Summary
Neural föregångare transplantation är en lovande strategi för att skydda och / eller ersätta förlorade / dysfunktionella livmoderhalscancer phrenic motoriska nervceller i ryggmärgsskada (SCI) och motorn neuron sjukdom, amyotrofisk laterals skleros (ALS). Vi erbjuder ett protokoll för cell leverans till livmoderhalsen ryggmärgen ventrala horn i gnagarmodeller av ALS och SCI.
Abstract
Respiratoriska problem på grund av phrenic motorneuron förlust är ett försvagande följd av en stor del av mänsklig traumatisk ryggmärgsskada (SCI) fall 1 och är den ultimata dödsorsaken hos patienter med motor neuron sjukdom, amyotrofisk laterals skleros (ALS) 2.
ALS är en förödande neurologisk sjukdom som kännetecknas av relativt snabb degeneration av övre och nedre nervceller motor. Patienter i slutändan ge efter för sjukdomen i genomsnitt 2-5 år efter diagnos på grund av andningsförlamning grund av förlust av phrenic motorneuron innnervation av membranet 3. De allra flesta fall är sporadiska, medan 10% är av familjär form. Cirka tjugo procent av familjär fallen är kopplade till olika punktmutationer i Cu / Zn superoxiddismutas 1 (SOD1) genen på kromosom 21 4. Transgena möss 4,5 och råttor 6 bär muterade humant SOD1 gener (G93A, G37R, G86R, G85R) har genererats, och trots förekomsten av andra djurmodeller av motoriska neuron förlust, är för närvarande de mest använda modellerna av sjukdomen .
Ryggmärgsskada (SCI) är en heterogen uppsättning villkor efter fysiskt trauma till ryggmärgen, med funktionella resultatet varierar beroende på typ, läge och svårighetsgrad av skadan 7. Trots ungefär hälften av mänskliga SCI fall påverka livmoderhalscancer regionerna, vilket resulterar i försvagande respiratorisk dysfunktion på grund av phrenic motorneuron förlust och skada för fallande bulbospinal andningsorganen axoner 1. Ett antal djurmodeller av SCI har utvecklats, med de mest använda och kliniskt relevant att vara kontusion 8.
Transplantation av olika klasser av neurala föregångare celler (NPC) är en lovande terapeutisk strategi för behandling av traumatiska CNS-skador och neurodegeneration, inklusive ALS och SCI, på grund av möjligheten att ersätta förlorade eller dysfunktionella CNS celltyper, ge neuroprotektion och leverera genen faktorer av intresse 9.
Djurmodeller för både ALS och SCI kan modellera många kliniskt relevanta aspekter av dessa sjukdomar, inklusive phrenic motorneuron förlust och därmed respiratoriska problem 10,11. För att utvärdera effekten av NPC-baserade strategier för lungfunktion hos dessa djurmodeller av ALS och SCI, måste cellulära interventioner vara specifikt riktad till regioner som innehåller terapeutiskt relevanta mål som phrenic motoriska nervceller. Vi erbjuder ett detaljerat protokoll för flera segmentell, intraspinal transplantation av NPCs i livmoderhalsen ryggmärgen ventrala grå fråga om neurodegenerativa modeller såsom SOD1 G93A möss och råttor, samt ryggmärgsskadade råttor och möss 11.
Protocol
Metoder
1. Cellberedningen
Som exempel kommer vi att beskriva förfarandet för att förbereda gliaceller stamceller 12 för transplantation på grund av vår erfarenhet av denna celltyp. Dock kommer de närmare detaljerna i protokollet, inklusive medelstora och användning av trypsin till exempel beror på de särskilda celltyp som används för transplantation.
- Pre-varmt alla lösningar till 37,0 ° C i vattenbad.
- Skölj kolven 2X med HBSS. Tillsätt 5,0 mL/T-75 kolv med 0,05% Trypsin / EDTA. Inkubera kolv i 3 minuter i 37,0 ° C inkubator. Mal sönder 3X försiktigt i kolven med 5 eller 10mL pipett.
Tillval: Lägg 5,0 mL/T-75 kolv på 1,0 mg / ml soja trypsininhibitorerna i DMEM/F12.
- Skölj varje kolv 2X i 5,0 ml av medium. Pool celler och sköljningar. Håll celler på is för alla efterföljande steg.
- Snurra på 200-300 gi 5 minuter i koniska röret: helst i centrifugen kylas till 4 ° C. Dekantera (och spara) supernatanten. Återsuspendera cellerna i 1,0 ml medium, och transport till 1,5 ml Eppendorf-rör.
- Räkna celler med hemocytometer använda Trypan Blå för att bestämma lönsamheten.
- Snurra igen i 1,5 ml tub (800 RPM i 10 minuter: helst i centrifugen kyls ned till 4 ° C). Dekantera (och spara) supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i önskad slutliga volymen av medium för att uppnå lämplig cell densitet.
- Fördela cellsuspensioner till flera 1,5 ml Eppendorf-rör. Håll celler på våt is tills transplantation.
Använd inte 0,75 mL rör, som Hamilton sprutan / nålen inte kan passa djupt in i denna tub. Flera injektioner kommer sannolikt att göras under operationen sessioner, och man vill inte störa samma rör av celler många gånger. Försök att förbereda minst 50% mer volym cellsuspension än nödvändigt. Håll celler på is under hela operationen sessionen. Transplant celler inom 4-5 timmar att förbereda cellsuspensioner för att säkerställa största livskraften i cellerna efter transplantation.
2. Förberedelser före operation
- Genomföra relevanta bedömningar baslinjen beteende före operation.
- Immunsystemet: subkutan cyklosporin A (CSA: 10,0 mg / kg kroppsvikt) eller intraperitoneal (IP) FK-506/Rapamycin (1,0 mg / kg kroppsvikt) bör inledas minst 3 dagar före transplantation och bör ges dagligen tills offer. Administration i dricksvattnet (i stället för dagliga injektioner) rekommenderas inte. CSA är vårt immunosuppressivt val när transplantera gnagare som härrör från celler, medan FK-506/Rapamycin är vårt val när transplantera människan härstammar celler.
- Autoklav kirurgiska instrument före operation. Förbered en snygg och ren plats att göra operationen, samt en stilren ställe att lägga verktyg. Ett glas-pärla autoklav är också användbart. Håll alla verktyg ren (speciellt rongeur) under operation, eftersom detta kommer att göra förfarandet mycket lättare. Allt material som används under det kirurgiska ingreppet måste vara sterila.
- Instrument som inte kan steriliseras till exempel kirurgiska mikroskop bör torkas av med ett lämpligt desinfektionsmedel och handtagen täckt med sterilt material (t.ex. gasväv) så att kirurgen, en gång tog på sig med sterila handskar, inte förorenar hans / hennes handskar.
- Kirurgen bör tvätta hennes / hans händer med ett desinfektionsmedel (klorhexidin skrubba) innan operationen. Kirurgen kommer att bära sterila handskar, en ansiktsmask, och en ren klänning.
3. Kirurgi: Animal Förberedelser och kirurgi
Animal Prep:
- Väg djur, och administrera lämplig dos av anestesi: Isofluorane inandning eller bedövningsmedel cocktail (levereras via IP) på [acepromazin maleat (0,7 mg / kg), ketamin (95 mg / kg), och xylazin (10 mg / kg)].
- Nyp tå och / eller använda ögonlocksreflexer (röra övre ögonlocket med bomullspinne att observera blinkar) för att avgöra om djuret är ordentligt sövd. Den hornhinnor bör skyddas genom att en konstgjord riva salva före operation.
- Raka tillbaka håret med rakapparat (inga bilagor behövs). Raka från något rostralt till öron till mitten av djurets rygg. Raka väl och ta bort klipper hårstråna från huden för att förhindra att hår hamnar i snitt. Den kirurgiska prep bör utföras bort från det område där operationen ska utföras för att undvika kontamination av operationsområdet med herrelösa hår.
- Blötlägg gasväv med Povidine-Jod antiseptisk lösning, och gäller huden över rakade området. Operationsområdet skall avlägsnas minst två gånger med Povidine-jodlösning, var noga med att skrubba från centrum av platsen mot periferin. Webbplatsen kan sedan sköljas med 70% alkohol eller utspätt bakteriedödande skrubba. Området bör täckas med steril draperier.
- Under hela operationen, användning av en värmedyna is rekommenderas starkt att hålla djurets normal kroppstemperatur. Dessutom bör kroppstemperatur skall övervakas. Placera djuret på rullade kompress. För en vuxen råtta bör rullade kompress vara ~ 1,0 tum i tjocklek och ~ 6,0 inches i längd. Tejpa här pad till kirurgi ombord så att det inte rör sig. Placera djuret på block på nivå över bröstet / axeln. Sträck ut båda armarna på pad, och tejpa ner vapen till operation ombord. Tanken är att stötta den cervikala ryggmärgen upp så att det är lättare att arbeta i hela operationen eftersom livmoderhalscancer sladden finns djupt under ytan av huden.
Kirurgi:
- På den lägsta mikroskop förstoringen (vi använder 8 x förstoring), använder skalpell blad för att göra mittlinjen snitt. Stretch huden sidled med andra handen för att göra huden spänd (vilket gör att huden lättare att incisionsfilm) och göra snitt från skallens bas till skulderbladet. (Se figur 1)
- Använd skalpell blad för att göra snitt genom 3 muskellager över ryggraden. Något pressa muskeln (i sidled till mediala) på båda sidor med andra handen. Se till att trycka fast nog med skalpell för att skära alla muskler skikt med minst antal snitt som möjligt så att muskeln snitt inte blir ojämna, vilket gör suturering i slutet av operationen lättare. Men tryck inte för hårt för att förhindra att skapa skada i djupare vävnad (ryggrad).
- Med två bomullspinne applikatorer, använd vridande rörelse för att skilja överliggande muskler från paraspinal muskler. Man kan vara stark här. Skär inte eller riva, eftersom detta kommer att orsaka blödning. Vridande rörelse med applikatorer kommer fint reta vävnaden isär utan att orsaka skada eller blödning. Om blödning uppstår under något skede av operationen, är det bäst att ha tålamod. Försök inte att rusa iväg med massor av blödningar eftersom blodet skymmer vision av den kirurgiska området. Kauterisation eller lätt tryck kan tillämpas på platsen för blödningar, men vi anser att tålamod är bäst. Med lite övning bör det finnas liten eller ingen blödning under denna operation.
- Dra tillbaka muskel med 4 hemgjord upprullningsdon (se figur 2). Dessa upprullningsdon kan göras från robust gem formas till ett upprullningsdon (se Figur 2-infälld). Autoklav dessa innan operation. Försiktighet bör vidtas för att trubbiga änden av upprullningsdon att undvika vävnadsskada. Knytband till upprullningsdon. Exponeringen bör kvadrat / rektangel-formade. Denna form kan uppnås genom att dra till 4 hörn med 4 upprullningsdon. Tape sträng att gå ombord för att säkra upprullningsdon (se figur 2). Kommersiellt tillgänglig upprullningsdon kan också användas, men vi föredrar att inte använda dessa. Det är viktigt att skapa en god kirurgiska området för att tydligt se hela operationen. Inte "blint" fortsätta på.
- Klart paraspinal muskler från rygg yta ryggraden. För att hantera paraspinal muskler på rygg ytan av ryggraden, det finns två möjliga strategier. För den första strategin, använd råtta-tandad pincett och medelstora sax våren för att ta bort paraspinal muskler från rygg yta kotor. Försök att göra nedskärningar mycket nära till ben för att bättre exponera benytan. Gör snitt parallellt med ytan av kotor, men skär inte ner i sladden. För den andra metoden, gör en mittlinje snitt i para-spinal muskel, och tillbaka i sidled med mindre upprullningsdon. I den andra metoden, kan muskeln sedan sys ihop efter operationen.
- Ren yta för vertebrala ben väl. Använd rongeur (den viktigaste kirurgiska instrument) att dra bort muskler från nivåerna C4, C5 och C6 (se figur 3). Detta, naturligtvis, beror på spinal nivåer som är riktade. När du använder rongeur med en hand, säkert hela ryggraden genom att greppa muskeln över C2 process med råtta-tandad pincetten i andra hand. C2 är den stora rostralt processen i kirurgiska området. C3 är något under muskeln också. C4, C5 och C6 är lätta att komma åt eftersom de har lite muskler överliggande dem.
- Börja med laminektomi C5. Återigen, säkra genom att hålla C2 med råttan tandad pincett. Ta hela lamina (se diagram: grab nära mittlinjen) med rongeur. Placera rongeur så att verktyget är helt vinkelrät mot axeln av ryggraden. Sakta krossa lamina. Tryck inte ner i ryggmärgen, eftersom detta kommer att orsaka skador på ryggraden vävnad. Krossa och dra försiktigt brutna benbit uppåt. Rongeur ska krossa bit så att man lätt kan dra iväg för att ta bort. Om benbit är fortfarande knuten till resten av lamina, gör ryck inte som detta kommer att orsaka blödning och eventuella skador på ryggmärgen. Rongeur ska vara rena och skarpa. Instrument såsom rongeur bör tvättas / torkas med steril koksaltlösning, som kan ges i en steril skål (se Figur 4).
För det första öppnandet av laminektomi, placera rongeur vinkelrätdicular att ryggraden är att föredra. Detta steg kan sedan följas av att ta små "tilltugg" att förlänga laminektomi genom att föra in rongeur försiktigt under benet med en cirka 30-60 graders vinkel i förhållande till sladden ytan. - Utöka laminektomi till alla C4-C6 lameller. Gör en kontinuerlig öppning i benet över tre spinal nivåer. Omfattningen av laminektomi kan justeras baserat på önskad plats (er) intraspinal injektion.
- Förläng inte laminektomi för långt i sidled eftersom det kommer att orsaka blödning. För att rikta ventrala horn, är injektionsstället relativt mediala, så det är onödigt att förlänga laminektomi långt i sidled. (Se figur 5)
- Öka förstoringen till ~ 15 x.
- Torka bort bindväv (och eventuellt torkat blod) på toppen av dura med vassa / rak # 5 pincett. Skillnaden mellan bindväv och dura måste läras med erfarenhet.
- Incise duran, ett mycket tufft meningeal lager med antingen mini-fjäder sax eller microknife. Gör snitt parallellt med axeln i ryggraden bara mediala till posten zon av dorsala rottrådar. Detta kommer att tillåta en att rikta den ventrala horn. (Se figur 6)
- Använd skarpa / rak # 5 pincett för att fånga och något lyft dura bort av ryggmärgen. Kläm inte / skada ryggmärgen. Detta tar lite träning. Gör snitt med microknife eller mycket liten fjäder sax. Inte skada ryggmärgen.
- Utöka snittet något rostralt-caudal axeln. Tension dura kommer något separat dura för att skapa en fin exponering av ryggmärgen.
- Gör snitt på alla lämpliga platser för varje tilltänkt injektion. Dura har en disig genomskinligt utseende, medan ryggmärgen yta har en ljusare vit-färgad utseende. Man måste lära sig att skilja dessa från varandra. Det är inte tillrådligt att försöka injicera genom duran med injektionsnål. Den dura är tuff, så att det blir svårt att tränga igenom det. Dessutom kan piercing genom duran påverkar banan för nålens införande och kommer därför att påverka anatomiskt målinriktad leverans av celler.
- Injicera celler bilateralt på 3 nivåer (6 platser totalt) för att rikta stor region av livmoderhalscancer utvidgningen. Antalet och plats (er) av injektioner, naturligtvis beror på den specifika experimentet.
- Efter piercing dura kommer cerebrospinalvätska utgjuta. Torr yta sladd och hela exponeringen med kompress eller bomullspinne.
- För cell injektion, använd 10.0μL Hamilton gastäta RN spruta.
- Anslut 33-gauge / 45-graders avfasade metall RN Hamilton nål. Nålen ska vara vassa. Använd samma nål för endast ~ 20 injektioner (nålen kommer att bli skarpare med mindre injektioner). Man kan också använda dras glas kapillärrör för nålar. Använd epoxy för att fästa dras glas tips till 26-gauge trubbiga Hamilton metall nål. Trim yttre spets diameter till ~ 75,0-100,0 mikroliter (beroende på diameter på celler: en vill inte skada celler under processen för injektion) med en kirurgisk mikroskop och mikrometer bild. Vi föredrar den 33-tunnplåt nålar.
- Cellerna kommer att falla ur sin vila lätt inne i Eppendorf-rör på is. Omedelbart före lastning i injektionsspruta, knacka försiktigt rör tills cellerna gå tillbaka till suspension. Inte flick alltför intensivt som detta kommer att skada celler och / eller bubblor orsak. Du kan också använda 20.0μL pipett-mannen att blanda försiktigt celler: pipett cellsuspension bara en eller två gånger upp och ner.
- Ladda tillräcklig volym cellsuspension för bara ett injektionsställe. Cellerna kommer att falla ur sin vila inne injektionsspruta om man planerar att göra flera injektioner. Sakta ta upp celler i sprutan för att undvika bubblor och / eller skador på cellerna. Specifikt för gliaceller stamceller som vi arbetar med i vårt labb, injicera vi 2,0 mikroliter cellsuspension i en spädning på 50,000-75,000 celler per 1,0 mikroliter under 2-5 minuter. Vi har funnit att 2uL/site inte leder till vävnadsskador i hals-ryggmärgen. Istället visar vår erfarenhet att kraftigt öka antalet celler i denna volym (särskilt om de är större i storlek än vår gliaceller stamceller: 10,0 -20,0 nm i diameter) kan orsaka skador på ryggmärgen parenkymet. Vi har genomfört en omfattande experiment cell dosering för att bestämma den optimala antalet celler att injicera på varje plats (åtminstone i den intakta cervikala ryggmärgen). Parametrarna måste bestämmas för den specifika celltyp och sjukdomstillstånd.
- Rada upp spruta / nål parallellt med axeln på ryggraden att korrekt rikta önskad anatomiska regionen. Nålen är vinklad precis tillräckligt (ca 80-grader i förhållande till den kirurgiska tabellen) för att inte stöta den kirurgiska omfattning huvudet, men så nära 90 grader som möjligt. Sänk spetsen mot ryggmärgen ryggens yta med hjälp av mikroskop (se Figur 7).
- Syftet nål bara mediala för inträde zon av dorsal rottrådar (se Figur 8). Rör försiktigt ytan på ryggmärgen med spets nål. Något tryck ryggmärgen med nål. Dra tillbaka nålen tills ryggmärgen är tillbaka till det normala. Spela in denna position som z = 0,0 med linjalen på mikromanipulator.
Notera: Vi rutinmässigt inte stabilisera ryggraden under livmoderhalsen ryggmärgen injektioner. Med vår anestesimetod, har upp-och-ner rörelse livmoderhalscancer ryggmärgen på grund av tung andning aldrig varit ett problem. Men om tung andning är ett problem, kan ryggraden stabiliseras med hjälp av en anpassad ram genom att försiktigt fastspänning benet och omgivande para-spinal muskel på nivåer C2 och C7 med modifierad pincett, försiktigt så att inte krossa ryggraden ben eller skada underliggande ryggmärg. Om djuret är andningen blir ytlig under förfarandet, bör mer bedövningsmedel drog lämnas. Operationen ska avbrytas tills en kirurgisk plan av anestesi har åter uppnåtts innan du fortsätter. - Något lägre nålen i ryggmärgen. Se till att titta i mikroskop medan du gör detta. Lägre nål till ett djup av 1,5 mm för att rikta ventrala horn hos vuxna råttor. Lägre nål till ett djup av 0,75 mm för att rikta ventrala horn hos vuxna möss. (Se figur 9). Dessa djup siffror är representativa för vuxna (minst 3 månader gammal) kvinnliga och manliga Sprague-Dawley råttor (250-450 gram) och C57BL / 6 möss (20-35 gram). Naturligtvis, djup och sidoläge beror på den specifika regionen av intresse. Stör inte insprutningssystem / kirurgi ombord eller operation bord medan nål sätts in i ryggmärgen att undvika skador på ryggmärgen vävnad.
- Vänta två minuter (längre är ännu bättre) efter att ha sänkt nålen till önskat djup innan injektion.
- Injicera 2,0 mikroliter under 2-5 minuter vid konstant hastighet med hjälp av pump regulator.
- Vänta två minuter (längre är bättre) efter injektionen innan du långsamt drar ut kanylen ur ryggmärgen.
- Rengör sprutan med dH2O efter varje injektion för att förhindra igensättning. Sakta upprätta och driva ut 3-5 gånger. Dra inte in luft i sprutan.
- Återgå till minsta förstoring (samma som används i början av kirurgi: ~ 8 x). Sutur dura stängas med 9-0 suturer, men detta är definitivt inte nödvändigt. Det är också utmanande. Vi sutureras dura stängt i det förflutna, men vi finner ingen skillnad i djurens beteende, transplantation överlevnad eller ryggmärgen histologi när dura inte är stängd med sutur. Den Dura kan täckas med ett skyddande bit steril gel skum. Gelen skum bör placeras direkt ovanpå dural snitt webbplatsen. Det är dock viktigt att ta hand i att inte plötsligt att dra denna bit av gelfoam bort av ytan av ryggmärgen under post-perfusion dissekering, eftersom gelfoam kan ibland tätt ansluter sig till ryggmärgen yta.
- Tillval: Suture paraspinal muskel stängd med 4-0 sutur.
- Sutur stängt tre lager överliggande muskler på en gång med 4-0 sutur. Sutur muskler på tre platser i rostralt-caudal axeln (se figur 10).
- Staple huden försluts med 9,0 clips mm såret (se figur 11). Dra klammer med nål hållare för att hindra djuret från att dra bort häftklamrar före full sårläkning. Space häftklamrar 0.5cm ungefär isär. Dra inte åt såret klipp, eftersom detta kan leda till försämrad läkning och nekros.
- Applicera Povidine-Jod antiseptisk lösning på sårytan med indränkt gasbinda.
- Låt djuret att återhämta sig på cirkulerande varmt vatten pad. Ge subkutan injektion av steril Ringer-laktat lösning (5,0 ml för råtta, 0,5 ml för mus) direkt efter operation. Uppföljning injektioner kan också ges om djuret verkar uttorkade och / eller håglös. Profylaktisk antibiotikabehandling med 6.0mg/kg av Cefazolin kan användas, men visar vår erfarenhet att detta transplantation förfarande inte leder till postoperativa infektioner om aseptisk teknik följs och alla instrument / kirurgisk utrustning är steriliserad. Om dessa försiktighetsåtgärder följs, är antibiotika administrationen motarbetas.
- Fortsätt CSA eller FK-506/Rapamycin dagligen fram offer.
- Hela operationen bör ta mindre än ~ 45 minuter (med 6 injektionsställen). Annars kommer djuret att börja vakna upp och andas tungt, vilket kommer att inverka negativt injektion i ryggmärgen.
Felsökningstips för problem förknippade med olika steg i protokoll
Brist på / dålig cellöverlevnad: Detta är sannolikt inte en teknisk fråga i samband med injektion, men beror sannolikt på egenskaper hos den celltyp som injiceras och / eller till immunesuppression regim. Dessa frågor måste empiriskt utvärderas på ett cell-typ och djurmodell grund. Tillgången till ett antal immun-brist råtta och mus modellerfinns också att kringgå problem med immunesuppression, men dessa djur också innebära svårigheter till exempel kostnader, behovet av att upprätthålla en koloni, och extra försiktighet krävs under operation och bostäder.
Funktionell underskott observerats efter operation: I vår erfarenhet har vi inte observerade förekomsten av eventuella funktionella brister av detta förfarande vid bedömning av åtgärder såsom forelimb och bakdelen greppstyrka och phrenic nerv / membran föreningar potentialer muskelaktivitet, även med 6 injektioner webbplatser ( av 2μL vardera) i livmoderhalsen ryggmärgen. Vävnadsdestruktion har inte heller observerats. Möjliga orsaker till förekomsten av dessa problem är: att inte använda det föreslagna nål gauge, injicering större volymer och / eller cell, oavsiktliga skador orsakade av felaktigt laminektomi, avsaknad av finkänslighet och samtidigt minska dura (såsom nypa sladden med # 5 pincett) eller under processen med att föra in Hamilton nålen i ryggmärgen (byt ut en tråkig nål).
Celler som inte finns i ventrala grå materia: Detta kan bero på ett antal frågor. Om injektionen missar målet medialt eller lateralt, se till att korrekt rada upp parallellt insprutningssystemet med axeln i ryggmärgen, och stick in nålen precis mediala till posten i rygg rottrådar. Om injektionen missar målet dorsalt eller ventralt, se till att nolla dina z-axeln läsa när nålspetsen är bara knappt vidröra dorsal yta ryggmärgen, använda det föreslagna Hamilton nål med lämplig avfasning (en längre avfasning kan påverka inriktning), se till att ryggmärgen inte komprimeras när du sätter nålen, ta hand precis mäta djupet med mikromanipulator och använda djur inom det föreslagna viktgränserna. Justera din teknik sätt om du är konsekvent att injicera cellerna i en plats (som kräver histologiska utvärdering och efterföljande teknik modifiering). Om injektioner är slumpmässigt utspridda på alla dina injektionsställen, måste du träna för att förbättra konsistens. Om cellerna tenderar att ligga mest på rygg aspekt av ryggmärgen längs nålen banan, vänta längre innan och efter cellen injektion, och utöka den verkliga injektion under en längre tid.
4. Representativa resultat:
Mus-derived gliaceller stamceller var transplanterade (50.000 celler / site) i den ventrala horn ryggmärgen nivå C4 i en vuxen SOD1 G93A råtta. Mus-derived transplanterade cellerna kan skiljas från värd råtta vävnad genom detektion med mus-antikropp, M2. Denna bild visar överlevnad M2 + transplantat som härrör från celler vid 1 månad efter transplantation (se figur 12). Cellerna lokaliserade till ventrala grå saken, men injektionsstället medialt missade laterala ventrala hornet (var mest phrenic motoriska nervceller: anges med streckad linje). Inga cystbildning sågs när 50 tusen celler injiceras per plats, och ingen beteendemässiga försämring berodde på injektionsproceduren. Men injektion av mycket högre antal celler (det faktiska antalet varierar beroende på celltyp, och bör systematiskt utvärderas) resulterar i skador vid injektionsstället och längs nålen spår (se Figur 13: immunohistokemi med astrocyternas markör, GFAP) .
Figur 1. Inledande snitt i huden. På den lägsta mikroskop förstoringen (vi använder 8 x förstoring), använder skalpell blad för att göra mittlinjen snitt. Stretch huden sidled med andra handen för att göra huden spänd (vilket gör att huden lättare att skära), och gör snitt (betecknas med tjock streckad linje) från basen av skallen (i nivå med baksidan av öronen) till skulderbladen (betecknas med tunn streckad linje).
Figur 2. Exponering av kirurgiska området. Den kirurgiska exponering bör kvadrat / rektangel-formade. Denna form kan uppnås genom att dra den omgivande muskler mot 4 hörn med 4 upprullningsdon. Tape sträng som är fäst upprullningsdon till kirurgiska ombord för att säkra upprullningsdon och korrekt föra fältet öppet.
Figur 2-infälld. Upprullningsdon för exponering av kirurgiska fältet. Upprullningsdon används för att dra sig tillbaka muskler för att skapa en kirurgiska området med både tydlig synlighet ryggmärgen och tillräckligt med utrymme att operera. Upprullningsdon kan göras genom att forma robust gem till önskad form och storlek. Autoklaveras upprullningsdon innan för operation. Knytband till upprullningsdon.
Figur3. Kotor. Efter borttagande av paraspinal muskler, rengör dorsal yta kotor med rongeur. Individuella lamina kan ses, liksom rygg rottrådar in från laterala delen av ryggraden.
Figur 4. Laminektomi. Starta laminektomi på ryggmärgen nivå C5. Säkra ryggraden genom att hålla muskler C2 överliggande nivå med råttan tandade pincett. Ta hela lamina (se diagram: grab nära mittlinjen) med rongeur. Placera rongeur så att verktyget är helt vinkelrät mot axeln av ryggraden. Sakta krossa lamina. Tryck inte ner i ryggmärgen, eftersom detta kommer att orsaka skador på ryggraden vävnad. Krossa och dra försiktigt brutna benbit uppåt. Rongeur ska krossa bit så att man lätt kan dra iväg för att ta bort. Om benbit är fortfarande ansluten till resten av lameller, gör ryck inte som detta kommer att orsaka blödning och eventuella skador på ryggmärgen. Rongeur ska vara rena och skarpa.
Figur 5. Exponering av ryggmärg efter laminektomi. Utöka laminektomi att exponera alla C4-C6 ryggmärgen. Gör en kontinuerlig öppning i benet över 3 spinal nivåer. Förläng inte laminektomi för långt i sidled eftersom det kommer att orsaka blödning. För att rikta ventrala horn, är injektionsstället relativt mediala, så det är onödigt att utvidga laminektomi till den fullständiga laterala omfattningen av vertebrala ben.
Figur 6. Hög förstoring dorsal yta ryggmärgen. Framträdande dorsala blodkärl kan ses som löper längs mittlinjen av ryggmärgen. Detta blodkärl mönster observeras i de flesta fall, men vissa djur visa en icke-mittlinjen banan för blodkärl. Den dorsala rottrådar kan ses på den laterala delar av ryggmärgen dorsal yta. I förhållande till dura överliggande ryggmärgen, dessa nerver har ett disigt utseende.
Figur 7. Injektion installationen. Rada upp spruta / nål parallellt med axeln på ryggraden att korrekt rikta önskad anatomiska regionen. Nålen är vinklad precis tillräckligt (ca 80-grader i förhållande till den kirurgiska tabellen) för att inte stöta den kirurgiska omfattning huvudet, men så nära 90 grader som möjligt (till vänster). Lägre injektion spets mot ryggmärgen dorsala yta med hjälp av mikroskop (högra panelen). Rör försiktigt ytan på ryggmärgen med spets nål. Något tryck sladd med nål. Dra tillbaka nålen tills ryggmärgen är tillbaka till normal platta tillstånd. Spela denna position z = 0,0 med linjalen på mikromanipulator.
Figur 8. Hög förstoring ryggmärgen injektion Sikta nål bara mediala till posten zon rygg rottrådar (betecknas med streckad linje).
Figur 9. Skiss av ryggmärgen: hur du riktar anatomiska regionen av intresse När du försöker att rikta den ventrala hornet, incisionsfilm dura parallellt med axeln i ryggraden bara mediala till posten zon av rygg-rottrådar.. Detta kommer att tillåta en att rikta den ventrala horn. Lägre nål till ett djup av 1,5 mm för att rikta ventrala horn hos vuxna råttor (ålder och kön av djuret gör inte mycket skillnad på djup). Lägre nål till ett djup av 0,75 mm för att rikta ventrala horn hos vuxna möss. Naturligtvis, djup och sidoläge beror på den specifika regionen av intresse.
Figur 10. Nedläggning av operationsområdet. Suture stängt tre lager överliggande muskler på en gång med 4-0 sutur. Sutur muskler på 3 platser i rostralt-caudal axeln.
Figur 11. Häftning av huden. Staple huden försluts med 9,0 clips mm sår. Dra klammer med nål hållare för att hindra djuret från att dra ut häftklamrar innan fullt sårläkning. Space klammer ca 0,5 mm från varandra.
Figur 12. Transplantation av stödjeceller stamceller i livmoderhalsen ventrala horn. 50.000 mus som härrör från gliaceller stamceller har transplanterats in i den ventrala horn ryggmärgen nivå C4 i ett SOD1 G93A råtta. M2 + mus-derived transplanterade cellerna överlevt i 1 månad efter transplantation. Cellerna lokaliserade till ventrala grå saken, men injektionsstället medialt missade laterala ventrala horn (betecknasmed streckad linje).
Figur 13. Vävnadsskada efter transplantation av ett stort antal neurala föregångare celler. Injektion av mycket högre antal celler (det faktiska antalet varierar beroende på celltyp, och bör systematiskt utvärderas) resulterar i skador vid injektionsstället och längs nålen spåret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För studier med SOD1 G93A möss och råttor, ålder och kön-match djuren inom en grupp, och distribuera djur inom samma kull till olika grupper. Det är bättre att använda alla djur från samma kön för både ALS och SCI modeller eftersom sjukdomsprocesser kan skilja mellan män och kvinnor, men kan det också vara bra att ha tillräckligt med djur från båda könen för att upptäcka eventuella könsspecifika effekter, som detta fenomen har rapporterats med SOD1 G93A råttor 13 och SOD1 G93A möss 14,15. Tänk på ålder / peka på sjukdom (för ALS djur) eller tid efter skada (SCI modeller) för transplantation av celler till djur. Denna strategi kommer sannolikt att variera beroende på den specifika cellen mekanismer som håller på att åtgärdas.
Protokollet som beskrivs här kan användas för både råtta och mus livmoderhalscancer ryggmärgen 11, samt för transplantation till andra nivåer i råtta och mus ryggmärgen, såsom bröst-och ländryggen nivåer 14. I syfte att lösa särskilda anatomiska strukturer (andra än ventrala horn) i dessa olika ryggmärgen nivåer, är det lämpligt att först testa den mediala / laterala position och djup av injektioner med ett färgämne eller något annat sätt att bedöma riktigheten av koordinaterna.
Utfall åtgärder omfattar detaljerad analys av cell transplantation ödet, biokemiska, histologiska och funktionella stater i ryggmärgen, och beteendemässiga förändringar som är relevanta för platsen för transplantation. Detaljerna i beteende testning, histologiska analysmetoder och andra åtgärder resultatet analyseras efter transplantation bör anpassas till den experimentella behov / modell.
Att ha en kirurgisk assistent att söva, raka, "öppen" och "nära" att djuren är till stor hjälp för att smidigt ta sig igenom de flesta djur som möjligt. Dessutom kan en kirurgisk assistent hjälper kirurgen att förbli steril under hela förfarandet.
Det optimala antalet och koncentrationen av celler injiceras varierar beroende på storleken på cellerna, arter av mottagaren djur, och sjukdomen tillstånd. Till exempel jämfört med intakt ryggmärgen, ökat antal celler kan levereras i ett SCI webbplats om ett hålrum utgör redan 16. Men de särskilda parametrar behöver systematiskt optimeras innan företaget en stor studie.
Innan en stor studie med en viss NPC typ, utvärdera den långsiktiga effektiviteten i immunsystemet regimen. Dessutom kan cellöverlevnad variera för en given celltyp beroende på sjukdom modell eller tidpunkten och platsen för transplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Jag vill tacka: alla medlemmar i Lepore, Maragakis och Rothstein labb för bra diskussion, den förlamade Veterans of America och Craig H. Neilsen fond för finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| 0.05% Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor (optional) | Sigma-Aldrich | T-6522 | |
| Acepromazine maleate (0.7 mg/kg) | Fermenta Animal Health | ||
| Ketamine (95 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | ||
| Xylazine (10 mg/kg) | Bayer AG | ||
| #11 Feather surgical blade | Electron Microscopy Sciences | 72044-11 | |
| Cotton-tipped applicators (6 inch) | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Rat-toothed forceps | Fine Science Tools | Rat: 11023-15; Mouse: 11042-08 | |
| Medium-sized spring scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| Mini spring scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | Rat: 16121-14; Mouse: 16221-14 | |
| Microknife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 12502-14 | |
| Suture: 4-0 | Vicryl | S-183 | |
| Staples: 9 mm | Autoclip | 427631 | |
| Stapler: 9 mm (Reflex #203-1000) | World Precision Instruments, Inc. | 5000344 | |
| Warm water pump (T/Pump) | Gaymar Industries | P/N 07999-000 | |
| Cyclosporin A: 250.0 mg/5.0 mL ampules | Novartis AG | NDC 0078-0109-01 | |
| FK-506 | LC Laboratories | F-4900 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| Injector | World Precision Instruments, Inc. | UMP2 | |
| Micro 4 Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMC4 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Kite-R | |
| 10.0 μL Hamilton syringe | Hamilton Co | 80030 | |
| Hamilton needles: 33-gauge, 45° bevel, 1 inch | Hamilton Co | 7803-05 | |
| Glass 20.0 μL microcapillary pipettes (optional) | Kimble Chase | 71900-20 |
References
- Lane, M. A., Fuller, D. D., White, T. E. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Trends in neurosciences. 31, 538-538 (2008).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin. Chest. Med. 15, 675-675 (1994).
- Miller, R. G., Rosenberg, J. A., Gelinas, D. F. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Mitsumoto, H., Chad, D. A., Pioro, E. P. Amyotrophic lateral sclerosis. Davis, F. A. , Philadelphia. (1998).
- Tandan, R., Bradley, W. G. Amyotrophic leteral sclerosis: Part 2. Etiopathogenesis. Annals of neurology. 18, 419-419 (1985).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the mechanisms involved in motor neuron degeneration in ALS. Annu Rev Neurosci. 27, 723-723 (2004).
- Rosen, D. R., Siddique, T., Patterson, D. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362, 59-59 (1993).
- Bruijn, L. I., Becher, M. W., Lee, M. K. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-327 (1997).
- Gurney, M. E., Pu, H., Chiu, A. Y. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
- Howland, D. S., Liu, J., She, Y. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proc Natl Acad Sci. 99, 1604-1604 (2002).
- Nagai, M., Aoki, M., Miyoshi, I. Rats expressing human cytosolic copper-zinc superoxide dismutase transgenes with amyotrophic lateral sclerosis: associated mutations develop motor neuron disease. J. Neurosci. 21, 9246-9246 (2001).
- McDonald, W., Becker, D. Spinal cord injury: promising interventions and realistic goals. Am. J. Phys. Med. Rehabi. I82, S38-S38 (2003).
- Sandrow-Feinberg, H. R., Zhukareva, V., Santi, L. PEGylated interferon-beta modulates the acute inflammatory response and recovery when combined with forced exercise following cervical spinal contusion injury. Experimental neurology. 223, 439-451 (2010).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1433 (2000).
- Lane, M. A., Lee, K. Z., Fuller, D. D. Spinal circuitry and respiratory recovery following spinal cord injury. Respiratory physiology & neurobiology. 169, 123-123 (2009).
- Lepore, A. C., Rauck, B., Dejea, C. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature. 11, 1294-1294 (2008).
- Rao, M. S. Multipotent and Restricted Precursors in the Central Nervous System. Anat Rec. 257, 137-137 (1999).
- Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. Glial- restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells. Dev Biol. 188, 48-48 (1997).
- Suzuki, M., Tork, C., Shelley, B. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 8, 20-20 (2007).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., Gasmi, M. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain research. 1185, 256-256 (2007).
- Veldink, J. H., Bar, P. R., Joosten, E. A. Sexual differences in onset of disease and response to exercise in a transgenic model of ALS. Neuromuscul Disord. 13, 737-737 (2003).
- Shumsky, J. S., Lepore, A. C. Transplantation of Neuronal and Glial Restricted Precursors into Contused Spinal Cord Improves Bladder and Motor Functions, Decreases Thermal Hypersensitivity, and Modifies Intraspinal Circuitry. J. Neurosci. 25, 9624-9624 (2005).
