Summary
神経前駆体の移植は、保護および/または脊髄損傷（SCI）と運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索laterals硬化症（ALS）で失われた/機能不全子宮頸部横隔運動ニューロンを交換するための有望な戦略である。我々は、ALSとSCIの齧歯類モデルにおける頚髄前角に細胞送達のためのプロトコルを提供しています。
Abstract
横隔運動ニューロンの損失に起因する呼吸障害は、人間の外傷性脊髄損傷の大部分（SCI）症例1の衰弱の結果であり、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索laterals硬化症（ALS）2患者の最終的な死亡原因です。
ALSは上位と下位運動ニューロンの比較的急速な変性によって特徴付けられる壊滅的な神経疾患です。ために振動板3の横隔運動ニューロンのinnnervationの損失による呼吸麻痺の診断を以下の平均2-5年で病気に最終的に屈するの患者。 10％が家族性のものである間、ほとんどの場合は、散発的です。家族性症例の約20％は21番染色体4上のCu / Znスーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）遺伝子の様々な点変異にリンクされています。運動ニューロンの損失の他の動物モデルが存在するにもかかわらず、現在の病気の最もよく使用されるモデルである4,5およびラット6運ぶ変異型ヒトSOD1遺伝子（G93A、G37R、G86R、G85R）が生成されている、そして、トランスジェニックマウス。
脊髄損傷（SCI）は、機能的転帰が負傷7種類、場所と重大度に応じて変化させると、物理的な外傷から脊髄に生じる条件の異種のセットです。それにもかかわらず、人間のSCIの症例の約半数が降順延髄の呼吸器系の軸索は1〜横隔運動ニューロンの損失と負傷に起因する衰弱性呼吸機能不全の結果、子宮頸部の領域に影響を与えます。 SCIの動物モデルの数は、最も一般的に使用し、臨床的に意義のある挫傷8であると、開発されている。
神経前駆細胞のさまざまなクラス（NPCに）の移植がため、紛失したり、機能不全のCNSの細胞型を交換する神経保護作用を提供し、遺伝子因子を提供する能力が、ALSとSCIを含む外傷性中枢神経系の損傷や神経変性の治療のための有望な治療戦略である関心9。
ALSとSCIの両方の動物モデルは、横隔運動ニューロンの消失とそれに伴う呼吸障害10,11を含むこれらの疾患の多くは臨床的に意義のある側面を、モデル化できます。 ALSとSCIのこれらの動物モデルで呼吸機能上のNPCをベースとした戦略の有効性を評価するために、細胞の介入は、具体的には横隔運動ニューロンなどの治療に関連したターゲットを含む地域に向けられなければならない。我々はそのようなSOD1 G93Aマウスやラットなどの神経変性モデルの頸部脊髄腹側灰白質だけでなく、脊髄損傷のラットおよびマウス11にNPCのマルチセグメント、脊髄移植のための詳細なプロトコルを提供しています。
Protocol
の方法
1。細胞の準備
例として、我々はこのために細胞型との経験の移植のためにグリア前駆細胞12を調製するための手順を説明します。しかし、例えば、トリプシンの培地および使用を含むプロトコルの詳細は、移植のために使用されている特定の細胞型に依存します。
- ℃の水浴中で37.0に予熱するすべてのソリューション。
- HBSSでフラスコの2倍をすすぎます。 0.05％トリプシン/ EDTA 5.0 mL/T-75フラスコを追加。 37.0℃のインキュベーター中で3分間フラスコをインキュベートする。 5または10mLをピペットでフラスコに優しく3Xひいて粉にする。
オプション：DMEM/F12では1.0 mg / mlの大豆トリプシン阻害剤の追加5.0 mL/T-75フラスコ。
- 培地5.0 mLの各フラスコの2倍をすすぎます。プールの細胞とリンス。すべての後続のステップのために氷上で細胞を維持する。
- コニカルチューブ中で5分間200〜300グラムでスピン好ましくは遠心分離機では、4℃に冷却した。デカント（および保存）上澄み。培地1.0 mLで細胞を再サスペンド、および転送1.5mlのエッペンドルフチューブへ。
- 実行可能性を判断するためにトリパンブルーを用いて血球計数器で細胞を数える。
- 1.5mlチューブ（：好ましくは4℃に冷却遠心機で10分間800回転）で再びスピン。デカント（および保存）上澄み。
- 細胞は、適切な細胞密度を達成するために媒体の所望の最終体積で再懸濁する。
- 複数の1.5 mLエッペンドルフチューブに細胞懸濁液を配布します。移植するまで氷上で細胞を維持する。
ハミルトンシリンジ/ニードルはこのチューブの中に深く収まることができないとして、0.75 mLチューブを使用しないでください。複数の注射はおそらく手術のセッション中に行われ、一つは細胞の何倍の同じチューブを乱すことを避けるために望んでいることになります。必要とされるよりも、細胞懸濁液の少なくとも50％以上のボリュームを準備してみてください。手術のセッションを通して氷上に細胞を維持する。細胞移植後の最大の可能性を確保するために細胞懸濁液を準備する4-5時間内に移植細胞。
2。手術前の準備
- 手術前に、関連するベースラインの動作のアセスメントを実施。
- 免疫抑制：皮下シクロスポリン（CSA：10.0ミリグラム/体重kg）または腹腔内（IP）FK-506/Rapamycin（は1.0 mg /体重kg）移植前の少なくとも3日前に開始されるべきである、とすべき犠牲になるまで毎日投与。飲料水（代わりに毎日注射の）での投与が推奨されていません。げっ歯類由来の細胞を移植する際にヒト由来の細胞を移植するときにFK-506/Rapamycinが我々の選択のときにCSAは、選択肢の私たちの免疫抑制剤です。
- 手術前に手術器具をオートクレーブ。手術を行うにはきちんとした清潔な場所だけでなく、ツールを置くために整頓された場所を準備します。ガラスビーズ滅菌器にも便利です。これは、手順がより簡単になりますと、手術中にツールがきれい（特に骨鉗子）のすべてを保管してください。外科手術中に使用されるすべての材料は、無菌である必要があります。
- このような手術用顕微鏡として滅菌することができない楽器は、適切な消毒剤でダウン拭き取ってくださいと外科医、一度滅菌手袋を着用は、彼/彼女の手袋を汚染しないように無菌の材料（例えば、ガーゼ）で覆われてハンドル。
- 外科医は手術を開始する前に、消毒薬（クロルヘキシジンスクラブ）で、彼女/彼の手を洗ってください。外科医は、滅菌手袋、フェイスマスク、そしてきれいなガウンを着用します。
3。手術：動物の準備と手術
動物準備：
- 動物を秤量し、麻酔の適切な投薬する：イソフルラン吸入または麻酔のカクテル（IP経由で配信）の[アセプロマジンマレイン酸（0.7 mg / kg）を、ケタミン（95 mg / kgの）、およびキシラジン（10 mg / kg体重）]を。
- ピンチのつま先および/または動物が適切に麻酔かどうかを判断するために眼瞼反射を（点滅して観察するために綿棒で上まぶたを触れる）を使用します。角膜は、手術前に人工涙液軟膏を適用することによって保護する必要があります。
- 電気かみそりで髪をバックシェーブ（アタッチが不要）。動物の背中の真ん中に耳にわずかに吻側からひげをそる。よくひげをそる、と切開に入る毛を防ぐために皮膚からカット毛を取り除く。手術準備、手術が1本のほつれ毛と手術部位の汚染を避けるために実行される領域から離れて行ってください。
- Povidine -ヨウ素消毒液とガーゼを浸し、そして剃毛面積の皮膚に適用されます。手術部位は、周辺に向かって、サイトの中心からスクラブに注意しながら、Povidine - ヨウ素溶液を少なくとも二回スクラブしてください。サイトは、その後70％アルコールまたは希釈殺菌スクラブで洗浄することができます。面積は、滅菌ドレープで覆われるべきである。
- 手術を通して、加熱パッドを使用すること私sは非常に動物の正常な体温を維持することをお勧めします。さらに、体温を監視する必要があります。ロールガーゼのパッドの上に置いて動物。成体ラットの場合は、ロールガーゼのパッドは厚さ〜1.0インチと〜6.0インチの長さにしてください。手術のボードへのテープ、このパッドが移動しないように。胸/肩のレベルでのパッドの上に置いて動物。手術のボードへの武器ダウンパッドの腕、およびテープの両方を伸ばし。アイデアは最高ので、頚髄が深い皮膚の表面の下に発見されたので、手術中に動作することが容易であることを頸部脊髄を支えるためです。
手術：
- 最低の顕微鏡の倍率（我々は8 ×の倍率を使用）で、正中切開をする手術用メスの刃を使用してください。 （切り込みを入れるために皮膚が容易になります）肌をピンと張るようにもう片方の手で横方向に皮膚を伸ばして、肩甲骨に頭蓋底から切開を行います。 （ 図 1を参照 ）
- 脊柱比3の筋層を介して切開をする手術用メスの刃を使用してください。少し他の手で両側の筋肉を（外側から内側へ）スクイズ。筋肉の切開は、手術の終わりを容易に縫合なりますれ、ギザギザにならないよう、可能な限り削減数が最も少ないのすべての筋肉の層を削減するためにメスでしっかりと十分に押してください。しかし、深部組織の損傷（脊柱）の作成を防ぐには余りにも強く押さないでください。
- two綿棒のアプリケーターで、傍脊柱筋から覆う筋肉を分離するためにねじる運動を使用してください。一つは、ここで活発になることができます。これは、出血の原因になりますので、切り取ったり破れしないでください。アプリケーターでモーションをねじるとうまく損傷や出血を引き起こすことなく離れて組織をいじめるなります。出血は手術のいずれかの段階で発生した場合、それは患者であることが最善です。血液は、手術野のビジョンをあいまいにするため、出血の多くを進めて急いでしようとしないでください。焼灼または光の圧力は、出血の部位に適用するが、我々はその忍耐が最善であることを発見することができます。練習すれば、この手術を通じてほとんど、あるいは全く出血があるはずです。
- 4自家製リトラクター（図2を参照）で筋肉を引っ込めます。これらのリトラクターはトラクターに整形丈夫なペーパークリップ（ 図 2挿入図参照 ）で行うことができます。手術前にこれらをオートクレーブ。ケアは、組織の損傷を避けるために、トラクターの平滑末端に注意する必要があります。リトラクターへの文字列を接続します。露出は、長方形の形をした/正方形でなければなりません。この形状は、4リトラクターを使用して4コーナーに引いて、達成することができます。ボードへのテープの文字列リトラクターを確保するために（ 図 2を参照 ）。市販のリトラクターを使用しても、私たちはこれらを使用しないようにした方がよいことができる。それは明らかに手術を通じて確認するために、良好な手術野を作成することが重要です。 "盲目的"に沿って継続しないでください。
- 脊柱の背側表面から傍脊柱筋をクリアします。脊柱の背側表面に傍脊柱筋に対処するための、2潜在的な戦略があります。最初の戦略では、椎骨の背側表面から傍脊柱筋を除去するため、ラット、歯鉗子と中型春のはさみを使用してください。よりよい骨表面を露出させる骨に非常に近いカットを作ってみる。脊椎の表面に平行カットを作成しますが、コードに伐採しないでください。第二のアプローチの場合は、パラ - 棘筋の正中切開を行い、小さなトラクターで横方向に後退。第2のアプローチでは、筋肉は、手術後に戻って一緒に縫合することができます。
- よく脊椎骨の表面を清掃してください。レベルはC4、C5とC6（ 図 3 参照 ）から筋肉を引き離し骨鉗子（最も重要な手術器具）を使用してください。これは、もちろん、ターゲットとされている脊髄のレベルに依存します。片手で骨鉗子を使用しながら、一方でラット、歯鉗子とC2のプロセスを介して筋肉をつかんで全体脊柱を固定します。 C2は、手術野の大吻側プロセスです。 C3は、同様にわずかに筋肉の下にあります。彼らはそれらを少し筋肉を覆っているため、C4、C5とC6は、簡単にアクセスできます。
- C5の椎弓切除で始まります。再び、ラット、歯鉗子でC2を保持することによってセキュアな。骨鉗子で：全体ラミナ（正中線近くにグラブの図を参照）をつかむ。位置の骨鉗子ように、そのツールは、脊柱の軸に完全に垂直である。徐々に板をつぶす。これは脊髄組織への損傷を引き起こすので、脊髄への下に押さないでください。クラッシュと静かに骨の上方の破片を引き出します。一つ簡単に削除する引き離すことができるように骨鉗子は、一部を粉砕してください。骨の部分がまだラミナの残りの部分に接続されている場合、これは脊髄に出血し、事故の原因となりますので、引っ張ることはありません。骨鉗子は、クリーンでシャープにする必要があります。このような骨鉗子のような楽器が（ 図 4を参照 ）無菌ボウルで提供することができる無菌生理食塩水で洗浄後、/拭き取ってください。
骨鉗子perpenの位置決め椎弓切除の初期オープニング、用脊柱にdicularが望ましい。このステップは、脊髄の表面に対して約30〜60度の角度で骨の下にそっと骨鉗子を挿入することで椎弓切除を拡張する小さな"ニブル"を取ることによって続けることができます。 - C4 - C6ラミナのすべてに椎弓切除を拡張。 three脊髄のレベル以上の骨の1つの連続した開口部を作成します。椎弓切除の範囲は、髄腔内注射の目的の場所（複数可）に基づいて調整することができます。
- これは、出血の原因になりますので、遠く横方向に椎弓切除を延長しないでください。前角をターゲットにするために、注射部位は比較的内側なので、これまで横方向に椎弓切除を拡張する必要はありません。 （ 図 5を参照 ）
- 〜15 xに倍率を増加させる
- ＃5のストレート/シャープなピンセットを用い、硬膜の上に結合組織を（および可能な乾燥血液）拭き取ります。結合組織と硬膜の間の違いは、経験と学習する必要があります。
- 切り込みを入れる硬膜、ミニ春のはさみまたはmicroknifeのどちらかで非常にタフな髄膜層、。背根のエントリーゾーンにちょうど内側脊柱の軸に平行な切開を加えます。これは、1つは、前角をターゲットにすることができます。 （ 図 6を参照 ）
- グラブとわずかに脊髄の硬膜をリフトオフ＃5のストレート/鋭いピンセットを使用してください。ピンチ/脊髄を傷つけるしないでください。これはいくつかの練習が必要です。 microknifeまたは非常に小さな春のはさみで切開を加えます。脊髄を損傷しないでください。
- 吻側 - 尾側軸にわずかに切開を延長する。硬膜の緊張はやや硬膜は脊髄の素敵な露出を作成するために分離します。
- それぞれの目的の注射のためのすべての適切な部位で切開を加えます。脊髄の表面が明るく白い色の外観を持っている間、硬膜は、かすんでいる半透明の外観を持っています。一つは、離れて、これらを区別するために学ぶ必要があるでしょう。それは、注射針で硬膜を介して注入しようとするのではないことをお勧めします。それはそれを通して穴を開けることは困難になるように硬膜が、厳しいです。さらに、硬膜を介してピアスは針の挿入の軌道に影響を与えることができるため、細胞の解剖学的標的化遺伝子導入に影響を与えます。
- 子宮頸拡大の大きな領域をターゲットとする3段階（合計6拠点）での二国間で細胞を注入する。注射の数と位置（s）は、もちろん、特定の実験によります。
- ピアス硬膜後、脳脊髄液が流れ出すだろう。コードとガーゼや綿棒で全体のエクスポージャーの乾燥した表面。
- 細胞の注入のために、10.0μLハミルトン気密RNシリンジを使用してください。
- 33ゲージ/ 45度の面取り金属RNハミルトンの針を取り付けます。針はシャープになります。のみ〜20注射（針が少ない注射とシャープになる）に同じ針を使用してください。一つは、また針のために引っ張らガラス毛細管を使用することができます。 26ゲージの鈍ハミルトンの金属針に引っ張らガラスチップを添付するエポキシ樹脂を使用してください。手術用顕微鏡とマイクロメーターのスライドを使用して：〜75.0から100.0μL（一注入の過程で細胞に損傷を与えることを希望しない細胞の直径に応じて）に、外側先端径をトリム。我々は、33ゲージの金属針を好む。
- 細胞は氷上でエッペンドルフチューブの内部に容易に懸濁液から分類されます。注射器をロードするために細胞が懸濁液中に戻ってまで、直前に、軽くチューブをタップします。あまりにも激しく、これが細胞および/または原因の泡を傷つけるのでフリックしないでください。また、穏やかに細胞を混在させる20.0μLピペット- MANを使用します。ピペットの細胞懸濁液のみ1〜2回上下。
- 唯一の注射部位に十分な細胞懸濁液の体積をロードします。 one計画は複数の注射を行う場合、細胞は、注射器内部の懸濁液から分類されます。徐々に気泡及び/または細胞の損傷を避けるために、注射器に細胞を取る。特に我々の研究室で操作するグリア前駆細胞のために、我々は2-5分以上1.0μL当たり50,000-75,000細胞の希釈で細胞懸濁液2.0μLを注入する。我々は2uL/siteは頚髄の組織損傷が発生しないことを発見した。脊髄実質に損傷を与える可能性があります：その代わり、私たちの経験は大きく（直径で10.0 -20.0μmの彼らは私たちのグリア前駆細胞よりもサイズが大きい場合は特に）このボリュームで細胞数を増加させることを示唆している。我々は（少なくとも無傷の子宮頸脊髄内）各サイトで注入する細胞の最適な数値を決定するために広範な細胞の投与実験を行った。パラメータは、特定の細胞型と疾患の状態に決定する必要があります。
- 適切に必要な解剖学的領域を対象とする脊柱の軸を持つ注射器/注射針パラレルラインアップ。針は手術範囲の頭をぶつけたりしないように（手術台に対して約80度）だけで十分な角度が、できるだけ90度に近くなる。顕微鏡を使用して、脊髄の背側の面に向かって下側の先端（図7を参照）。
- エントリZOにちょうど内側針を目指しています背根のNE（ 図 8を参照 ）。ゆっくりと針の先端と脊髄の表面には触れない。わずかに針で脊髄を押し下げる。脊髄が正常に戻ってになるまでニードルを引き戻します。 z = 0.0とマイクロマニピュレータの定規を使用するなど、この位置を記録します。
注：私たちは日常的に頚髄の注射時に脊柱を安定していない。私たちの麻酔薬レジメンを使用して、重い呼吸に起因する子宮頸脊髄の上下運動は、問題をされたことがない。しかし、重い呼吸が問題であれば、脊柱は、脊椎骨の粉砕や傷つけないように注意しながら、ゆっくりと骨をクランプし、修正された鉗子を使用してレベルC2とC7でパラ棘筋を囲むことによってカスタマイズされたフレームを使用して安定させることができる脊髄組織の基礎となる。動物の呼吸が手順の間に浅いになれば、より多くの麻酔薬を提供する必要があります。麻酔の外科的平面を再開する前に、再び達成されるまで手術は中断されるべきである。 - 脊髄への若干低い針。これを行う間、顕微鏡で見て確認してください。成体ラットでは前角をターゲットに1.5mmの深さまで下針。成体マウスの腹側ホーンをターゲットに0.75mmの深さまで下針。 （ 図 9を参照 ）。これらの深さの数値は、（少なくとも3ヶ月齢）雌雄のSprague - Dawleyラット（250〜450グラム）とC57BL / 6マウス（20-35グラム）、成人の代表的なものである。もちろん、深さと横方向の位置は、関心の特定の領域に依存する。針が脊髄組織への損傷を避けるために、脊髄に挿入されている間噴射装置/手術ボードまたは手術のテーブルを邪魔しないでください。
- 注射の前に所望の深さまで針を下げて2分（長くても良いです）を待ちます。
- ポンプのコントローラを使用して一定の速度で2-5分にわたって2.0μLを注入する。
- 徐々に脊髄から針を取り外す前に、注射後2分（長い方がよい）を待ちます。
- それぞれの注入後にdH2Oで清潔なシリンジ目詰まりを防止するため。ゆっくり描くと3-5倍を追放する。注射器に空気を描画しないでください。
- 最低倍率（：〜8 ×手術の開始時に使用したのと同じ）に戻ります。縫合硬膜は、9から0縫合糸を使用してクローズしますが、これは間違いなく必要ありません。それも困難です。我々は、硬膜は、過去に閉鎖縫合し、私たちは、動物行動、移植の生存率や硬膜を縫合糸で閉じられていない脊髄の組織学的に差は見られない。硬膜は、無菌のゲル泡の保護シートでカバーすることができます。ゲルの発泡体は、硬膜切開部位の上に直接配置する必要があります。しかし、gelfoamは時々しっかりと脊髄の表面に付着することができるように急激に、後の血流清中に脊髄の表面のgelfoamのこの部分をオフに引っ張っていないの世話をすることが重要です。
- オプション：縫合糸傍脊柱筋は4から0縫合糸で閉じた。
- 縫合糸は4から0縫合糸で一度に3を覆う筋肉の層を閉じた。吻側-尾側軸に3カ所縫合糸の筋肉（ 図 10を参照 ）。
- ステープル皮膚は、9.0 mmの傷のクリップ（ 図 11を参照 ）で閉じる。完全な創傷治癒する前にステープルをオフに引っ張ってから動物を防ぐために、針ホルダーとのステープルを締めます。離れてスペースステープルは約0.5センチメートル。これは治癒障害と壊死につながることができるように、創傷クリップを締めすぎないでください。
- 浸したガーゼで領域に傷をPovidine -ヨウ素消毒液を適用します。
- 動物は、暖かい水のパッドを循環に回復することができます。すぐに手術後、滅菌乳酸リンゲル液（マウスの場合は0.5 mLをラットは5.0 mL）中の皮下注射をする。動物は、脱水および/または物憂げなが表示された場合、フォローアップの注射も提供することができます。セファゾリンの6.0mg/kgを使用して予防的抗生物質治療を使用することができますが、私たちの経験では、無菌操作が続いている、すべての楽器/外科用品を滅菌する場合は、この移植の手順は、外科手術後の感染症が発生しないことを示唆している。これらの処置がとられている場合、抗生物質投与が推奨されていません。
- 犠牲になるまでCSAまたはFK-506/Rapamycin毎日を続ける。
- 全体の手術は約45分（6注射部位を有する）未満を取る必要があります。そうでなければ、動物に悪影響を脊髄に注入影響を与えることが予想される、目を覚ますと、より大きく呼吸を開始します。
プロトコルのさまざまなステップに関連した問題のトラブルシューティングのヒント
/悪い細胞の生存の欠如：これはおそらく注射に関連する技術的な問題ではないが、おそらくおよび/ またはimmunesuppressionのレジメンに注入される細胞型の性質によるもの。これらの問題は経験的に細胞型および動物モデルの特定の基準で評価する必要があります。免疫不全ラットおよびマウスモデルの数の可用性またimmunesuppressionの問題を回避するために使用できますが、これらの動物はまた、コスト、コロニーを維持する必要性、そして手術とハウジングの間に必要な追加の注意などの困難を提示する。
機能障害は手術後に観察：も6注射部位で、そのような前肢と後肢の握力と横隔神経/横隔膜化合物の筋活動電位のような措置によって評価した場合、我々の経験では、我々は、この手順は、次のいずれかの機能障害の発生を認めていない（頚髄の各2μlの）の。組織破壊も観察されていません。これらの問題の発生の考えられる理由は以下のとおりです（このような＃5を使用してコードを挟まないように硬膜を削減しながらより大きなボリューム及び/または細胞数、不適切な椎弓切除に起因する誤損傷、繊細さの欠如を注入し、提案された針のゲージを使用していない鉗子）または脊髄（鈍い針を交換する）にハミルトンの針を挿入する過程で。
細胞は腹側灰白質内に見つかりませんでした：これは、多くの問題が原因である可能性があります。注射が内側または横方向にターゲットを逃した場合、適切に脊髄の軸と噴射システムの並列を整列、および背側根のエントリにだけ内側に針を挿入してください。注射は、背側または腹側にターゲットを逃した場合、針の先端がかろうじて脊髄の背側表面に触れるときに、適切なベベル（長いベベルと提案ハミルトンの針を使用してz軸の測定値をゼロにすることを確認してください）をターゲットに影響を与えること、脊髄に針を挿入する際、圧縮正確にマイクロマニピュレーターを用いて深さを測定する際に世話をする、と提案された重量の範囲内で動物を使用しないことを保証する。 （組織学的評価とその後の技術の変更を必要とする）は一貫して場所に細胞を注入している場合はそれに応じて手法を調整します。注射がランダムに注射部位のすべてに分散している場合は、一貫性を向上させるために練習する必要があります。細胞が針のトラックに沿って脊髄の背側面に主に配置する傾向がある場合、細胞の注入の前後に長く待って、そして時間の長い期間にわたって、実際の注入を拡張。
4。代表的な結果：
マウス由来のグリア前駆細胞は成人SOD1 G93Aのラットの脊髄レベルのC4の前角に（50,000細胞/サイト）を移植した。マウス由来の移植細胞は、マウス特異的抗体、M2で検出を介してホストラットの組織と区別することができる。この画像は、1ヶ月後の移植ではM2 +移植由来細胞（ 図12を 参照 ）の生存率を示しています。細胞は腹側灰白質に局在し、しかし、注射部位は、内側に（ほとんど横隔運動ニューロンの位置：点線で示される）外側腹側ホーンを逃した。いいえ嚢胞形成は、50,000個の細胞がサイトごとに注射されたときに見たことがない、とは行動障害は、注入の手順に起因されていません。しかし、細胞のはるかに高い数値（実際の数は細胞の種類に応じて異なります、そして体系的に評価されるべきである）注射部位の損傷で、ニードルトラックに沿ってその結果（ 図13を 参照してください ：アストロサイトマーカーと免疫組織化学、GFAP）の注入。
図1。皮膚の最初の切開は、最も低い顕微鏡の倍率では（我々は8 ×の 倍率を使用）、正中切開をする手術用メスの刃を使用してください。 （カットする肌が容易になります）肌をピンと張るように、そして肩甲骨に頭蓋底（耳の裏のレベルで）から（太い点線で示される）切開を行うために他の手で横方向に皮膚を伸ばすには（示さ細い点線で）。
図2。手術野の露出。外科的露出は、長方形の形をした/正方形でなければなりません。この形状は、4リトラクターを使用して4コーナーに向かって周囲の筋肉を引っ張ることによって達成することができます。リトラクターを確保し、適切にフィールドを開いたままにするために外科手術ボードにリトラクターに接続されたテープの文字列。
図2挿入図。手術野の露出のためのトラクター。リトラクターは、手術を行うために脊髄の明確な可視性と十分なスペースの両方で手術野を作成するために筋肉を引き戻すために使用されます。リトラクターは、所望の形状と大きさに丈夫なペーパークリップを形成することによって行うことができます。手術の前にリトラクターをオートクレーブ。リトラクターへの文字列を接続します。
図3。傍脊柱筋の椎骨。除去後、骨鉗子で脊椎骨の十分にクリーンな背面。個々のラミナが見られるだけでなく、背根は、脊柱の外側面から入ることができます。
図4。椎弓切除。脊髄レベルC5で椎弓切除を開始します。ラット歯鉗子で筋肉を覆うレベルC2を保持することにより脊柱を固定します。骨鉗子で：全体ラミナ（正中線近くにグラブの図を参照）をつかむ。位置の骨鉗子ように、そのツールは、脊柱の軸に完全に垂直である。徐々に板をつぶす。これは脊髄組織への損傷を引き起こすので、脊髄への下に押さないでください。クラッシュと静かに骨の上方の破片を引き出します。一つ簡単に削除する引き離すことができるように骨鉗子は、一部を粉砕してください。骨の部分がまだラミナの残りの部分に接続されている場合、これは脊髄に出血し、事故の原因となりますので、引っ張ることはありません。骨鉗子は、クリーンでシャープにする必要があります。
図5。椎弓切除以下の脊髄組織の露出は。C4 - C6脊髄の全てを公開する椎弓切除を拡張。 3脊髄のレベル以上の骨の連続は1つの開口部を作る。これは、出血の原因になりますので、遠く横方向に椎弓切除を延長しないでください。前角をターゲットにするために、注射部位は比較的内側なので、椎体骨の完全な横方向の範囲で椎弓切除を拡張する必要はありません。
図6。脊髄の背側表面の高倍率。著名な背血管が脊髄の正中線を走る見ることができます。この血管のパターンはほとんどの症例で観察されていますが、いくつかの動物は血管の非正中線軌道が表示されます。背側根は、脊髄の背側の面の横方向の側面を見ることができます。脊髄を覆う硬膜と比較して、これらの神経がかすむ。
図7。インジェクションのセットアップ。正しく目的の解剖学的領域を対象とする脊柱の軸を持つ注射器/注射針平行アップライン。針は手術範囲の頭をぶつけたりしないように（手術台に対して約80度）だけで十分な角度が、脊髄背側表面に向かって可能な限り（左パネル）と同じくらい近くに90度。低い注入チップが使用されている顕微鏡（右パネル）。ゆっくりと針の先端と脊髄の表面には触れない。わずかに針でコードを押し下げる。脊髄は、通常のフラットな状態に戻るまで、ニードルを引き戻します。 z = 0.0とマイクロマニピュレータの定規を使用するなど、この位置を記録します。
図8。脊髄注入の高倍率は、背根（点線で示される）のエントリのゾーンに針がちょうど内側に向けます。
図9。脊髄の図：どのように関心の解剖学的領域を対象とする前角、背根のエントリーゾーンにちょうど内側脊柱の軸に彫刻する硬膜に平行をターゲットにしようと。。これは、1つは、前角をターゲットにすることができます。 （動物の年齢と性別くらいの深さでの違いのを確認していません）成体ラットに前角をターゲットに1.5mmの深さまで下針。成体マウスの腹側ホーンをターゲットに0.75mmの深さまで下針。もちろん、深さと横方向の位置は、関心の特定の領域に依存する。
図10。手術部位の閉鎖。縫合糸は4から0縫合糸で一度に3を覆う筋肉の層を閉じた。吻側 - 尾側軸に3ヶ所に筋肉を縫合。
図11。皮膚のステープル。ステープル皮膚は、9.0 mmの創傷クリップで閉じ。完全な創傷治癒する前にステープルをオフに引っ張ってから動物を防ぐために、針ホルダーとのステープルを締めます。離れてスペースステープルは約0.5mm。
図12。子宮頸部前角へのグリア前駆細胞の移植50,000マウス由来のグリア前駆細胞は、SOD1 G93Aのラットにおける脊髄レベルのC4の前角に移植した。 M2 +マウス由来の移植細胞は、1ヶ月後の移植で生き残った。腹側灰白質に局在する細胞が、注射部位は、内側外側腹側ホーンを（表記ミス点線で）。
図13。神経前駆細胞の高い数値の移植後の組織損傷。細胞の非常に高い数字のインジェクション（実際の数は細胞の種類によって異なりますし、体系的に評価されるべきである）注射部位と針のトラックに沿って損傷につながる。
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Discussion
SOD1 G93Aマウスとラットを対象とした研究のため、年齢やグループ内での動物の性別と一致し、異なるグループに同じゴミの中で動物を配布する。それは、病気のプロセスは、男性と女性の間で異なる可能性があるため、ALSとSCIモデルの両方で同じ性別からすべての動物を用いることが好ましいが、それはまた可能性特異的な効果を検出するために、両性から十分な動物があると便利かもしれない、としてこの現象は、SOD1 G93Aのラット13とSOD1 G93Aマウス14,15で報告されています。動物への細胞の移植の年齢/疾患のポイント（ALSの動物の場合）または時間後の損傷を（SCIモデルの場合）を検討してください。この戦略は、可能性が対処されている特定の細胞のメカニズムによって異なります。
プロトコルは、ここで説明ラットとマウスの子宮頸脊髄11日だけでなく、胸部と腰部のレベル14としてラットやマウスの脊髄の他のレベルへの移植のための両方に使用できます。これらの様々な脊髄のレベルで特定の解剖学的構造（前角以外）をターゲットにするために、それは最初の座標の精度を評価するために染料またはその他の手段を用いて注射の内側/外側の位置と深さをテストすることをお勧めします。
アウトカム指標は、移植の場所に関連する細胞移植の運命の詳細な分析、生化学的、組織学的、および脊髄の機能状態、および行動の変化などがあります。動作試験、組織学的解析と移植後、分析その他のアウトカム指標の仕様は、実験的なニーズ/モデルに合わせて調整されるべきである。
動物を"オープン"と"クローズ"、剃る、麻酔手術の助手を持つことは、できるだけスムーズに、ほとんどの動物を介して取得するための非常に便利です。さらに、外科助手はプロシージャ全体で滅菌を維持する外科医を助けることができる。
注入された細胞の最適な数と濃度は、細胞の大きさ、レシピエント動物の種、及び疾患の状態によって異なります。空洞は、すでに16を形成している場合、例えば、無傷の脊髄に比べて、細胞数の増加は、SCIのサイトに配信することができます。しかし、特定のパラメータは、体系的に大規模な調査を実施する前に最適化される必要がある。
特定のNPCのタイプを持つ大規模な調査を実施する前に、免疫抑制療法の長期的な有効性を評価する。さらに、細胞の生存は、疾患モデルや移植のタイミングと場所に応じて特定のセルのタイプによって異なる場合があります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
私は感謝したい：ルポールのすべてのメンバー、Maragakisと役に立つ議論のためのロススタインラボ、アメリカと資金調達のためのクレイグH.ニールセン財団の麻痺した退役軍人。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| 0.05% Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor (optional) | Sigma-Aldrich | T-6522 | |
| Acepromazine maleate (0.7 mg/kg) | Fermenta Animal Health | ||
| Ketamine (95 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | ||
| Xylazine (10 mg/kg) | Bayer AG | ||
| #11 Feather surgical blade | Electron Microscopy Sciences | 72044-11 | |
| Cotton-tipped applicators (6 inch) | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Rat-toothed forceps | Fine Science Tools | Rat: 11023-15; Mouse: 11042-08 | |
| Medium-sized spring scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| Mini spring scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | Rat: 16121-14; Mouse: 16221-14 | |
| Microknife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 12502-14 | |
| Suture: 4-0 | Vicryl | S-183 | |
| Staples: 9 mm | Autoclip | 427631 | |
| Stapler: 9 mm (Reflex #203-1000) | World Precision Instruments, Inc. | 5000344 | |
| Warm water pump (T/Pump) | Gaymar Industries | P/N 07999-000 | |
| Cyclosporin A: 250.0 mg/5.0 mL ampules | Novartis AG | NDC 0078-0109-01 | |
| FK-506 | LC Laboratories | F-4900 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| Injector | World Precision Instruments, Inc. | UMP2 | |
| Micro 4 Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMC4 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Kite-R | |
| 10.0 μL Hamilton syringe | Hamilton Co | 80030 | |
| Hamilton needles: 33-gauge, 45° bevel, 1 inch | Hamilton Co | 7803-05 | |
| Glass 20.0 μL microcapillary pipettes (optional) | Kimble Chase | 71900-20 |
References
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