Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Intraspinale Cel Transplantatie voor Targeting Cervicale ventrale hoorn van Amyotrofische Lateraal Sclerose en traumatisch ruggenmergletsel

doi: 10.3791/3069 Published: September 18, 2011

Summary

Neurale voorloper transplantatie is een veelbelovende strategie voor de bescherming en / of vervangen van verloren / disfunctionele cervicale diafragma motorische neuronen in het ruggenmerg letsel (SCI) en de motor neuron ziekte, amyotrofe laterale sclerose (ALS). Wij bieden een protocol voor de cel levering aan cervicale ruggenmerg ventrale hoorn in knaagdiermodellen van ALS en SCI.

Abstract

Respiratoire compromis te wijten aan diafragma motor neuron verlies is een slopende gevolg van een groot deel van de menselijke traumatisch ruggenmergletsel (SCI) gevallen 1 en is de uiteindelijke oorzaak van de dood bij patiënten met de motor neuron ziekte, amyotrofe laterale sclerose (ALS) 2.

ALS is een verwoestende neurologische aandoening die wordt gekenmerkt door relatief snelle degeneratie van de bovenste en onderste motorische neuronen. Patiënten die uiteindelijk bezwijken aan de ziekte van gemiddeld 2-5 jaar na de diagnose als gevolg van verlamming van de ademhalingsspieren te wijten aan het verlies van diafragma motorneuron innnervation van het membraan 3. De overgrote meerderheid van de gevallen zijn sporadisch, terwijl 10% zijn van de familiale vorm. Ongeveer twintig procent van de familiale gevallen gekoppeld aan verschillende puntmutaties in het Cu / Zn superoxide dismutase 1 (SOD1) gen op chromosoom 21 4. Transgene muizen en ratten 4,5 6 uitvoeren mutant SOD1 menselijke genen (G93A, G37R, G86R, G85R) zijn gegenereerd, en, ondanks het bestaan ​​van andere diermodellen van de motor neuron verlies, zijn op dit moment de meest gebruikte modellen van de ziekte .

Ruggenmergletsel (SCI) is een heterogene set van voorwaarden die voortvloeien uit fysiek trauma aan het ruggenmerg, met functionele resultaat varieert naar gelang van het type, de locatie en de ernst van het letsel 7. Toch is ongeveer de helft van de menselijke SCI gevallen invloed hebben op cervicale regio's, resulterend in slopende respiratoire dysfunctie als gevolg van diafragma motor neuron verlies en schade aan dalende bulbospinal luchtwegen axonen 1. Een aantal diermodellen van SCI zijn ontwikkeld, met de meest gebruikte en klinisch relevante zijnde de kneuzing 8.

Transplantatie van verschillende klassen van neurale voorloper cellen (NPC) is een veelbelovende therapeutische strategie voor de behandeling van traumatische CNS verwondingen en neurodegeneratie, waaronder ALS en SCI, vanwege de mogelijkheid om verloren of disfunctionele CNS celtypen, om te voorzien neuroprotectie vervangen, en leveren gen factoren van belang 9.

Diermodellen van zowel ALS en SCI kan het model een groot aantal klinisch relevante aspecten van deze ziekten, met inbegrip van diafragma motorneuronen verlies en daaruit voortvloeiende respiratoire compromis 10,11. Om de effectiviteit van NPC-gebaseerde strategieën op respiratoire functie in deze dierlijke modellen van ALS en SCI te evalueren, moet cellulaire interventies specifiek gericht zijn op gebieden met therapeutisch relevante doelstellingen, zoals diafragma motorneuronen. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor multi-segmentale, intraspinale transplantatie van NPC's in het cervicale ruggenmerg ventrale grijze stof van neurodegeneratieve modellen zoals SOD1 G93A muizen en ratten, maar ook ruggemerglaesie ratten en muizen 11.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Methoden

1. Celpreparaat

Als voorbeeld, zullen we de procedure beschrijven voor het bereiden van gliale progenitorcellen 12 voor transplantatie vanwege onze ervaring met dit type cel. Echter, de specifieke kenmerken van het protocol, inclusief midden-en het gebruik van trypsine bijvoorbeeld, afhankelijk van het specifieke celtype wordt gebruikt voor transplantatie.

  1. Pre-warm alle oplossingen tot 37,0 ° C in een waterbad.
  2. Spoel erlenmeyer 2X met HBSS. Voeg 5,0 mL/T-75 fles van 0,05% trypsine / EDTA. Incubeer kolf gedurende 3 minuten in 37,0 ° C incubator. Voorzichtig Vermaal 3X in kolf met 5 of 10 ml pipet.

Optioneel: Voeg 5,0 mL/T-75 fles van 1,0 mg / ml soja trypsine-remmer in DMEM/F12.

  1. Spoel elke kolf 2x in 5,0 ml medium. Pool cellen en spoelt. Houden cellen op ijs voor alle volgende stappen.
  2. Draaien op 200-300 g gedurende 5 minuten in de conische buis: bij voorkeur in centrifuge gekoeld tot 4 ° C. Giet (en opslaan) supernatant. Re-schorten cellen in 1,0 ml medium, en transfer naar 1,5 ml Eppendorf buis.
  3. Tellen cellen met behulp van hemocytometer trypan Blue om de levensvatbaarheid te bepalen.
  4. Spin opnieuw in 1,5 ml tube (800 rpm gedurende 10 minuten: bij voorkeur in de centrifuge gekoeld tot 4 ° C). Giet (en opslaan) supernatant.
  5. Re-schorten cellen in de gewenste eindvolume van medium tot juiste cel dichtheid te bereiken.
  6. Verdeel celsuspensies om meerdere 1,5 ml Eppendorf buizen. Houden cellen op nat ijs tot transplantatie.

Geen gebruik maken van 0,75 ml buisjes, zoals de Hamilton spuit / naald kan niet diep passen in deze buis. Meerdere injecties zal waarschijnlijk worden gemaakt tijdens de operatie sessies, en men wil niet te storen dezelfde buis van de cellen vele malen. Probeer ten minste 50% meer volume van de celsuspensie dan nodig is voor te bereiden. Houden cellen op ijs in de hele operatie sessie. Transplantatie cellen binnen 4-5 uur van de voorbereiding celsuspensies om de grootste levensvatbaarheid van de cellen na de transplantatie te verzekeren.

2. Voorbereiding voorafgaand aan de operatie

  1. Gedrag relevante baseline gedrag evaluaties voorafgaand aan de operatie.
  2. Onderdrukking van het immuunsysteem: subcutane cyclosporine A (CSA: 10,0 mg / kg lichaamsgewicht) of intraperitoneale (IP) FK-506/Rapamycin (1,0 mg / kg lichaamsgewicht) moet worden begonnen ten minste 3 dagen voorafgaand aan de transplantatie, en dient te worden dagelijks gegeven tot offer. Toediening in het drinkwater (in plaats van dagelijkse injecties) wordt afgeraden. CSA is onze immunosuppressieve van de keuze bij het transplanteren van knaagdieren-afgeleide cellen, terwijl FK-506/Rapamycin is onze keuze bij het transplanteren van mensen afgeleide cellen.
  3. Autoclaaf chirurgische instrumenten voorafgaand aan de operatie. Maak een nette en schone plaats aan de operatie te doen, evenals een overzichtelijke plek om tools te zetten. Een met glas kraal sterilisator is ook nuttig. Houd alle gereedschappen schoon (met name rongeur) tijdens de operatie, omdat dit zal de procedure een stuk eenvoudiger. Elk materiaal dat wordt gebruikt tijdens de chirurgische ingreep moet steriel zijn.
  4. Instrumenten die niet kan worden gesteriliseerd, zoals de chirurgische microscoop moet worden afgeveegd neer met een geschikt desinfectiemiddel, en de handgrepen afgedekt met steriel materiaal (bv gaas), zodat de chirurg, een keer trok met steriele handschoenen, niet verontreinigt zijn / haar handschoenen.
  5. De chirurg moet wassen zijn / haar handen met een desinfecterend middel (chloorhexidine scrub) voor het begin van de operatie. De chirurg zal dragen steriele handschoenen, een gezichtsmasker, en een schone jurk.

3. Chirurgie: Dier Voorbereiding en Chirurgie

Dier Prep:

  1. Weeg dier, en de juiste dosis toedienen van anesthesie: Isofluorane inademing of verdovend cocktail (geleverd via IP) van [acepromazine maleaat (0,7 mg / kg), ketamine (95 mg / kg), en xylazine (10 mg / kg)].
  2. Knijp teen en / of gebruik de palpebrale reflex (het aanraken van het bovenste ooglid met wattenstaafje om te observeren knippert) om te bepalen of dier goed is verdoofd. Het hoornvlies moet worden beschermd door het aanbrengen van een kunstmatige traan zalf voorafgaand aan de operatie.
  3. Scheren achter haar met elektrisch scheerapparaat (geen gehechtheid nodig). Scheren van iets rostraal van oren tot het midden van de rug van het dier. Scheren goed, en verwijder de haren knippen van de huid tot haar krijgen in incisie te voorkomen. De chirurgische prep moeten uit de buurt worden uitgevoerd uit het gebied waar de operatie zal worden uitgevoerd om verontreiniging van de chirurgische site met verdwaalde haren te vermijden.
  4. Geniet van gaas met Povidine-Jodium antiseptische oplossing, en gelden voor huid over geschoren gebied. De chirurgische site moet worden geschrobd ten minste tweemaal met de Povidine-Jodium-oplossing, let daarbij goed op schrobben van het centrum van de site in de richting van de periferie. De site kan dan worden gespoeld met 70% alcohol of verdunde germicide scrub. Het gebied moet worden bedekt met steriele doeken.
  5. Gedurende de operatie, het gebruik van een verwarmingselement is sterk aanbevolen om het dier een normale lichaamstemperatuur te behouden. Daarnaast moet de lichaamstemperatuur worden gecontroleerd. Plaats dier op opgerold gaasje. Voor een volwassen rat, moet de opgerolde gaasje worden ~ 1,0 inch dik en ~ 6,0 centimeter in lengte. Tape dit pad aan de operatie boord, zodat het niet bewegen. Plaats dier op pad op het niveau van de borst / schouder. Strek beide armen op pad, en de band naar beneden wapens aan boord een operatie. Het idee is om het cervicale ruggenmerg ondersteunen, zodat het gemakkelijker is om te werken in de hele operatie, omdat het cervicale snoer wordt gevonden diep onder het oppervlak van de huid.

Chirurgie:

  1. Op het laagste microscoop vergroting (we gebruiken 8 x vergroting), gebruik scalpel om middellijn incisie te maken. Lateraal Stretch huid met de andere hand om de huid strak (waardoor de huid gemakkelijker te incise), en maak incisie van de basis van de schedel naar schouderblad. (Zie figuur 1)
  2. Gebruik scalpel om incisie te maken door drie spierlagen over de wervelkolom. Knijp zachtjes in de spier (van lateraal naar mediaal) aan beide zijden met de andere hand. Zorg ervoor dat u stevig genoeg druk met scalpel om alle spierlagen gesneden met het minste aantal sneden mogelijk, zodat spieren incisies worden niet gekarteld, waardoor hechten aan het eind van de operatie gemakkelijker te maken. Echter, niet op al te stevig om te voorkomen dat tot schade in de diepere weefsel (wervelkolom).
  3. Met twee wattenstaafje applicators, gebruik draaiende beweging om overliggende spieren te scheiden van paraspinale spier. Men kan hier worden krachtig. Niet knippen of scheuren, omdat dit zal leiden tot bloedingen. Draaiende beweging met de applicators zal mooi uit elkaar plagen het weefsel zonder schade of bloeding. Als bloeding optreedt in elk stadium van de operatie, is het best om geduldig te zijn. Probeer niet vooruit te haasten met veel bloeding, omdat het bloed zal visie van het chirurgische veld duister. Cauterisatie of lichte druk kunnen worden toegepast op de site van bloeding, maar we vinden dat geduld is het beste. Met de praktijk zou er weinig of geen bloeding in deze operatie.
  4. Intrekken spier met 4 zelfgemaakte oprolmechanisme (zie figuur 2). Deze oprolmechanismen kan worden gemaakt van stevig paperclips gevormd tot een oprolmechanisme (zie figuur 2-inzet). Autoclaaf deze voor de operatie. Zorg moet worden genomen om de uiteinden van de oprolmechanismen stompe om beschadiging van het weefsel te voorkomen. Strikband aan oprolmechanisme. Blootstelling moet worden vierkant / rechthoekig-vormig. Deze vorm kan worden bereikt door te trekken tot 4 hoeken met de 4 oprolmechanismen. Tape snaar aan boord om oprolmechanismen beveiligen (zie figuur 2). In de handel verkrijgbare oprolmechanismen kan ook gebruikt worden, maar we liever niet deze te gebruiken. Het is cruciaal om een ​​goede chirurgische veld te creëren, om duidelijk te zien in de hele operatie. Niet "blind" mee voort te zetten.
  5. Duidelijk paraspinale spier van dorsale oppervlak van de wervelkolom. Om te gaan met paraspinale spier aan de rugzijde van de wervelkolom, zijn er twee mogelijke strategieën. Voor de eerste strategie, gebruik van rat-getande tang en middelgrote veer schaar om paraspinale spieren te verwijderen van dorsale oppervlak van de wervels. Probeer bezuinigingen zeer dicht bij het bot om beter te ontmaskeren botoppervlak te maken. Maak sneden parallel aan de oppervlakte van de wervels, maar niet bezuinigen in het koord. Voor de tweede benadering, maak een middellijn incisie in de para-spinale spier-, en schuif zijwaarts met kleinere oprolmechanisme. In de tweede benadering, kan de spier dan weer in elkaar worden gehecht na de operatie.
  6. Reinig het oppervlak van de wervelkolom bot goed. Gebruik rongeur (de belangrijkste chirurgisch instrument) om weg te trekken de spieren van de niveaus C4, C5 en C6 (zie figuur 3). Dit hangt natuurlijk af van de wervelkolom niveaus die gericht zijn. Tijdens het gebruik van rongeur met een hand, veilig gehele wervelkolom door vast te pakken spier meer dan C2 het verwerken van rat-getande pincet in de andere hand. C2 is de grote rostrale proces in het chirurgische veld. C3 is iets onder de spier ook. C4, C5 en C6 zijn gemakkelijk te bereiken, omdat ze weinig spierkracht bovenliggende hen.
  7. Begin met laminectomie van de C5. Nogmaals, veilig door te oordelen C2 met rat-getande tang. Grab hele lamina (zie schema: pak de buurt van middellijn) met rongeur. Plaats rongeur zodat tool is volledig haaks op de as van de wervelkolom. Langzaam verpletteren lamina. Niet duwen naar beneden in het ruggenmerg, omdat dit schade aan de ruggengraat weefsel veroorzaken. Crush en trek gebroken stuk bot naar boven. Rongeur zou verpletteren stuk zodat men makkelijk weg trekken om te verwijderen. Als stukje bot is nog aan de rest van de lamina, niet sleepboot omdat dit bloeding en mogelijk letsel aan het ruggenmerg veroorzaken. Rongeur moet schoon en scherp. Instrumenten zoals de rongeur moet worden gewassen / afgeveegd met een steriele zoutoplossing, die kan worden voorzien in een steriele kom (zie figuur 4).
    Voor de eerste opening van de laminectomie, het positioneren van de rongeur loodrechtloodrecht op de wervelkolom de voorkeur. Deze stap kan dan worden gevolgd door het nemen van kleine "hapjes" om de laminectomie uit te breiden door het inbrengen van de rongeur voorzichtig onder het bot met een ongeveer 30-60 graden hoek ten opzichte van het koord oppervlak.
  8. Uit te breiden laminectomie om alle C4-C6 laminae. Maak een doorlopende opening in het bot over drie spinale niveaus. De omvang van de laminectomie kan worden aangepast op basis van de gewenste locatie (s) van intraspinale injectie.
  9. Niet uit te breiden laminectomie te ver zijwaarts, omdat dit zal leiden tot bloedingen. Om de doelgroep ventrale hoorn, de plaats van injectie is relatief mediaal, dus het is onnodig om laminectomie tot ver zijwaarts. (Zie figuur 5)
  10. Te verhogen tot vergroting ~ 15 x.
  11. Schoon uit bindweefsel (en eventueel gedroogd bloed) op de top van dura met scherpe / rechte # 5 tang. Het verschil tussen het bindweefsel en dura geleerd moet worden met ervaring.
  12. Incise dura, een zeer taaie meningeale laag, met of mini-veer schaar of microknife. Maak incisie evenwijdig aan de as van de wervelkolom juist mediaal van de invoer zone van de dorsale worteltjes. Dit zal toelaten de ene naar de ventrale hoorn doel. (Zie figuur 6)
  13. Gebruik scherpe / rechte # 5 tang te grijpen en een beetje duur lift off van het ruggenmerg. Niet knijpen / verwonden ruggenmerg. Dit duurt enige oefening. Maak insnijdingen met microknife of zeer kleine veer schaar. Niet verwonden ruggenmerg.
  14. Enigszins uit te breiden incisie in rostrale-caudale as. Spanning van dura zal iets apart dura een mooie belichting van het ruggenmerg te creëren.
  15. Maak incisies bij alle geschikte plaatsen voor elke beoogde injectie. Dura heeft een wazig doorschijnend uiterlijk, terwijl het ruggenmerg oppervlak heeft een helderder wit-kleurig uiterlijk. Zal men moeten leren om elkaar te onderscheiden deze. Het is raadzaam niet te proberen om door de dura injecteren met de injectienaald. De dura is taai, zodat het moeilijk zijn om doorheen prikken. Daarnaast kunnen piercing door de dura invloed hebben op het traject van het inbrengen van de naald en zullen dus van invloed op de anatomisch gerichte toediening van de cellen.
  16. Bilateraal injecteren cellen op drie niveaus (6 sites in totaal) om grote regio van cervicale uitbreiding doel. Het aantal en de locatie (s) van injecties, uiteraard, afhankelijk van de specifieke experiment.
  17. Na het doorprikken dura, zal hersenvocht uitgieten. Droge ondergrond van het snoer en de volledige blootstelling met een gaasje of wattenstaafje.
  18. Voor cel injectie, gebruik 10.0μL Hamilton gasdicht RN spuit.
  19. Bevestig de 33-gauge / 45 graden schuine metalen RN Hamilton naald. De naald moet scherp zijn. Gebruik dezelfde naald voor slechts ~ 20 injecties (de naald wordt scherper met minder injecties). Men kan ook gebruik maken van getrokken glazen capillaire buizen voor naalden. Gebruik epoxy aan getrokken glas tip hechten aan 26-gauge stompe Hamilton metalen naald. Trim buitenste tip diameter tot ~ 75.0-100.0 pi (afhankelijk van de diameter van de cellen: een wil niet cellen te beschadigen tijdens het proces van injectie) met behulp van een chirurgische microscoop en micrometer. Wij geven de voorkeur van de 33-metalen naalden.
  20. Cellen zullen gemakkelijk uit val van de schorsing in de eppendorfbuisje op ijs. Direct voorafgaand aan het laden van de injectiespuit, tik dan zachtjes tube totdat cellen terug in suspensie. Niet flick te intensief, omdat dit zal cellen en / of veroorzaken bubbels verwonden. U kunt ook 20.0μL pipet-man om voorzichtig mix cellen: pipet celsuspensie slechts een of twee keer op en neer.
  21. Load genoeg celsuspensie volume van slechts een injectie. Cellen zullen uitvallen van opschorting binnen injectiespuit als een plan om meerdere injecties te doen. Langzaam nemen cellen in de spuit te bellen en / of schade aan cellen voorkomen. Specifiek voor de gliale progenitor cellen dat we werken met in ons lab, we injecteren 2,0 pi van de celsuspensie in een verdunning van 50,000-75,000 cellen per microliter 1,0 gedurende 2-5 minuten. We hebben ontdekt dat 2uL/site niet leidt tot weefselschade in de cervicale ruggenmerg. In plaats daarvan, onze ervaring leert dat aanzienlijke verhoging van de aantallen cellen in dit volume (vooral als ze zijn groter dan onze voorouders gliale: 10,0 -20,0 um in diameter) kan leiden tot schade aan het ruggenmerg parenchym. Wij hebben een uitgebreide cel dosering experiment om de optimale aantallen cellen te bepalen om te injecteren op elke locatie (in ieder geval in de intacte cervicale ruggenmerg). De parameters moeten worden bepaald voor het specifieke celtype en ziekte conditie.
  22. Line up spuit / naald evenwijdig met de as van de wervelkolom om goed te richten gewenste anatomische regio. De naald is net genoeg hoek (ongeveer 80 graden ten opzichte van de chirurgische tabel) niet te stoten de chirurgische mogelijkheden hoofd, maar zo dicht mogelijk bij 90 graden mogelijk. Onderste uiteinde tot in het ruggenmerg dorsale oppervlak met behulp van microscoop (zie figuur 7).
  23. Doel naald net mediaal om de toegang Zone van de dorsale worteltjes (zie figuur 8). Zachtjes touch oppervlak van het ruggenmerg met de punt van de naald. Iets deprimeren ruggenmerg met naald. Trek de naald totdat het ruggenmerg is weer normaal. Noteer deze positie als z = 0,0 met de liniaal op de micromanipulator.
    Opmerking: We routinematig niet het stabiliseren van de wervelkolom tijdens het cervicale ruggenmerg injecties. Met behulp van onze verdoving regime, heeft op-en neergaande beweging van de cervicale ruggenmerg als gevolg van zware ademhaling nooit een probleem. Echter, als zware ademhaling een probleem is, kan de wervelkolom worden gestabiliseerd met behulp van een aangepaste frame door voorzichtig klemmen het bot en de omliggende para-spinale spier op een niveau C2 en C7 met behulp van aangepaste tang, zorg dat u de wervel bot te verpletteren of het verwonden onderliggende ruggenmerg weefsel. Als het dier de ademhaling oppervlakkig tijdens de procedure, moet meer anestheticum worden verstrekt. De operatie dient te worden onderbroken totdat een chirurgische vlak van anesthesie is opnieuw bereikt voor hervatting.
  24. Iets lager naald in het ruggenmerg. Zorg ervoor dat u kijken in de microscoop terwijl je dit doet. Lagere naald tot een diepte van 1,5 mm tot ventrale hoorn doel bij volwassen ratten. Lagere naald tot een diepte van 0,75 mm tot ventrale hoorn doelwit in volwassen muizen. (Zie Figuur 9). Deze diepte-cijfers zijn representatief voor volwassenen (minstens 3 maanden oud) vrouwelijke en mannelijke Sprague-Dawley ratten (250-450 gram) en C57BL / 6 muizen (20-35 gram). Natuurlijk, de diepte en laterale positie zijn afhankelijk van de specifieke regio van belang. Niet storen injectie systeem / chirurgie raad van bestuur of een operatie tafel, terwijl de naald wordt ingevoegd in het ruggenmerg om schade aan spinale weefsel te voorkomen.
  25. Wacht twee minuten (langer is nog beter) na het verlagen van de naald op de gewenste diepte vóór de injectie.
  26. Injecteer 2,0 pi gedurende 2-5 minuten bij een constante snelheid met behulp van pomp-controller.
  27. Wacht twee minuten (langer is beter) na injectie langzaam voordat u de naald uit het ruggenmerg.
  28. Schoon spuit met dH2O na elke injectie om verstoppingen te voorkomen. Langzaam opstellen en verdrijven 3-5 keer. Niet trekken lucht in spuit.
  29. Keer terug tot het laagste vergroting (dezelfde als die bij het begin van de operatie: ~ 8 x). Suture dura gesloten met behulp van hechtdraad 9-0, maar dit is zeker niet nodig. Het is ook een uitdaging. We gehecht dura gesloten in het verleden, maar we vinden geen verschil in gedrag van dieren, transplantatie overleven of het ruggenmerg histologie wanneer de dura niet wordt gesloten met hechtdraad. De dura kan worden afgedekt met een beschermende stuk steriele gel schuim. De gel schuim moet rechtstreeks worden geplaatst op de top van de durale incisie site. Toch is het belangrijk om zorg te dragen in niet abrupt te trekken dit stuk van gelfoam af van het oppervlak van het ruggenmerg tijdens de post-perfusie dissectie, omdat de gelfoam kan soms strak houden aan het ruggenmerg oppervlak.
  30. Optioneel: Suture paraspinale spier afgesloten met 4-0 hechtdraad.
  31. Suture drie bovenliggende spierlagen gesloten in een keer met 4-0 hechtdraad. Hechting spieren op drie locaties in de rostrale-caudale as (zie figuur 10).
  32. Nieten huid gesloten met 9,0 mm wond clips (zie figuur 11). Draai nietjes met naald houders van dieren te voorkomen dat het trekken van nietjes voorafgaand aan de volledige genezing van de wond. Ruimte van ongeveer 0,5 cm van elkaar nieten. Niet te strak de wond clips, omdat dit kan leiden tot vertraagde genezing en necrose.
  33. Van toepassing Povidine-Jodium antiseptische oplossing voor ruimte wond met een gaasje gedrenkt.
  34. Laat dier te laten bekomen op circulerende warm water pad. Geef sub-cutane injectie van de oplossing steriele Ringer lactaat (5,0 ml voor rat; 0,5 ml voor muis) onmiddellijk na de operatie. Follow-up injecties kunnen ook worden verstrekt wanneer het dier verschijnt gedroogde en / of lusteloos. Profylactische antibiotische behandeling met behulp van 6.0mg/kg van Cefazolin kan worden gebruikt, maar onze ervaring blijkt dat deze transplantatie procedure niet leidt tot post-operatieve infecties als aseptische techniek is gevolgd en alle instrumenten / chirurgisch materiaal zijn gesteriliseerd. Als deze voorzorgsmaatregelen worden gevolgd, is de toediening antibiotica afgeraden.
  35. Ga door CSA of FK-506/Rapamycin dagelijks tot offer.
  36. De hele ingreep duurt minder dan ~ 45 minuten (met 6 injectieplaatsen). Anders zal het dier begint om wakker te worden en te ademen zwaarder, wat een nadelige invloed hebben op zal injectie in het ruggenmerg.

Tips voor het oplossen Problemen in verband met de verschillende stappen van Protocol

Gebrek aan / slechte overleving van de cel: Dit is waarschijnlijk niet een technisch probleem in verband met de injectie, maar is waarschijnlijk te wijten aan de eigenschappen van het celtype wordt geïnjecteerd en / of de immunesuppression regime. Deze kwesties moeten empirisch worden geëvalueerd op een cel-type en diermodel specifieke basis. De beschikbaarheid van een aantal van immuun-deficiënte rat en muis-modellenzijn ook beschikbaar voor problemen met de immunesuppression te omzeilen, maar deze dieren ook aanwezig problemen zoals kosten, de noodzaak voor het behoud van een kolonie, en extra voorzichtigheid nodig is tijdens de operatie en huisvesting.

Functionele gebreken geconstateerd na een operatie: In onze ervaring hebben we niet in acht genomen het optreden van een functionele tekorten het volgen van deze procedure bij de beoordeling door maatregelen zoals de voorpoot en achterbeen grijpkracht en diafragma zenuw / diafragma verbindingen spier actiepotentialen, zelfs met 6 injecties sites ( van 2μL elk) in het cervicale ruggenmerg. Weefselafbraak is ook niet waargenomen. Mogelijke redenen voor het ontstaan ​​van deze problemen zijn: niet met behulp van de voorgestelde naalddikte, het injecteren van grotere volumes en / of mobiele nummers, onbedoelde schade veroorzaakt door onjuiste laminectomie, gebrek aan fijngevoeligheid, terwijl het snijden van de dura (zoals knijpen het snoer met de # 5 pincet) of tijdens het proces van het inbrengen van de naald Hamilton in het ruggenmerg (ter vervanging van een saaie naald).

Cellen niet te vinden in ventrale grijze stof: Dit kan te wijten zijn aan een aantal punten. Als de injectie mist het doel mediaal of lateraal, zorg ervoor dat de juiste line-up van de injectie-systeem parallel met de as van het ruggenmerg, en de naald juist mediaal van de ingang van de dorsale worteltjes te voegen. Als de injectie mist het doel dorsaal of ventraal, zorg ervoor dat uw z-as het lezen van nul wanneer de punt van de naald is nog net het dorsale oppervlak van het ruggenmerg aan te raken, het voorgestelde Hamilton naald te gebruiken met de juiste schuine (een langere schuine kan van invloed zijn targeting), zorgen dat het ruggenmerg niet comprimeren bij het plaatsen van de naald, verzorgen in precies meetdiepte het gebruik van de micromanipulator en gebruik dieren binnen de voorgestelde gewicht. Pas uw techniek dus als je consequent het injecteren van de cellen in een locatie (die vereist histologische evaluatie en de daaropvolgende techniek modificatie). Als de injecties zijn willekeurig verspreid op al uw injectieplaatsen, zul je moeten oefenen om de consistentie te verbeteren. Als de cellen de neiging om meestal gelegen op het dorsale aspect van het ruggenmerg langs de naald weg, langer wachten voor en na de injectie cellen en verlengt de feitelijke injectie gedurende een langere periode.

4. Representatieve resultaten:

Muis-afgeleide gliale progenitor cellen werden getransplanteerd (50.000 cellen / site) in de ventrale hoorn van het ruggenmerg niveau C4 in een volwassen SOD1 G93A rat. Muis-afgeleide getransplanteerde cellen kunnen worden onderscheiden van gastheer rat weefsel via detectie met de muis-specifieke antilichaam, M2. Dit beeld toont het voortbestaan ​​van de M2 + transplantatie-afgeleide cellen op 1 maand na transplantatie (zie figuur 12). De cellen gelokaliseerd in het ventrale grijze stof, maar de plaats van injectie mediaal miste de laterale ventrale hoorn (de locatie van de meeste diafragma motor neuronen: aangegeven met stippellijn). Geen cyste vorming werd gezien toen 50.000 cellen werden geïnjecteerd per site, en er geen bijzondere waardevermindering gedrag het gevolg van de injectie procedure. Echter, injectie van veel hogere aantallen cellen (het werkelijke aantal is afhankelijk van het type cel, en moeten systematisch geëvalueerd worden) resulteert in schade aan op de injectieplaats en langs de naald spoor (zie Figuur 13: immunohistochemie met de astrocyt marker, GFAP) .

Figuur 1
Figuur 1. Eerste incisie van de huid. Op het laagste microscoop vergroting (we gebruiken 8 x vergroting), gebruik scalpel om middellijn incisie te maken. Lateraal Stretch huid met de andere hand om de huid strak (waardoor de huid gemakkelijker te snijden), en maak incisie (aangeduid met dikke stippellijn) van de basis van de schedel (op het niveau van de achterkant van de oren) naar schouderblad (aangeduid door dunne stippellijn).

Figuur 2
Figuur 2. Blootstelling van chirurgische veld. De chirurgische blootstelling zou rekening moeten vierkant / rechthoekig-vormig. Deze vorm kan worden bereikt door het trekken van de omringende spieren naar 4 hoeken met behulp van de 4 oprolmechanismen. Tape string die wordt gehecht aan retractors chirurgische raad van bestuur om oprolmechanismen veilig en goed te houden veld open.

Figuur 2-inzet. Oprolmechanismen voor blootstelling van chirurgische veld. De oprolmechanismen worden gebruikt om terug te trekken spier in om een chirurgische veld te creëren met zowel duidelijke zichtbaarheid van het ruggenmerg en voldoende ruimte om een operatie uit te voeren. Oprolmechanismen kunnen worden gemaakt door het vormgeven stevig paperclips in de gewenste vorm en grootte. Autoclaaf de oprolmechanismen voor de voor de operatie. Strikband aan oprolmechanisme.

Figuur 3
Figuur3. Wervels. Na verwijdering van paraspinale spieren, grondig te reinigen dorsale oppervlak van de wervels met rongeur. Individuele lamina kan worden gezien, evenals dorsale kiemwortels het invoeren van de laterale aspect van de wervelkolom.

Figuur 4
Figuur 4. Laminectomie. Start laminectomie op ruggenmerg niveau C5. Veilige wervelkolom door holding spier bovenliggende niveau C2 met een rat getande tang. Grab hele lamina (zie schema: pak de buurt van middellijn) met rongeur. Plaats rongeur zodat tool is volledig haaks op de as van de wervelkolom. Langzaam verpletteren lamina. Niet duwen naar beneden in het ruggenmerg, omdat dit schade aan de ruggengraat weefsel veroorzaken. Crush en trek gebroken stuk bot naar boven. Rongeur zou verpletteren stuk zodat men makkelijk weg trekken om te verwijderen. Als stukje bot is nog steeds verbonden met de rest van laminae, niet sleepboot omdat dit bloeding en mogelijk letsel aan het ruggenmerg veroorzaken. Rongeur moet schoon en scherp.

Figuur 5
Figuur 5. Blootstelling van ruggenmergweefsel na laminectomie. Uitbreiden laminectomie om alle C4-C6 ruggenmerg bloot te leggen. Maak een doorlopende opening in het bot meer dan 3 spinale niveaus. Niet uit te breiden laminectomie te ver zijwaarts, omdat dit zal leiden tot bloedingen. Om de doelgroep ventrale hoorn, de plaats van injectie is relatief mediaal, dus het is onnodig om laminectomie uit te breiden tot de volledige omvang van de laterale vertebrale bot.

Figuur 6
Figuur 6. Hoge vergroting van de rugzijde van het ruggenmerg. De prominente dorsale bloedvat kan worden gezien rennen de middellijn van het ruggenmerg. Dit bloedvat patroon wordt waargenomen in de meeste gevallen, maar sommige dieren vertonen een niet-middellijn traject van het bloedvat. De dorsale worteltjes te zien op de laterale aspecten van het ruggenmerg dorsale oppervlak. Ten opzichte van de dura bovenliggende het ruggenmerg, deze zenuwen hebben een wazig uiterlijk.

Figuur 7
Figuur 7. Injectie setup. Line up spuit / naald evenwijdig met de as van de wervelkolom om goed te richten gewenste anatomische regio. De naald is net genoeg hoek (ongeveer 80 graden ten opzichte van de chirurgische tabel) niet te stoten de chirurgische mogelijkheden hoofd, maar zo dicht mogelijk bij 90 graden mogelijk (linker paneel). Lagere injectie tip tot in het ruggenmerg dorsale oppervlak met behulp van de microscoop (rechter paneel). Zachtjes touch oppervlak van het ruggenmerg met de punt van de naald. Iets deprimeren koord met naald. Trek de naald totdat het ruggenmerg is weer normaal vlakke staat. Noteer deze positie als z = 0,0 met de liniaal op de micromanipulator.

Figuur 8
Figuur 8. Hoge vergroting van het ruggenmerg injectie Doel naald net mediaal om de invoer zone van de dorsale worteltjes (aangeduid met stippellijn).

Figuur 9
Figuur 9. Schema van het ruggenmerg: hoe anatomische regio van belang richten Wanneer u probeert het ventrale hoorn, incise dura evenwijdig aan de as van de wervelkolom juist mediaal van de invoer zone van de dorsale worteltjes doel.. Dit zal toelaten de ene naar de ventrale hoorn doel. Lagere naald tot een diepte van 1,5 mm tot ventrale hoorn doel bij volwassen ratten (de leeftijd en het geslacht van het dier maakt niet veel verschil op diepte). Lagere naald tot een diepte van 0,75 mm tot ventrale hoorn doelwit in volwassen muizen. Natuurlijk, de diepte en laterale positie zijn afhankelijk van de specifieke regio van belang.

Figuur 10
Figuur 10. Sluiting van de operatiewond. Suture drie bovenliggende spierlagen gesloten in een keer met 4-0 hechtdraad. Hechting spieren op drie locaties in rostrale-caudale as.

Figuur 11
Figuur 11. Nieten van de huid. Staple huid gesloten met 9,0 mm wond clips. Draai nietjes met naald houders om het dier te voorkomen dat het trekken van staples voorafgaand aan de volledige genezing van de wond. Ruimte nietjes ongeveer 0,5 mm van elkaar.

Figuur 12
Figuur 12. Transplantatie van gliale voorlopers in cervicale ventrale hoorn. 50.000 muis afgeleide gliale progenitor cellen werden getransplanteerd in de ventrale hoorn van het ruggenmerg niveau C4 in een SOD1 G93A rat. M2 + muis-afgeleide getransplanteerde cellen overleefden op 1 maand na transplantatie. De cellen gelokaliseerd in het ventrale grijze stof, maar de plaats van injectie mediaal miste de laterale ventrale hoorn (aangeduiddoor de stippellijn).

Figuur 13
Figuur 13. Weefselbeschadiging na de transplantatie van grote aantallen neurale voorloper cellen. Injectie van veel hogere aantallen van cellen (het werkelijke aantal is afhankelijk van het type cel, en moeten systematisch geëvalueerd worden) resulteert in schade aan op de injectieplaats en langs de naald spoor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Voor studies met SOD1 G93A muizen en ratten, leeftijd en geslacht overeen met de dieren binnen een groep, en dieren binnen hetzelfde nest aan verschillende groepen te verdelen. Het is beter om alle dieren te gebruiken van hetzelfde geslacht voor zowel ALS en SCI-modellen, omdat de ziekte-processen kunnen verschillen tussen mannen en vrouwen, maar het kan ook nuttig zijn om genoeg dieren van beide geslachten om mogelijke sekse-specifieke effecten te detecteren hebben, zoals dit fenomeen is gemeld bij SOD1 G93A ratten 13 en SOD1 G93A muizen 14,15. Denk aan de leeftijd / punt van de ziekte (voor ALS dieren) of tijd na het letsel (voor SCI-modellen) voor de transplantatie van cellen in dieren. Deze strategie zal waarschijnlijk verschillen afhankelijk van de specifieke cel mechanismen die worden aangepakt.

Het protocol hier beschreven kan worden gebruikt voor zowel de rat en muis cervicale ruggenmerg 11, alsmede voor transplantatie in andere niveaus van de rat en de muis ruggenmerg, zoals thoracale en lumbale niveau 14. Om specifieke anatomische structuren (met uitzondering van ventrale hoorn) doel in deze verschillende niveaus ruggenmerg, is het raadzaam om de eerste test van de mediale / laterale positie en diepte van injecties met behulp van een kleurstof of andere middelen om de nauwkeurigheid van de coördinaten te evalueren.

Resultaat maatregelen zijn onder meer gedetailleerde analyse van celtransplantatie het lot, biochemische, histologische en functionele staat van het ruggenmerg, en gedragsveranderingen die relevant zijn voor de locatie van de transplantatie. De specifieke kenmerken van het gedrag van testen, histologische analyse en andere uitkomstmaten geanalyseerd na de transplantatie moet worden afgestemd op het experimentele behoeften / model.

Na een chirurgische assistent van verdoven, scheren, "open" en "sluiten" van de dieren is heel nuttig voor een vlotte, krijgen door de meeste dieren mogelijk te maken. Daarnaast kan een chirurgische assistent helpt de chirurg om steriele blijven gedurende de procedure.

Het optimale aantal en de concentratie van cellen ingespoten zal variëren afhankelijk van de grootte van de cellen, de soort van de ontvanger dier, en de ziekte aandoening. Bijvoorbeeld, in vergelijking met de intacte ruggenmerg, een verhoogd aantal cellen kan worden geleverd in een SCI site als een holte heeft reeds gevormd 16. Echter, de specifieke parameters moeten vooraf systematisch worden geoptimaliseerd om onderneming een groot onderzoek.

Voorafgaand aan het uitvoeren van een groot onderzoek met een bepaald soort NPC, evalueren van de doeltreffendheid op lange termijn van het immuunsysteem onderdrukken regime. Daarbij mag overleving van de cel variëren voor een bepaald celtype, afhankelijk van de ziekte model of de timing en de locatie van de transplantatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Ik wil graag bedanken: alle leden van de Lepore, Maragakis en Rothstein labs voor nuttige discussie; De Paralyzed Veterans of America en de Craig H. Neilsen Foundation voor financiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS GIBCO, by Life Technologies 14170
0.05% Trypsin GIBCO, by Life Technologies 25300
Soybean Trypsin Inhibitor (optional) Sigma-Aldrich T-6522
Acepromazine maleate (0.7 mg/kg) Fermenta Animal Health
Ketamine (95 mg/kg) Fort Dodge Animal Health
Xylazine (10 mg/kg) Bayer AG
#11 Feather surgical blade Electron Microscopy Sciences 72044-11
Cotton-tipped applicators (6 inch) Fisher Scientific 23-400-101
Rat-toothed forceps Fine Science Tools Rat: 11023-15; Mouse: 11042-08
Medium-sized spring scissors Fine Science Tools 15012-12
Mini spring scissors Fine Science Tools 15000-10
Rongeur Fine Science Tools Rat: 16121-14; Mouse: 16221-14
Microknife Fine Science Tools 10056-12
Needle holders Fine Science Tools 12502-14
Suture: 4-0 Vicryl S-183
Staples: 9 mm Autoclip 427631
Stapler: 9 mm (Reflex #203-1000) World Precision Instruments, Inc. 5000344
Warm water pump (T/Pump) Gaymar Industries P/N 07999-000
Cyclosporin A: 250.0 mg/5.0 mL ampules Novartis AG NDC 0078-0109-01
FK-506 LC Laboratories F-4900
Rapamycin LC Laboratories R-5000
Injector World Precision Instruments, Inc. UMP2
Micro 4 Microsyringe Pump Controller World Precision Instruments, Inc. UMC4
Micromanipulator World Precision Instruments, Inc. Kite-R
10.0 μL Hamilton syringe Hamilton Co 80030
Hamilton needles: 33-gauge, 45° bevel, 1 inch Hamilton Co 7803-05
Glass 20.0 μL microcapillary pipettes (optional) Kimble Chase 71900-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lane, M. A., Fuller, D. D., White, T. E. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Trends in neurosciences. 31, 538-538 (2008).
  2. Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin. Chest. Med. 15, 675-675 (1994).
  3. Miller, R. G., Rosenberg, J. A., Gelinas, D. F. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
  4. Mitsumoto, H., Chad, D. A., Pioro, E. P. Amyotrophic lateral sclerosis. Davis, F. A. Philadelphia. (1998).
  5. Tandan, R., Bradley, W. G. Amyotrophic leteral sclerosis: Part 2. Etiopathogenesis. Annals of neurology. 18, 419-419 (1985).
  6. Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the mechanisms involved in motor neuron degeneration in ALS. Annu Rev Neurosci. 27, 723-723 (2004).
  7. Rosen, D. R., Siddique, T., Patterson, D. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362, 59-59 (1993).
  8. Bruijn, L. I., Becher, M. W., Lee, M. K. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-327 (1997).
  9. Gurney, M. E., Pu, H., Chiu, A. Y. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
  10. Howland, D. S., Liu, J., She, Y. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proc Natl Acad Sci. 99, 1604-1604 (2002).
  11. Nagai, M., Aoki, M., Miyoshi, I. Rats expressing human cytosolic copper-zinc superoxide dismutase transgenes with amyotrophic lateral sclerosis: associated mutations develop motor neuron disease. J. Neurosci. 21, 9246-9246 (2001).
  12. McDonald, W., Becker, D. Spinal cord injury: promising interventions and realistic goals. Am. J. Phys. Med. Rehabi. I82, S38-S38 (2003).
  13. Sandrow-Feinberg, H. R., Zhukareva, V., Santi, L. PEGylated interferon-beta modulates the acute inflammatory response and recovery when combined with forced exercise following cervical spinal contusion injury. Experimental neurology. 223, 439-451 (2010).
  14. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1433 (2000).
  15. Lane, M. A., Lee, K. Z., Fuller, D. D. Spinal circuitry and respiratory recovery following spinal cord injury. Respiratory physiology & neurobiology. 169, 123-123 (2009).
  16. Lepore, A. C., Rauck, B., Dejea, C. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature. 11, 1294-1294 (2008).
  17. Rao, M. S. Multipotent and Restricted Precursors in the Central Nervous System. Anat Rec. 257, 137-137 (1999).
  18. Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. Glial- restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells. Dev Biol. 188, 48-48 (1997).
  19. Suzuki, M., Tork, C., Shelley, B. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 8, 20-20 (2007).
  20. Lepore, A. C., Haenggeli, C., Gasmi, M. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain research. 1185, 256-256 (2007).
  21. Veldink, J. H., Bar, P. R., Joosten, E. A. Sexual differences in onset of disease and response to exercise in a transgenic model of ALS. Neuromuscul Disord. 13, 737-737 (2003).
  22. Shumsky, J. S., Lepore, A. C. Transplantation of Neuronal and Glial Restricted Precursors into Contused Spinal Cord Improves Bladder and Motor Functions, Decreases Thermal Hypersensitivity, and Modifies Intraspinal Circuitry. J. Neurosci. 25, 9624-9624 (2005).
Intraspinale Cel Transplantatie voor Targeting Cervicale ventrale hoorn van Amyotrofische Lateraal Sclerose en traumatisch ruggenmergletsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lepore, A. C. Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (55), e3069, doi:10.3791/3069 (2011).More

Lepore, A. C. Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (55), e3069, doi:10.3791/3069 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter