Summary
השתלת מבשר עצבית היא אסטרטגיה מבטיח הגנה ו / או החלפת אבוד / נוירונים מתפקדת צוואר הרחם מנוע הסרעפת של פגיעה בחוט השדרה (SCI) לבין הנוירון המוטורי הפרעה, amyotrophic laterals טרשת (ALS). אנו מספקים פרוטוקול למסירה התא בחוט השדרה הצווארי קרן הגחון במודלים של מכרסמים ALS ו SCI.
Abstract
פשרה הנשימה עקב אובדן הסרעפת הנוירון המוטורי היא תוצאה מתישה של חלק גדול של פגיעה בחוט השדרה טראומטי האנושית (SCI) במקרים 1 ו - הוא הגורם האולטימטיבי של מוות בחולים עם הנוירון המוטורי הפרעה, amyotrophic laterals טרשת (ALS) 2.
ALS היא מחלה נוירולוגית קטלנית אשר מאופיין ניוון מהיר יחסית של העליון הנוירונים המנוע נמוך יותר. חולים להיכנע בסופו של דבר המחלה על 2-5 שנים בממוצע לאחר האבחון בגלל שיתוק נשימתי כתוצאה מאובדן innnervation הנוירון המוטורי של הסרעפת הסרעפת 3. הרוב המכריע של המקרים הם ספורדיים, ואילו 10% הם של הטופס משפחתית. כעשרים אחוזים ממקרי משפחתית מקושרים מוטציות נקודתיות שונות בגן Cu / Zn superoxide dismutase 1 (SOD1) על כרומוזום 21 4. העכברים הטרנסגניים 4,5 ו - 6 חולדות נושאת מוטציה SOD1 האנושי גנים (G93A, G37R, G86R, G85R) נוצרו, ולמרות קיומם של מודלים של בעלי חיים אחרים של אובדן הנוירון המוטורי, כרגע המודלים הנפוצים ביותר של המחלה .
פגיעה בחוט השדרה (SCI) היא קבוצה הטרוגנית של מצבים כתוצאה מטראומה פיזית חוט השדרה, עם תוצאה תפקודית משתנה בהתאם למיקום סוג, וחומרת הפציעה 7. עם זאת, כמחצית האדם במקרים SCI להשפיע על אזורים צוואר הרחם, וכתוצאה מכך תפקוד הנשימה מתישה בשל אובדן מנוע הסרעפת נוירון ופגיעה יורד אקסונים bulbospinal הנשימה 1. מספר מודלים של בעלי חיים של SCI פותחו, עם הנפוצים ביותר ואת קלינית רלוונטית להיות contusion 8.
השתלה של מעמדות שונים של תאים עצביים מבשר (NPCs) היא אסטרטגיה טיפולית מבטיחה לטיפול פציעות CNS טראומטית ניוון מוחיים, כולל ה-ALS ו SCI, בגלל היכולת להחליף neuroprotection אבד או CNS מתפקדת סוגי תאים, מספקים, ולספק גורמים גן עניין 9.
מודלים בבעלי חיים של שני מחא ו SCI יכול מודל היבטים קליני רלוונטי רבים של מחלות אלו, לרבות הפסד הנוירון המוטורי הסרעפת פשרה בדרכי הנשימה עקב 10,11. כדי להעריך את היעילות של NPC מבוססי אסטרטגיות על תפקודי נשימה אלה במודלים של בעלי חיים מחא ו SCI, התערבויות הסלולר יש להפנות במיוחד אזורים המכילים טיפולית יעדים רלוונטיים, כגון נוירונים מנוע הסרעפת. אנו מספקים פרוטוקול מפורט להשתלה, רב סגמנטלי intraspinal של NPCs לתוך העניין חוט השדרה הצווארי הגחון אפור של מודלים ניווניות כגון SOD1 לעכברים וחולדות G93A, כמו גם חולדות חוט השדרה נפגע עכברים 11.
Protocol
שיטות
1. תא הכנה
כדוגמה, נתאר את הליך הכנת ובתאים גליה 12 להשתלה בגלל הניסיון שלנו עם סוג זה התא. עם זאת, הפרטים של הפרוטוקול, כולל אמצעי ושימוש טריפסין, למשל, יהיה תלוי בסוג התא מסוים בשימוש להשתלה.
- טרום חם כל פתרונות 37.0 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- יש לשטוף את הבקבוק עם 2X HBSS. הוסף 5.0 mL/T-75 בקבוק של 0.05% טריפסין / EDTA. דגירה בקבוק במשך 3 דקות 37.0 ° C חממה. Triturate 3X בעדינות בקבוק עם 5 או 10 מ"ל פיפטה.
אופציונלי: הוסף 5.0 mL/T-75 בקבוק של 1.0 מ"ג / מ"ל סויה מעכב טריפסין ב DMEM/F12.
- יש לשטוף את כל הבקבוק 2X ב 5.0 מ"ל של מדיום. בריכת תאים ושוטף. שמור את התאים על קרח את כל הצעדים הבאים.
- ספין על 200-300 גרם במשך 5 דקות בתוך צינור חרוטי: רצוי צנטריפוגות מקורר 4 ° C. למזוג (ולשמור) supernatant. Re-להשעות תאים 1.0 מ"ל של מדיום, ולהעביר צינור Eppendorf 1.5 מ"ל.
- ספירת תאים עם hemocytometer באמצעות Trypan כחול לקבוע כדאיות.
- ספין שוב צינור 1.5 מ"ל (800 סל"ד במשך 10 דקות: רצוי צנטריפוגות מקורר 4 ° C). למזוג (ולשמור) supernatant.
- Re-להשעות תאים בנפח הסופי הרצוי של המדיום כדי להשיג צפיפות התאים המתאימים.
- הפץ השעיות התא צינורות מרובים 1.5 מ"ל Eppendorf. שמור את התאים על הקרח רטוב עד להשתלה.
אין להשתמש צינורות 0.75 מ"ל, כמו מזרק המילטון / מחט לא יכול להתאים עמוק לתוך הצינור הזה. זריקות מרובות צפויה להתבצע במהלך המפגשים הניתוח, ואף אחד רוצה להימנע מטריד את הצינור זהה של תאים פעמים רבות. נסו להכין נפח לפחות 50% יותר מאשר תא ההשעיה היא זקוקה. שמור על הקרח התאים ברחבי המושב הניתוח. השתלת תאים בתוך 4-5 שעות הכנת תרחיפים תא כדי להבטיח את יכולת הקיום של תאים הגדולה שלאחר ההשתלה.
2. הכנה לפני הניתוח
- התנהגות רלוונטית התנהגות הערכות המחקר לפני הניתוח.
- דיכוי המערכת החיסונית: ציקלוספורין תת עורית (CSA: 10.0 מ"ג / ק"ג משקל גוף) או intraperitoneal (IP) FK-506/Rapamycin (1.0 מ"ג / ק"ג משקל גוף) יש להתחיל לפחות 3 ימים לפני ההשתלה, ויש נתון יומי עד להקריב. מינהל במי השתייה (במקום זריקות יומיות) לא מומלץ. CSA הוא הבחירה החיסון שלנו כאשר השתלת מכרסם הנגזרות תאים, בעוד FK-506/Rapamycin הבחירה שלנו, כאשר האדם הנגזרות השתלת תאים.
- החיטוי כלים כירורגיים לפני הניתוח. הכינו מקום נקי ומסודר לעשות ניתוח, כמו גם מקום מסודר לשים כלים. מעקר חרוזי זכוכית שימושית גם. שמור את כל הכלים נקיים (במיוחד rongeur) במהלך הניתוח, כמו זו יהפכו את התהליך הרבה יותר קל. כל חומר המשמש במהלך ההליך הכירורגי צריך להיות סטרילי.
- מכשירים שלא ניתן לעקר כגון מיקרוסקופ כירורגי יש לנגב את בחומר חיטוי מתאים מטפל מכוסה חומר סטרילית (גזה למשל), כך מנתח, פעם לבש עם כפפות סטריליות, לא לזהם שלו / שלה כפפות.
- המנתח צריך לשטוף שלו / שלה הידיים בחומר חיטוי (לשפשף chlorhexidine) לפני תחילת הניתוח. המנתח יהיה ללבוש כפפות סטריליות, facemask, ואת חלוק נקי.
3. ניתוח: בעלי חיים הכנה כירורגיה
בעלי חיים הכנה:
- לשקול בעלי חיים, ולנהל המינון המתאים של הרדמה: שאיפה Isofluorane או קוקטייל הרדמה (שיישלח באמצעות כתובת IP) של [maleate acepromazine (0.7 מ"ג / ק"ג), קטמין (95 מ"ג / ק"ג), ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג)].
- הבוהן קורט ו / או להשתמש רפלקס palpebral (נגיעה העפעף העליון עם המוליך כותנה שקצהו לצפות מהבהב) כדי לקבוע אם החיה היא בהרדמה כראוי. קרניות צריך להיות מוגן על ידי יישום משחה דמעה מלאכותית לפני הניתוח.
- לגלח את השיער עם מכונת גילוח חשמלית (מצורף אין צורך). שבי מ מקורי מעט אוזניים לאמצע הגב של החיה. שבי היטב, להסיר שיער לחתוך מן העור כדי למנוע שיער להיכנס החתך. הכנה כירורגית יש לבצע מהמקום שבו יבוצע הניתוח, כדי למנוע זיהום של האתר כירורגית עם שיער תועה.
- משרים גזה עם פתרון Povidine-יוד מחטא, ולהחיל על העור מעל האזור מגולח. האתר כירורגית צריך להשתפשף לפחות פעמיים עם פתרון Povidine-יוד, נזהר לקרצף ממרכז האתר כלפי הפריפריה. האתר לאחר מכן ניתן לשטוף עם אלכוהול 70% או לשפשף קוטל חידקים מדולל. האזור צריך להיות מכוסה בסדינים מעוקרים.
- במהלך הניתוח, השימוש חימום אני כריתזה מאוד מומלץ לשמור על טמפרטורת גוף נורמלית של החיה. בנוסף, טמפרטורת הגוף צריכה להיות במעקב. מניחים על משטח החי גזה מגולגל. עבור עכברוש מבוגר, תחבושת התגלגל להיות ~ 1.0 אינץ בעובי ו ~ 6.0 ס"מ באורך. זו כרית Tape לעלות הניתוח כך לא זז. מניחים על משטח חיה ברמה של החזה / כתף. הושט את שתי הידיים על כרית, קלטת את הנשק לעלות הניתוח. הרעיון הוא לתמוך בעמוד השדרה הצווארי, כך שלא קל לעבוד לאורך הניתוח מאז חבל צוואר הרחם נמצא עמוק מתחת לפני השטח של העור.
כירורגיה:
- על הגדלה מיקרוסקופ הנמוך ביותר (אנו משתמשים הגדלה x 8), השתמש להב סכין המנתחים לבצע חתך קו האמצע. מתיחת עור רוחבית עם היד השנייה כדי להפוך את העור מתוח (מה שהופך את העור קל יותר לחתוך), ולעשות חתך מבסיס הגולגולת עד עצם השכמה. (ראה תרשים 1)
- השתמש בלהב סכין המנתחים לבצע חתך דרך 3 שכבות שרירים על עמוד השדרה. קצת לסחוט את השריר (מ לרוחב המדיאלי) משני הצדדים עם היד השנייה. הקפד ללחוץ בחוזקה מספיק עם אזמל כדי לחתוך את כל שכבות השריר עם המספר הנמוך ביותר של קיצוצים ככל האפשר, כך חתכים השריר לא יהיה משוננת, מה שהופך את תפירת בסוף הניתוח קל יותר. עם זאת, לא ללחוץ חזק מדי כדי למנוע יצירת נזק ברקמות עמוקות יותר (עמוד השדרה).
- עם שני שקצהו כותנה applicators, להשתמש תנועת פיתול להפריד השריר שמעל השריר paraspinal מ. אפשר להיות נמרצת כאן. אין לחתוך או לקרוע, כמו זה יגרום לדימום. פיתול תנועה עם applicators יהיה יפה להקניט את הרקמה בנפרד מבלי לגרום נזק או דימום. אם מתרחש דימום בכל שלב של הניתוח, עדיף להיות סבלני. אל תנסה לרוץ קדימה עם הרבה דם בגלל דימום יהיה מעורפל חזון של שדה כירורגי. צריבה או לחץ האור יכול להיות מיושם על האתר של דימום, אבל אנו מוצאים סבלנות כי הוא הכי טוב. בעזרת תרגול, צריך להיות דימום מועט או ללא ברחבי ניתוח זה.
- לסגת שריר עם 4 retractors תוצרת בית (ראו תרשים 2). Retractors אלו יכולים להיות עשויים מהדקים חסון בצורת לתוך מפשק (ראה איור 2-הבלעה). החיטוי אלו לפני הניתוח. יש להקפיד כדי להקהות את הקצוות של retractors כדי למנוע נזק לרקמות. עניבה מחרוזת מפשק. חשיפה צריכה להיות מרובע / מלבן בצורת. צורה זו יכולה להיות מושגת על ידי משיכת עד 4 פינות באמצעות 4 retractors. Tape מחרוזת לעלות כדי להבטיח retractors (ראה איור 2). , זמין מסחרית retractors יכול לשמש גם, אבל אנחנו מעדיפים שלא להשתמש בהם. זה חיוני כדי ליצור שדה כירורגי טוב כדי לראות בבירור לאורך כל הניתוח. אל "עיוורת" להמשיך הלאה.
- שריר paraspinal נקה מפני השטח הגבי של עמוד השדרה. כדי להתמודד עם שרירים paraspinal על פני השטח הגבי של עמוד השדרה, ישנן 2 אסטרטגיות פוטנציאליות. עבור האסטרטגיה הראשונה, להשתמש עכברוש שיניים מלקחיים ובינוניות מספריים באביב להסיר שריר paraspinal מפני השטח של חוליות הגב. נסו לבצע חתכים קרוב מאוד העצם טוב יותר לחשוף את פני העצם. לבצע חתכים מקבילים על פני השטח של החוליות, אך לא לכרות את חבל הטבור. לגבי הגישה השנייה, לעשות חתך קו האמצע בשריר para-השדרה, לסגת רוחבית עם retractors קטנים יותר. לפי הגישה השנייה, השריר לאחר מכן ניתן sutured שוב ביחד לאחר הניתוח.
- משטח נקי של העצם בחוליות היטב. השתמש rongeur (מכשיר כירורגי החשוב ביותר) כדי להתרחק מרמות שריר C4, C5 ו C6 (ראה איור 3). זה, כמובן, תלוי ברמות השדרה אשר ממוקדות. בעת השימוש rongeur ביד אחת, מאובטחת עמוד השדרה כולו על ידי אוחז שרירים על תהליך C2 עם עכברוש שיניים מלקחיים ביד אחרים. C2 היא תהליך מקורי גדול בתחום כירורגית. C3 הוא מעט מתחת לשריר וכן. C4, C5 ו C6 קל לגשת משום שיש להם שריר קטן המכסה אותם.
- התחל עם laminectomy של C5. שוב, מאובטח על ידי החזקת C2 עם עכברוש שיניים מלקחיים. תפוס lamina כולו (ראה דיאגרמה: לתפוס ליד קו האמצע) עם rongeur. Rongeur קבוצה כל כך בכלי זה לחלוטין בניצב לציר של עמוד השדרה. לאט לאט למעוך lamina. אין לדחוף לתוך חוט השדרה, שכן זה יגרום נזק לרקמות השדרה. קראש ומשוך בעדינות פיסת העצם השבורה של מעלה. Rongeur צריך למחוץ חתיכת כך ניתן בקלות להתרחק להסיר. אם פיסת עצם היא עדיין מחוברת לשאר lamina, אינם משיכה כמו זה יגרום לדימום וכן פגיעה אפשרית בחוט השדרה. Rongeur צריך להיות נקי וחד. מכשירים כגון rongeur יש לשטוף / ניגב עם תמיסת מלח סטרילית, אשר יכול להינתן בקערה סטרילי (ראה איור 4).
עבור הפתיחה הראשונית של laminectomy, מיצוב perpen rongeurdicular אל עמוד השדרה עדיפה. צעד זה אז יכול להיות בעקבות נטילת קטן "טועמת" להאריך את laminectomy ידי הוספת rongeur בעדינות מתחת לעצם עם זווית של כ 30-60 מעלות ביחס למשטח חוט. - הרחבת laminectomy לכל C4-C6 רבדים. הפוך את פתח אחד מתמשך העצם מעל שלוש רמות השדרה. היקף laminectomy ניתן להתאים מבוסס על המיקום הרצוי (ים) של הזרקת intraspinal.
- אין להאריך laminectomy רחוק מדי רוחבית, כי זה יגרום לדימום. על מנת למקד את קרן הגחון, באתר ההזרקה הוא המדיאלי יחסית, ולכן אין צורך להרחיב laminectomy רחוק רוחבית. (ראה תרשים 5)
- הגדל את ההגדלה ל ~ 15 x.
- נקו את רקמת החיבור (ואת הדם הקרוש אפשרי) על גבי הדורה עם חדות / סטרייט מלקחיים # 5. ההבדל בין רקמת חיבור לבין הדורה צריך ללמוד עם ניסיון.
- לחרות הדורה, שכבת קרום המוח קשה מאוד, גם עם מיני האביב מספריים או microknife. בצע חתך מקביל לציר של עמוד השדרה המדיאלי רק לאזור הכניסה של שורשונים הגבי. זה יאפשר אחד ליעד צופר הגחון. (ראה איור 6)
- שימוש חד / דו # 5 מלקחיים לתפוס מעט להרים את הדורה של חוט השדרה. אין קמצוץ / לפגוע בעמוד השדרה. זה לוקח חלק באימון. ודא חתכים עם מספריים או באביב microknife קטן מאוד. לא לפגוע בעמוד השדרה.
- הרחבת החתך מעט ציר מקורי-הזנב. המתח דורא יהיה מעט נפרד הדורה ליצור חשיפה נאה של חוט השדרה.
- ודא חתכים בכל האתרים המתאימים כל הזרקה המיועד. דורה יש מראה שקוף מעורפל, בעוד משטח חוט השדרה יש בהירים בצבע לבן המראה. אחת תצטרך ללמוד להבחין אלה בנפרד. מומלץ לא לנסות להזריק דרך הדורה עם מחט הזריקה. דורה היא קשה, כך יהיה קשה לחדור דרכו. בנוסף, חודרות דרך הדורה יכול להשפיע על מסלול של הכניסה של מחט ועל כן משפיע על משלוח ממוקד אנטומית של תאים.
- מזריקים תאים בילטרלי ב 3 רמות (6 אתרי סה"כ) כדי למקד אזור גדול של הרחבת צוואר הרחם. מספר ומיקום (ים) של זריקות, כמובן, תלוי בניסוי ספציפי.
- לאחר פירסינג הדורה, הנוזל השדרתי יהיה לשפוך. משטח יבש של חוט וחשיפה שלם עם גאזה או כותנה שקצהו המוליך.
- עבור זריקה התא, השתמש 10.0μL המילטון gastight RN מזרק.
- צרף 33-מד / 45 מעלות משופעים מחט מתכת RN המילטון. המחט צריכה להיות חדה. השתמש באותה מחט רק ~ 20 זריקות (המחט תהיה חדה יותר עם זריקות פחות). אפשר גם להשתמש צינורות זכוכית משך נימי עבור מחטים. השתמש אפוקסי לצרף קצה של כוס משך את מחט מד 26-מתכת קהה המילטון. טרים קוטר קצה החיצוני μL 75.0-100.0 ~ (תלוי בקוטר של תאים: אחד לא רוצה לפגוע בתאים במהלך תהליך של הזרקה) באמצעות מיקרוסקופ כירורגי והחלק מיקרומטר. אנו מעדיפים את 33-מד מחטים מתכת.
- תאים תיפול מתוך ההשעיה בקלות בתוך הצינור Eppendorf על הקרח. מיד לפני טעינת מזרק זריקה, לטפוח בעדינות צינורית עד התאים לחזור לתוך ההשעיה. אל קפיצי גם באינטנסיביות כמו זה יהיה לפגוע בתאים ו / או לגרום בועות. לחלופין, להשתמש 20.0μL פיפטה איש כדי לערבב בעדינות תאים: השעיה פיפטה תא אחד או שניים בלבד פעמים למעלה ולמטה.
- טען נפח מספיק ההשעיה תא עבור אתר אחד בלבד ההזרקה. תאים תיפול מתוך ההשעיה בתוך מזרק זריקה אם מתכננת לעשות זריקות מרובות. לאט לאט לקחת את התאים לתוך מזרק כדי למנוע בועות ו / או נזק לתאים. במיוחד עבור ובתאים גליה כי אנו עובדים עם במעבדה שלנו, אנחנו להזריק 2.0 μL ההשעיה תא בדילול של 50,000-75,000 תאים לכל μL 1.0 על 2-5 דקות. מצאנו כי 2uL/site לא לגרום נזק לרקמות בחוט השדרה הצווארי. במקום זאת, מנסיוננו עולה כי מאוד להגדיל את מספרם של התאים בכרך זה (במיוחד אם הם גדולים יותר מאשר גודל אבות גליה שלנו: 10.0 -20.0 מיקרומטר קוטר) עלול לגרום נזק parenchyma חוט השדרה. ערכנו את תא נרחב מינון הניסוי כדי לקבוע את מספר אופטימלי של תאים להזריק בכל אתר (לפחות בחוט השדרה הצווארי ללא פגע). הפרמטרים חייבים להיות נחושים לסוג תא מסוים במצב המחלה.
- בשורה במקביל מזרק / מחט עם ציר עמוד השדרה כראוי היעד באזור אנטומי הרצוי. המחט בזווית מספיק (כ 80 מעלות ביחס לשולחן כירורגית) לא להקפיץ את הראש היקף הניתוח, אבל קרוב ל 90 מעלות האפשרי. קצה תחתון לכיוון המשטח הגבי חוט השדרה באמצעות מיקרוסקופ (ראה איור 7).
- מטרת המדיאלי רק כניסה Zo מחטנה של שורשונים הגב (ראה איור 8). לגעת בעדינות פני השטח של חוט השדרה עם קצה של מחט. קצת לדכא חוט השדרה באמצעות מחט. לחזור בו מחט עד חוט השדרה הוא לקדמותו. הקלטת עמדה זו כמו z = 0.0 באמצעות סרגל על micromanipulator.
הערה: אנו לא שגרתי לייצב את עמוד השדרה הצווארי במהלך זריקות חוט השדרה. באמצעות משטר ההרדמה שלנו, תנועה מעלה מטה של חוט השדרה הצווארי עקב נשימות כבדות מעולם לא הייתה בעיה. עם זאת, אם נשימות כבדות בעיה, עמוד השדרה יכולים להיות מיוצב באמצעות מסגרת מותאמת אישית על ידי לחיצה בעדינות העצם שמסביב para-השדרה השריר ברמות C2 ו C7 באמצעות מלקחיים שונה, נזהר לא לרסק את העצם בחוליות או לפגוע הרקמה הבסיסית חוט השדרה. אם הנשימה של החיה הופך רדוד במהלך ההליך, תרופות הרדמה יותר צריך להינתן. הניתוח אמור להיות מופרע עד מטוס כירורגית של הרדמה כבר השיגה מחדש לפני חידוש. - המחט מעט נמוך לתוך חוט השדרה. הקפד להסתכל במיקרוסקופ בעוד עושה את זה. מחט התחתון לעומק של 1.5 מ"מ למקד קרן הגחון בחולדות מבוגר. מחט התחתון לעומק של 0.75 מ"מ למקד קרן הגחון בעכברים בוגרים. (ראה איור 9). מספרים אלה מייצגים עומק של הבוגרים (לפחות 3 חודשים) נקבה וזכר Sprague-Dawley חולדות (250-450 גרם) C57BL / 6 עכברים (20-35 גרם). כמובן, עומק בעמדה לרוחב תלוי באזור הספציפי של עניין. נא לא להפריע מערכת / ניתוח או הזרקה לוח שולחן הניתוח בעוד מחט מוכנס לתוך חוט השדרה, כדי למנוע נזק לרקמות השדרה.
- המתן שתי דקות (יותר הוא אפילו יותר טוב) לאחר הורדת המחט לעומק הרצוי לפני הזריקה.
- הזרק 2.0 μL מעל 2-5 דקות בקצב קבוע באמצעות בקר המשאבה.
- המתן שתי דקות (יותר עדיף) לאחר ההזרקה לפני הסרת המחט לאט מן חוט השדרה.
- מזרק נקי עם dH2O לאחר כל הזרקה על מנת למנוע סתימת. לאט לאט לגבש ולגרש 3-5 פעמים. אל לצייר באוויר לתוך המזרק.
- חזור אל ההגדלה הנמוך ביותר (אותו לשמש בתחילת הניתוח: ~ 8 x). תפר הדורה נסגר באמצעות תפרים 9-0, אבל זה בהחלט לא הכרחי. זה גם מאתגר. אנו sutured הדורה סגור בעבר, אך אין אנו מוצאים הבדל בהתנהגות בעלי חיים, הישרדות השתלת או היסטולוגיה חוט השדרה כאשר הדורה לא סגור עם תפר. דורה יכול להיות מכוסה בחתיכת המגן של קצף ג'ל סטרילי. הקצף הג'ל צריך להיות ממוקם ישירות על גבי האתר את החתך dural. עם זאת, חשוב לטפל בכך שלא במפתיע למשוך את הקטע הזה של gelfoam מעל פני השטח של חוט השדרה במהלך לנתיחה שלאחר זלוף, כמו gelfoam יכול לפעמים בחוזקה לדבוק פני חוט השדרה.
- אופציונלי: שריר paraspinal תפר נסגר עם תפר 4-0.
- תפר נסגרה שלושה שרירים השכבות שמעליה בעת ובעונה אחת עם תפר 4-0. תפר השרירים בשלושה מוקדים בציר מקורי, הזנב (ראה תרשים 10).
- העור סיכות סגור עם 9.0 פצע קליפים מ"מ (ראה איור 11). הדקו סיכות עם מחזיקי מחט, כדי למנוע מן החי חליצה סיכות לפני ריפוי הפצע מלא. שטח סיכות 0.5cm כ לגזרים. אל מעל להדק את הפצע קליפים, כמו זה יכול להוביל לריפוי נמק לקוי.
- החל Povidine-יוד פתרון חיטוי לפצוע בשטח עם גזה ספוג.
- אפשר חיה להתאושש על מחזורי כרית מים חמים. תן תת עורית בהזרקה של פתרון Ringer Lactated של סטרילית (5.0 מ"ל של עכברוש: 0.5 מ"ל של העכבר) מיד לאחר הניתוח. מעקב זריקות יכול להיות גם בתנאי אם החיה מופיעה מיובש ו / או אדיש. טיפול אנטיביוטי מניעתי באמצעות 6.0mg/kg של Cefazolin ניתן להשתמש, אולם מנסיוננו עולה כי הליך זה השתלת אינו תוצאה של זיהומים לאחר ניתוח אם הטכניקה aseptic לאחר מכן וכל המכשירים / ציוד כירורגי הם מעוקרים. אם אלה הם אמצעי הזהירות הבאים, הממשל אנטיביוטיקה אינה מומלצת.
- המשך CSA או FK-506/Rapamycin יומי עד להקריב.
- הניתוח כולו צריך לקחת פחות מ ~ 45 דקות (עם 6 אתרי הזרקה). אחרת, חיה יתחיל להתעורר לנשום בכבדות, אשר תשפיע לרעה על זריקה לתוך עמוד השדרה.
עצות לפתרון בעיות עבור בעיות הקשורות שלבים שונים של הפרוטוקול
חוסר הישרדות התא / עני: זה כנראה לא בעיה טכנית הקשורה זריקה, אבל הוא כנראה בשל המאפיינים של סוג התא להיות מוזרק ו / או משטר immunesuppression. בעיות אלה יש צורך להעריך באופן אמפירי על סוג תא מודל החיה בסיס ספציפי. הזמינות של מספר החיסון לקוי מודלים חולדה ועכברזמינים גם לעקוף בעיות עם immunesuppression, אולם בעלי חיים אלה גם נוכח קשיים כגון עלות, את הצורך בשמירה על המושבה, והזהירות נוספים הנדרשים במהלך הניתוח ודיור.
גירעונות פונקציונלית נצפתה הניתוח הבאים: מניסיוננו, אנחנו לא הבחינו את המופע של כל הגירעונות פונקציונלי ביצוע הליך זה כאשר העריכו באמצעים כמו forelimb וכוח hindlimb אחיזה הסרעפת עצב / הסרעפת תרכובות פעולה פוטנציאלים שריר, אפילו עם 6 זריקות אתרים ( 2μL של כל אחד) בחוט השדרה הצווארי. הרס רקמות גם לא נצפו. סיבות אפשריות להתרחשות של בעיות אלה כוללות: לא באמצעות מחט מד הציע, הזרקת כמויות גדולות ו / או מספרי התא, פגיעה מכוונת הנגרמת על ידי laminectomy פסולים, חוסר עידון תוך חיתוך הדורה (כגון צובט את כבל עם # 5 מלקחיים) או במהלך תהליך של החדרת מחט המילטון לתוך חוט השדרה (להחליף מחט משעמם).
תאים לא נמצא בחומר האפור הגחון: זה יכול לקרות עקב מספר בעיות. אם הזריקה מחטיא את המטרה מדיאלית או רוחבית, הקפד היטב בשורה המקבילה מערכת הזרקה עם ציר של חוט השדרה, והכנס את המחט מדיאלי רק כניסתם של שורשונים הגבי. אם הזריקה מחטיא את המטרה dorsally או ventrally, הקפד לאפס קריאה Z-ציר כאשר קצה המחט רק בקושי נוגע השטח הגבי של חוט השדרה, השתמש במחט הציע המילטון עם שיפוע המתאים (שפוע עוד יכול להשפיע על המיקוד), להבטיח כי חוט השדרה לא לדחוס כאשר החדרת המחט, לטפל בדיוק מדידת עומק באמצעות micromanipulator, ולהשתמש חיות בטווח המשקל שהציע. התאם את הטכניקה שלך בהתאם אם אתה עקבי הזרקת תאים במיקום (המחייב הערכה היסטולוגית ושינוי השיטה לאחר מכן). אם זריקות מפוזרים באופן אקראי על כל האתרים הזריקה שלך, אתה צריך להתאמן כדי לשפר את העקביות. אם התאים נוטים להיות ממוקמים בעיקר בהיבט הגבי של חוט השדרה לאורך המסלול מחט, לחכות עוד לפני ואחרי הזרקת תאים, ולהאריך את הזריקה בפועל על פני תקופה ארוכה של זמן.
4. נציג תוצאות:
עכבר הנגזרות ובתאים גליה הושתלו (50,000 תאים / אתר) לתוך קרן הגחון של ה-C4 ברמת חוט השדרה של חולדה מבוגר G93A SOD1. התאים המושתלים עכבר הנגזרות ניתן להבדיל בין רקמה עכברוש לארח באמצעות זיהוי הנוגדן עם העכבר ספציפית, M2. תמונה זו מראה את ההישרדות של M2 + השתלת תאים שמקורם ב 1 לחודש שלאחר ההשתלה (ראה איור 12). התאים נקודתיים בחומר האפור הגחון, אבל באתר ההזרקה מדיאלית החמיץ את קרן הגחון לרוחב (את המיקום של רוב הנוירונים המנוע הסרעפת: מסומן בקו מקווקו). היווצרות ציסטה לא נתפס כאשר 50,000 התאים הוזרקו לכל אתר, ואין ליקוי התנהגותי נבעה הליך ההזרקה. עם זאת, הזרקה של מספרים גבוהים בהרבה של תאים (מספר בפועל משתנה בהתאם לסוג התא, יש להעריך באופן שיטתי) גורם לנזק במקום ההזרקה ולאורך המסלול מחט (ראה איור 13: אימונוהיסטוכימיה עם הסמן astrocyte, GFAP) .
באיור 1. חתך ראשוני של העור. ביום הגדלה מיקרוסקופ הנמוך ביותר (אנו משתמשים הגדלה x 8), השתמש להב סכין המנתחים לבצע חתך קו האמצע. מתיחת עור רוחבית עם היד השנייה כדי להפוך את העור מתוח (מה שהופך את העור קל יותר לחתוך), ולעשות חתך (מצוין על ידי קו מקווקו עבה) מבסיס הגולגולת (ברמה של החלק האחורי של האוזניים) כדי השכמה (מסומנים על ידי קו מקווקו דק).
איור 2. חשיפה של שדה כירורגי. החשיפה כירורגית צריך להיות מרובע / מלבן בצורת. צורה זו יכולה להיות מושגת על ידי משיכת השרירים כלפי הסובבים 4 פינות באמצעות 4 retractors. מחרוזת Tape המצורפת retractors ללוח כירורגי כדי להבטיח retractors וראוי לשמור על שדה פתוח.
איור 2-הבלעה. Retractors לחשיפה של שדה כירורגי. Retractors משמשים לסגת השריר על מנת ליצור שדה כירורגי עם ראות ברורה הן של חוט השדרה ואת מרחב מספיק כדי לבצע ניתוח. Retractors יכול להתבצע על ידי עיצוב מהדקים חסון לצורה הרצויה וגודל. החיטוי retractors לפני לניתוח. עניבה מחרוזת מפשק.
דמות3. חוליות. להסרת בעקבות שריר paraspinal, לנקות ביסודיות את פני השטח הגבי של חוליות עם rongeur. Lamina בודדת ניתן לראות, כמו גם שורשונים הגבי נכנס בהיבט רוחבי של עמוד השדרה.
איור 4. Laminectomy. התחל laminectomy על חוט השדרה ברמה C5. עמוד השדרה מאובטח על ידי החזקת שמעל השריר ברמה C2 עם מלקחיים שיניים חולדה. תפוס lamina כולו (ראה דיאגרמה: לתפוס ליד קו האמצע) עם rongeur. Rongeur קבוצה כל כך בכלי זה לחלוטין בניצב לציר של עמוד השדרה. לאט לאט למעוך lamina. אין לדחוף לתוך חוט השדרה, שכן זה יגרום נזק לרקמות השדרה. קראש ומשוך בעדינות פיסת העצם השבורה של מעלה. Rongeur צריך למחוץ חתיכת כך ניתן בקלות להתרחק להסיר. אם פיסת עצם היא עדיין מחוברת לשאר רבדים, לא מושך כמו זה יגרום לדימום וכן פגיעה אפשרית בחוט השדרה. Rongeur צריך להיות נקי וחד.
איור 5. חשיפה של רקמת חוט השדרה laminectomy הבאה. הרחב laminectomy לחשוף את כל חוט C4-C6 בעמוד השדרה. ודא 1 פתיחת רציף בעצם מעל 3 רמות השדרה. אין להאריך laminectomy רחוק מדי רוחבית, כי זה יגרום לדימום. על מנת למקד את קרן הגחון, באתר ההזרקה הוא המדיאלי יחסית, ולכן אין צורך להרחיב laminectomy במידה לרוחב מלאה של העצם בחוליות.
איור 6. הגדלה גבוהה של פני השטח הגבי של חוט השדרה. בולטים כלי דם הגבי ניתן לראות רץ קו האמצע של חוט השדרה. דפוס זה כלי דם הוא ציין ברוב המקרים, עם זאת, חלק מבעלי החיים להציג מסלול ללא קו האמצע של כלי הדם. שורשונים הגבי ניתן לראות את ההיבטים לרוחב פני השטח של עמוד השדרה הגבי. ביחס הדורה שמעל חוט השדרה, העצבים האלה יש מראה מעורפל.
איור 7. ההתקנה הזרקה. Line מעלה במקביל מזרק / מחט עם ציר עמוד השדרה כראוי היעד באזור אנטומי הרצוי. המחט בזווית מספיק (כ 80 מעלות ביחס לשולחן כירורגית) לא להקפיץ את היקף הראש כירורגית, אלא קרוב ל 90 מעלות ככל האפשר (הפאנל השמאלי). טיפ הזרקת התחתון כלפי פני עמוד השדרה הגבי באמצעות מיקרוסקופ (פאנל מימין). לגעת בעדינות פני השטח של חוט השדרה עם קצה של מחט. קצת חבל לדכא עם מחט. לחזור בו מחט עד חוט השדרה הוא שטוח בחזרה למצב נורמלי. הקלטת עמדה זו z = 0.0 באמצעות סרגל על micromanipulator.
איור 8. הגדלה גבוהה של הזרקת מחט מטרת חוט השדרה המדיאלי רק לאזור הכניסה של שורשונים הגבי (מסומן בקו מקווקו).
איור 9. תרשים של עמוד השדרה: כיצד לכוון את האזור האנטומי של עניין כאשר מנסים למקד את קרן הגחון, לחרות הדורה מקביל לציר של עמוד השדרה המדיאלי רק לאזור הכניסה של שורשונים הגבי.. זה יאפשר אחד ליעד צופר הגחון. מחט התחתון לעומק של 1.5 מ"מ למקד קרן הגחון בחולדות מבוגרים (הגיל והמין של החיה לא עושה הרבה הבדל על עומק). מחט התחתון לעומק של 0.75 מ"מ למקד קרן הגחון בעכברים בוגרים. כמובן, עומק בעמדה לרוחב תלוי באזור הספציפי של עניין.
איור 10. סגירת האתר כירורגית. סגורים תפר three שריר שכבות שמעליה בעת ובעונה אחת עם תפר 4-0. תפר השרירים ב 3 מקומות ציר מקורי-הזנב.
איור 11. הידוק של העור. העור סיכות סגור עם 9.0 מ"מ קליפים הפצע. הדקו סיכות עם מחזיקי מחט, כדי למנוע את החיה מן חליצה סיכות לפני ריפוי הפצע מלא. שטח סיכות כ 0.5 מ"מ זה מזה.
איור 12. השתלה של אבות גליה לתוך קרן הגחון צוואר הרחם. 50,000 עכבר הנגזרות ובתאים גליה הושתלו קרן הגחון של ה-C4 ברמת חוט השדרה של חולדה G93A SOD1. M2 + עכבר הנגזרות התאים המושתלים שרדו חודש 1 שלאחר ההשתלה. התאים נקודתיים בחומר האפור הגחון, אבל באתר ההזרקה מדיאלית החמיץ את קרן לרוחב הגחון (מסומניםעל ידי קו מקווקו).
איור 13. פציעה רקמות להשתלה הבאה של מספרים גבוהים של תאים עצביים מבשר. הזרקה של מספרים גבוהים בהרבה של תאים (מספר בפועל משתנה בהתאם לסוג התא, יש להעריך באופן שיטתי) גורם לנזק במקום ההזרקה ולאורך המסלול מחט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבור מחקרים שכללו SOD1 לעכברים וחולדות G93A, גיל ומין להתאים את החיות בתוך קבוצה, ולהפיץ בעלי חיים בתוך החול אותו לקבוצות שונות. עדיף להשתמש בכל בעלי חיים ממין זהה בשני מחא ומודלים SCI כי תהליכי מחלה עשוי להיות שונה בין גברים לנשים, אך זה יכול להיות גם שימושי יש מספיק חיות מן המינים ניתן לזהות ספציפית מין אפקטים, כמו תופעה זו דווחה עם SOD1 חולדות G93A 13 ו SOD1 לעכברים G93A 14,15. קחו למשל את הגיל / נקודה של המחלה (ALS לבעלי חיים) או הזמן שלאחר פציעה (עבור דגמים SCI) להשתלה של תאים לתוך חיים. אסטרטגיה זו צפויה להשתנות בהתאם מנגנוני התא ספציפיים שפונים.
הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשתמש עכברוש והן צוואר הרחם עכבר מיתרי השדרה 11, כמו גם להשתלה לרמות אחרות של מיתרי חולדה ועכבר השדרה כגון רמות ובית החזה המותני 14. על מנת למקד מבנים אנטומיים ספציפיים (מלבד קרן הגחון) אלה ברמות שונות בעמוד השדרה, רצוי קודם לבדוק את המיקום המדיאלי / לרוחב ועומק של זריקות באמצעות צבע או באמצעים אחרים כדי להעריך את הדיוק של הקואורדינטות.
מדדי התוצאות כוללות ניתוח מפורט של גורל השתלת תאים, מדינות ביוכימיים, היסטולוגיים, ופונקציונלי של חוט השדרה, וכן שינויים התנהגותיים רלוונטיות למיקום של השתלה. הפרטים של בדיקות התנהגות, ניתוח היסטולוגית ואמצעים אחרים ניתחו את התוצאות הבאות השתלת צריך להיות מותאם לצורכי הניסוי / מודל.
לאחר הניתוח עוזר להרדים, להתגלח, "פתוח" ו - "לסגור" את בעלי החיים מועיל מאוד עבור חלקה לעבור את החיות ביותר האפשרית. בנוסף, עוזר כירורגי יכול לעזור המנתח להישאר סטרילי לאורך כל ההליך.
מספר ריכוז אופטימלי של התאים מוזרקים ישתנה בהתאם לגודל של התאים, המין של החיה הנמען, ומצב המחלה. לדוגמה, לעומת חוט השדרה שלם, גדל מספרם של תאים יכול להיות מועברת לתוך אתר SCI אם חלל יצרה כבר 16. עם זאת, פרמטרים ספציפיים צריך להיות מותאם באופן שיטתי לפני התחייבות מחקר גדול.
לפני עריכת מחקר גדול עם סוג NPC מסוים, להעריך את היעילות ארוכת הטווח של משטר דיכוי המערכת החיסונית. בנוסף, הישרדות התא עשוי להשתנות לכל סוג תא נתון בהתאם לדגם מחלה או העיתוי והמיקום של השתלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אני רוצה להודות: לכל חברי Lepore, Maragakis ו רוטשטיין מעבדות לדיון מועיל; ותיקי משותק של אמריקה ח קרייג Neilsen קרן למימון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| 0.05% Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor (optional) | Sigma-Aldrich | T-6522 | |
| Acepromazine maleate (0.7 mg/kg) | Fermenta Animal Health | ||
| Ketamine (95 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health | ||
| Xylazine (10 mg/kg) | Bayer AG | ||
| #11 Feather surgical blade | Electron Microscopy Sciences | 72044-11 | |
| Cotton-tipped applicators (6 inch) | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Rat-toothed forceps | Fine Science Tools | Rat: 11023-15; Mouse: 11042-08 | |
| Medium-sized spring scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| Mini spring scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | Rat: 16121-14; Mouse: 16221-14 | |
| Microknife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 12502-14 | |
| Suture: 4-0 | Vicryl | S-183 | |
| Staples: 9 mm | Autoclip | 427631 | |
| Stapler: 9 mm (Reflex #203-1000) | World Precision Instruments, Inc. | 5000344 | |
| Warm water pump (T/Pump) | Gaymar Industries | P/N 07999-000 | |
| Cyclosporin A: 250.0 mg/5.0 mL ampules | Novartis AG | NDC 0078-0109-01 | |
| FK-506 | LC Laboratories | F-4900 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| Injector | World Precision Instruments, Inc. | UMP2 | |
| Micro 4 Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMC4 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Kite-R | |
| 10.0 μL Hamilton syringe | Hamilton Co | 80030 | |
| Hamilton needles: 33-gauge, 45° bevel, 1 inch | Hamilton Co | 7803-05 | |
| Glass 20.0 μL microcapillary pipettes (optional) | Kimble Chase | 71900-20 |
References
- Lane, M. A., Fuller, D. D., White, T. E. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Trends in neurosciences. 31, 538-538 (2008).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin. Chest. Med. 15, 675-675 (1994).
- Miller, R. G., Rosenberg, J. A., Gelinas, D. F. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Mitsumoto, H., Chad, D. A., Pioro, E. P. Amyotrophic lateral sclerosis. Davis, F. A. , Philadelphia. (1998).
- Tandan, R., Bradley, W. G. Amyotrophic leteral sclerosis: Part 2. Etiopathogenesis. Annals of neurology. 18, 419-419 (1985).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the mechanisms involved in motor neuron degeneration in ALS. Annu Rev Neurosci. 27, 723-723 (2004).
- Rosen, D. R., Siddique, T., Patterson, D. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362, 59-59 (1993).
- Bruijn, L. I., Becher, M. W., Lee, M. K. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-327 (1997).
- Gurney, M. E., Pu, H., Chiu, A. Y. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
- Howland, D. S., Liu, J., She, Y. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proc Natl Acad Sci. 99, 1604-1604 (2002).
- Nagai, M., Aoki, M., Miyoshi, I. Rats expressing human cytosolic copper-zinc superoxide dismutase transgenes with amyotrophic lateral sclerosis: associated mutations develop motor neuron disease. J. Neurosci. 21, 9246-9246 (2001).
- McDonald, W., Becker, D. Spinal cord injury: promising interventions and realistic goals. Am. J. Phys. Med. Rehabi. I82, S38-S38 (2003).
- Sandrow-Feinberg, H. R., Zhukareva, V., Santi, L. PEGylated interferon-beta modulates the acute inflammatory response and recovery when combined with forced exercise following cervical spinal contusion injury. Experimental neurology. 223, 439-451 (2010).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1433 (2000).
- Lane, M. A., Lee, K. Z., Fuller, D. D. Spinal circuitry and respiratory recovery following spinal cord injury. Respiratory physiology & neurobiology. 169, 123-123 (2009).
- Lepore, A. C., Rauck, B., Dejea, C. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature. 11, 1294-1294 (2008).
- Rao, M. S. Multipotent and Restricted Precursors in the Central Nervous System. Anat Rec. 257, 137-137 (1999).
- Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. Glial- restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells. Dev Biol. 188, 48-48 (1997).
- Suzuki, M., Tork, C., Shelley, B. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 8, 20-20 (2007).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., Gasmi, M. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain research. 1185, 256-256 (2007).
- Veldink, J. H., Bar, P. R., Joosten, E. A. Sexual differences in onset of disease and response to exercise in a transgenic model of ALS. Neuromuscul Disord. 13, 737-737 (2003).
- Shumsky, J. S., Lepore, A. C. Transplantation of Neuronal and Glial Restricted Precursors into Contused Spinal Cord Improves Bladder and Motor Functions, Decreases Thermal Hypersensitivity, and Modifies Intraspinal Circuitry. J. Neurosci. 25, 9624-9624 (2005).
