfte. Matig letsel wordt beschouwd als een oprichtende reflex tijd van 6 - 10 min en een 10 - 20% sterfte. Bovendien kan muizen blootgesteld aan LFP vertonen tonic houding die kunnen wijzen op de aanval. Inbeslagneming wordt vaak geassocieerd met een gecompromitteerde dura. Samen vormen deze bevindingen suggereren dat de schade is neurologische schade veroorzaakt. Sham dieren zijn aangesloten op de LFP apparaat, maar de slinger is niet vrijgegeven.
Te visualiseren van de schade veroorzaakt door LFP, hebben wij controlewerkzaamheden uitgevoerd met behulp van immunocytochemie antilichamen die astrocyten en macrofagen die beide celtypen geassocieerd met een reactie op de blessure te herkennen. Gliale fibrillaire Zure Protein (GFAP) kleuring toont toegenomen gliosis in de cortex in de regio van letsel whereas sham muizen verhoogd astrocytose niet weergegeven in de onderstaande site het equivalent craniectomy (Figuur 2A, B). Ook MAC1 vlekken toont meer macrofagen rondom de plaats van het letsel in vergelijking met muizen blootgesteld aan sham operatie. Daarnaast is er vaak materiële schade aan de corticale weefsel zichtbaar bij muizen blootgesteld aan LFP, maar niet in sham muizen (figuur 2C, D).
Behavioral testen na mild LFP kunnen worden gebruikt om zowel de cognitieve en motorische uitkomsten te evalueren. MWM wordt gebruikt om de effecten op het leren en het geheugen vast te stellen. Met behulp van visuele aanwijzingen in de testkamer, sham muizen al snel efficiënter in het lokaliseren van het platform met elke volgende dag van de opleiding in het water doolhof. Muizen blootgesteld aan milde LFP langer duren om de verborgen platform vinden op de eerste twee dagen van het testen ten opzichte van sham muizen, maar dan lijkt de taak te leren door de derde dag (Figuur 3A). Deze bevindingen suggereren dat de schade de snelheid waarmee de muizen kunnen ruimtelijke leren verwerven vermindert. Voor het bepalen van het effect van verwondingen op het geheugen vasthouden, is een probe trial uitgevoerd een dag na de laatste training. Sham muizen brengen meer tijd door in het doel kwadrant in vergelijking met de muizen blootgesteld aan milde LFP suggereert dat de schade heeft de mogelijkheid van de muizen om de locatie van waar het platform gebruikt worden om te verblijven (figuur 3B) herinneren beïnvloed. Voor de beoordeling van motorische functie, zijn muizen getest op de rotarod apparaat. Muizen blootgesteld aan milde LFP hebben kortere gemiddelde latency te vallen in vergelijking met de sham muizen op 1, 7 en 21 dagen na de verwonding (dpi) (Figuur 3C). Deze gegevens suggereren dat de benadeelde muizen hebben geïntegreerd vestibulomotor en sensomotorische nierfunctie heeft.
Figuur 1. LFP-apparaat en een vertegenwoordiger trace van de oscilloscoop verkregen tijdens letsel. A) De componenten van de LFP toestel zijn: de slinger bevestigd aan een staan en ingesteld op een vooraf bepaalde hoek op de gewenste kracht, een met water gevulde acryl cilinder met hoge druk slang en een man verbonden Luer-Lok fitting, een versterker te leveren, en een oscilloscoop. B) Vertegenwoordiger spoor van druk puls van oscilloscoop. De piek-tot-piek waarde is 2,16 volt aangeeft een druk van 1,47 atm.
Figuur 2. Enhanced gliosis en een ontstekingsreactie na LFP toont de omvang van de schade. Bevroren dwarsdoorsneden (20μm) door de hersenen van een muis onderworpen aan sham operatie (A, C) of LFP letsel (B, D) 7 dagen na verwonding (dpi). Corticale opnames worden gemaakt in het epicentrum van de craniectomy. (A, B) Tissue is gekleurd met een antilichaam tegen astrocyten te identificeren. Gliale fibrillaire Zure Protein (GFAP) antilichaam (MAB360, Chemicon, 1:400) onthult een hoger aantal astrocyten in de cortex van de muis onderworpen aan LFP letsel (pijlen) in vergelijking met placebo operatie. Secundair antilichaam is geit anti-muis 594 (1:1000). (C. D) Tissue is gekleurd met een antilichaam tegen macrofagen te identificeren. MAC1 antilichaam (MAC1-alpha-keten CD11b, BD Biosciences, 1:50) onthult meer macrophges en / of geactiveerde microglia rond de plaats van de beschadiging in de cortex (pijlen) in vergelijking met placebo operatie. Secundair antilichaam is geit anti rat CY3 (1:50). Schaalbalk = 200μm in A en B, 100 urn in C en D.
Figuur 3. Behavioral testen na mild LFP toont tekorten in gewonden ten opzichte van placebo muizen. A) Muizen onderworpen aan een milde LFP langer duren om de taak van het vinden van het platform in het MWM dan sham muizen leren. Sham vs LFP (ave seconden ± SEM) 1 dag 34.21 ± 3.02 vs 38,64 ± 2,63; 2 dagen 24.52 ± 2.84 vs 27,21 ± 2,11; 3 dagen 22.47 ± 2.00 vs 22,08 ± 2,52 (1 dpi, n = 9 klatergoud, 10 LFP) . B) Muizen onderworpen aan een milde LFP besteden minder tijd in het doel kwadrant tijdens de sonde proef 24 uur na de laatste training in de MWM ten opzichte van sham muizen (21 dpi, n = 10). C) Muizen onderworpen aan een milde LFP vallen de rotarod apparaat eerder dan sham muizen (1, 7, en 21 dpi, n = 5 klatergoud, 8 LFP). Foutbalken vertegenwoordigen SE.
Discussion
De LFP methode hier gepresenteerde modellen veel van de neuropathalogical en gedragsmatige uitkomsten van milde tot traumatisch hersenletsel dat is waarom het is uitgegroeid tot een veel gebruikt diermodel van TBI matig. Er zijn verschillende kritische stappen te overwegen om de validiteit en betrouwbaarheid van deze techniek te vergroten. Bijvoorbeeld, is het belangrijk dat alleen dieren waarbij de integriteit van de dura niet is gevaar komen tijdens de craniectomy worden onderworpen aan LFP en gebruikt in de studie. Bovendien, als de craniectomy wordt afgesloten door een lijm of cement zodanig dat een deel van de dura onder de craniectomy niet wordt blootgesteld aan de kracht van de vloeistofdruk, moet het dier worden verwijderd uit de studie. Ten slotte, als de stabiliteitskromme reflex tijd of mortaliteit is niet binnen het gewenste bereik, mag het dier niet worden opgenomen in de studie. De intensiteit van de druk puls kan worden verhoogd tot meer ernstige verwondingen te genereren.
Zoals weergegeven in figuur 1, de configuratie van de LFP apparaat is relatief eenvoudig en de reproduceerbaarheid van de mate van letsel wordt onderhouden door het toezicht op de atmosfeer van de druk op de oscilloscoop. De vloeiende vorm van de curve op de oscilloscoop trace geeft aan dat er geen luchtbellen in de vloeistof die kunnen interfereren met de inductie van de LFP letsel. Een test puls moet voor worden geleverd aan het induceren van letsel en of de oscilloscoop trace niet vertonen een vloeiende curve, luchtbellen moeten worden verwijderd. De duur van de puls is ongeveer 20 msec, die de inductie tijd gemeten in crash-test simulaties vertegenwoordigt. Verwondingen van kortere pulsen worden waarschijnlijk meer focale blessures te produceren. Daarom is dit de duur van de puls modellen menselijke TBI.
De morfologische en cellulaire veranderingen na LFP onder meer fysieke schade aan het weefsel en toename van het aantal astrocyten en macrofagen, zoals aangetoond in Figuur 2. Het staat vast dat een van de kenmerkende symptomen van gezondheidsschade is de hyperplasie van de astrocyten en de vorming van een gliale litteken. De gliale litteken is aangetoond dat zowel de gunstige en nadelige effecten 24 hebben. Evenzo worden macrofagen bekend dat in verschillende weefsels ophopen in de fase na verwonding bij het genezingsproces begint 25. Dus de toename van het aantal GFAP en MAC1 positieve cellen in de LFP monsters ten opzichte van de sham controles is indicatief voor de inductie van letsel. Het gebrek aan expressie van die cel-specifieke markers in sham controles geeft aan dat de chirurgische manipulaties alleen geen negatieve gevolgen voor de gezondheid van het hersenweefsel en dat de veranderingen in eiwitexpressie zijn specifiek voor het letsel paradigma.
De gedragsmatige gevolgen van een mild LFP geïllustreerd in figuur 3 zijn cognitieve en motorische stoornissen. De MWM bevindingen wijzen erop dat de LFP muizen uiteindelijk de taak leren, maar in een langzamer tempo dan de sham muizen en ze de taak niet herinneren maar ook een dag na de training. Dus, zelfs licht gewond muizen zijn minder efficiënt dan de sham muizen met behulp van externe signalen te verwerken, te consolideren en op te slaan ruimtelijke informatie, die moeten worden opgehaald tijdens de volgende test. Andere hippocampus-afhankelijke cognitieve taken, zoals het geconditioneerde angstreactie is aangetoond dat ze worden belemmerd bij muizen blootgesteld aan LFP 26. Ten slotte is de kortere latency door LFP muizen in relatie tot sham muizen vallen in de rotarod paradigma tot 3 weken na lichte blessure is een indicator van de tekorten in geïntegreerde vestibulomotor en sensomotorische functie. Een meer gematigde schade zal onthullen meer opvallende veranderingen in de cognitieve en motorische functie zoals is aangetoond door andere groepen 27-30.
Kortom, de LFP is een valide model voor de menselijke TBI omdat het voldoet aan veel van de te verwachten criteria. LFP biedt construct validiteit in dat het herschept de etiologische processen die leiden tot TBI bij de mens. Met name de grootte van de kracht en het sterftecijfer is vergelijkbaar met die die optreedt in een milde of matige sport-en auto-gerelateerde verwondingen met het voorbehoud dat de pre-blessure chirurgische ingrepen zijn uniek voor het diermodel. LFP vertoont ook face validity in dat LFP recapituleert veel van de anatomische, biochemische, neuropathologische en gedragsmatige effecten waargenomen in de menselijke TBI. Er zijn zowel focale en diffuse veranderingen gedetecteerd na LFP en de lateralisatie van de impact maakt het mogelijk om vergelijking van de morfologische schade aan de zijde ipsilaterale om de schade voor die aan de contralaterale zijde. Een waarschuwing is dat de cognitieve en motorische effecten kunnen meer subtiele als gevolg van het verwonden slechts een halfrond. Tot slot, LFP vertoont predictieve validiteit en de betrouwbaarheid van de LFP-techniek maakt de evaluatie van de verschillende farmacologische en genetische manipulaties voor of na de inductie van letsel 20. Fysiologische variabelen zoals bloeddruk, pH van het bloed en bloedgassen moeten worden gemeten in de aanwezigheid en afwezigheid van een test medicijn om het mechanisme van de actie van een therapeutisch middel te bepalen. Echter, vanwege de complexe aard van de primaire en de secundaire gevolgen van TBI, het is een moeilijke taak om een enkele interventie die kan verzachten alle symptomen te identificeren.
Een toekomst aandacht voor LFP techniek kan het gebruik van micro-vloeistof percussie, die een microprocessor gestuurde, pneumatisch aangedreven instrument heeft om de noodzaak voor het kalibreren van de kracht geleverd door de slinger op te heffen en operationele variabelen zoals luchtbellen te vermijden in de vloeistof 15 worden . Echter, de standaard LFP aanpak is bewezen door vele onderzoekers om een betrouwbare en eenvoudige techniek om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen van de schade en herstel na TBI, die zal leiden tot betere interventies en therapeutica te verkennen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt gefinancierd door de New Jersey Commissie voor de Brain Injury Research.
Materials
|
References
- Cernak, I. Animal models of head trauma. NeuroRx. 2, 410-422 (2005).
- Reilly, P. L. Brain injury: the pathophysiology of the first hours.'Talk and Die revisited'. J Clin Neurosci. 8, 398-403 (2001).
- Hovda, D. A. The increase in local cerebral glucose utilization following fluid percussion brain injury is prevented with kynurenic acid and is associated with an increase in calcium. Acta neurochir. 51, 331-333 (1990).
- Whiting, M. D., Baranova, A. I., Hamm, R. J. Cognitive Impairment following Traumatic Brain Injury, Animal Models of Cognitive Impairment. , CRC Press. (2006).
- McIntosh, T. K. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28, 233-244 (1989).
- Adams, J. H. Diffuse axonal injury in head injury: definition, diagnosis and grading. Histopathology. 15, 49-59 (1989).
- Cordobes, F. Post-traumatic diffuse axonal brain injury. Analysis of 78 patients studied with computed tomography. Acta Neurochir. 81, 27-35 (1986).
- Maxwell, W. L., Povlishock, J. T., Graham, D. L. A mechanistic analysis of nondisruptive axonal injury: a review. J Neurotrauma. 14, 419-440 (1997).
- Lighthall, J. W., Anderson, T. E. The neurobiology of cenral nervous system trauma. , 3-12 (1994).
- Marcoux, J. Persistent metabolic crisis as measured by elevated cerebral microdialysis lactate-pyruvate ratio predicts chronic frontal lobe brain atrophy after traumatic brain injury. Crit Care Med. 36, 2871-2877 (2008).
- McIntosh, T. K. Neuropathological sequelae of traumatic brain injury: relationship to neurochemical and biomechanical mechanisms. Lab Invest. 74, 315-342 (1996).
- Morganti-Kossmann, M. C., Satgunaseelan, L., Bye, N., Kossmann, T. Modulation of immune response by head injury. Injury. 38, 1392-1400 (2007).
- Capruso, D. X., Levin, H. S. Cognitive impairment following closed head injury. Neurol Clin. 10, 879-893 (1992).
- Levin, H. S., Goldstein, F. C., High, W. M., Eisenberg, H. M. Disproportionately severe memory deficit in relation to normal intellectual functioning after closed head injury. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 51, 1294-1301 (1988).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nat Protoc. 5, 1552-1563 (2010).
- Cherian, L., Robertson, C. S., Contant, C. F., Bryan, R. M. Lateral cortical impact injury in rats: cerebrovascular effects of varying depth of cortical deformation and impact velocity. J Neurotrauma. 11, 573-585 (1994).
- Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods. 39, 253-262 (1991).
- Flierl, M. A. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc. 4, 1328-1337 (2009).
- Lifshitz, J. Chapter 32. Animal Models of Acute Neurological Injuries. Chen, J., Xu, Z. C., Xu, X. -M., Zhang, J. H. , Humana Press. 369-384 (2008).
- Thompson, H. J. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. J Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
- Hamm, R. J., Pike, B. R., O'Dell, D. M., Lyeth, B. G., Jenkins, L. W. The rotarod test: an evaluation of its effectiveness in assessing motor deficits following traumatic brain injury. J Neurotrauma. 11, 187-196 (1994).
- Scherbel, U. Differential acute and chronic responses of tumor necrosis factor-deficient mice to experimental brain injury. Proc Natl Acad Sci. 96, 8721-8726 (1999).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
- Stichel, C. C., Muller, H. W. The CNS lesion scar: new vistas on an old regeneration barrier. Cell Tissue Res. 294, 1-9 (1998).
- Brechot, N. Modulation of macrophage activation state protects tissue from necrosis during critical limb ischemia in thrombospondin-1-deficient mice. PLoS One. 3, e3950-e3950 (2008).
- Lifshitz, J., Witgen, B. M., Grady, M. S. Acute cognitive impairment after lateral fluid percussion brain injury recovers by 1 month: evaluation by conditioned fear response. Behav Brain Res. 177, 347-357 (2007).
- Thompson, H. J. Cognitive evaluation of traumatically brain-injured rats using serial testing in the Morris water maze. Restor Neurol Neurosci. 24, 109-114 (2006).
- Doll, H. Pharyngeal selective brain cooling improves neurofunctional and neurocognitive outcome after fluid percussion brain injury in rats. Journal of neurotrauma. 26, 235-242 (2009).
- Fujimoto, S. T. Motor and cognitive function evaluation following experimental traumatic brain injury. Neuroscience and biobehavioral reviews. 28, 365-378 (2004).
- Carbonell, W. S., Maris, D. O., McCall, T., Grady, M. S. Adaptation of the fluid percussion injury model to the mouse. Journal of neurotrauma. 15, 217-229 (1998).
