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Medicine

Intraspinal Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस और अभिघातजन्य स्पाइनल कॉर्ड चोट में सरवाइकल ventral हॉर्न का लक्ष्य निर्धारण के लिए सेल प्रत्यारोपण

doi: 10.3791/3069 Published: September 18, 2011

Summary

तंत्रिका अग्रदूत प्रत्यारोपण की रक्षा और / या रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) और मोटर न्यूरॉन विकार, amyotrophic लेटरल काठिन्य (ए एल एस) में खो / बेकार गर्भाशय ग्रीवा श्वासपटलीय मोटर न्यूरॉन्स की जगह के लिए एक आशाजनक रणनीति है. हम सेल ए एल एस और एससीआई के कृंतक मॉडल में गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी वेंट्रल सींग प्रसव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.

Protocol

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तरीके

1. सेल तैयार

एक उदाहरण के रूप में, हम glial पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं इस सेल प्रकार के साथ हमारे अनुभव की वजह से 12 की तैयारी प्रत्यारोपण के लिए करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन करेंगे. हालांकि, प्रोटोकॉल विशेष, उदाहरण के लिए मध्यम और trypsin के उपयोग सहित विशेष सेल प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है प्रकार पर निर्भर करेगा.

  1. पूर्व गर्म 37.0 करने के लिए सभी समाधान डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में.
  2. HBSS साथ फ्लास्क 2X कुल्ला. 5.0 0.05% / trypsin EDTA के mL/T-75 फ्लास्क जोड़ें. 3 मिनट के लिए 37.0 ° सी इनक्यूबेटर में फ्लास्क सेते हैं. 3X धीरे 5 10ml या विंदुक के साथ फ्लास्क में महीन चुर्ण बनाना.

वैकल्पिक: जोड़ें 5.0 1.0 मिलीग्राम / DMEM/F12 में मिलीलीटर सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला के mL/T-75 फ्लास्क.

  1. 5.0 माध्यम की एमएल में प्रत्येक फ्लास्क 2X कुल्ला. पूल कोशिकाओं और rinses. बाद के सभी चरणों के लिए बर्फ पर कोशिकाओं रखो.
  2. शंक्वाकार ट्यूब में 5 मिनट के लिए 200-300 ग्राम में स्पिन: अधिमानतः अपकेंद्रित्र में 4 से ठंडा डिग्री सेल्सियस निथारना सतह पर तैरनेवाला (और बचाने के लिए). माध्यम की 1.0 एमएल में कोशिकाओं पुनः स्थगित करता है, और 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण.
  3. Trypan ब्लू का उपयोग करने के लिए व्यवहार्यता का निर्धारण hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गणना.
  4. 1.5 एमएल ट्यूब (अधिमानतः अपकेंद्रित्र में 4 से ठंडा डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए 800 आरपीएम) में फिर से स्पिन निथारना सतह पर तैरनेवाला (और बचाने के लिए).
  5. वांछित माध्यम की अंतिम मात्रा में कोशिकाओं उपयुक्त कक्ष घनत्व प्राप्त करने के लिए पुनः रोक देते हैं.
  6. एकाधिक 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूबों सेल निलंबन बांटो. प्रत्यारोपण जब तक गीला बर्फ पर कोशिकाओं रखो.

0.75 एमएल ट्यूबों का उपयोग करें, हैमिल्टन सिरिंज / सुई के रूप में गहराई से इस ट्यूब में फिट नहीं कर सकते मत करो. एकाधिक इंजेक्शन की संभावना शल्य चिकित्सा सत्र के दौरान बनाया जाएगा, और एक के लिए कई बार कोशिकाओं के एक ही ट्यूब परेशान से बचने चाहता है. सेल निलंबन के कम से कम 50% की तुलना में अधिक मात्रा की जरूरत है तैयार करने की कोशिश करो. सर्जरी सत्र भर में बर्फ पर कोशिकाओं रखें. सेल निलंबन की तैयारी के क्रम में के बाद प्रत्यारोपण की कोशिकाओं की सबसे बड़ी व्यवहार्यता आश्वासन के 4-5 घंटे के भीतर प्रत्यारोपण कोशिकाओं.

2. पहले सर्जरी के लिए तैयार

  1. सर्जरी से पहले प्रासंगिक आधारभूत व्यवहार आकलन आचरण.
  2. प्रतिरक्षा दमन: उपचर्म cyclosporine (सीएसए: 10.0 मिलीग्राम / शरीर के वजन के किलोग्राम) या intraperitoneal (आईपी) (1.0 मिलीग्राम / शरीर के वजन के kg) FK-506/Rapamycin कम से कम 3 दिनों के प्रत्यारोपण करने से पहले शुरू किया जाना चाहिए, और किया जाना चाहिए दैनिक बलिदान जब तक दिया. पीने के पानी (दैनिक इंजेक्शन के बजाय) में प्रशासन की सलाह नहीं दी है. सीएसए हमारी पसंद के immunosuppressant है जब कृंतक व्युत्पन्न कोशिकाओं रोपाई, जबकि FK-506/Rapamycin हमारी पसंद है जब मानव व्युत्पन्न कोशिकाओं रोपाई.
  3. सर्जरी से पहले शल्य चिकित्सा उपकरण आटोक्लेव. एक स्वच्छ और साफ करने के लिए सर्जरी करने के लिए जगह के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक uncluttered उपकरण डाल जगह तैयार करें. एक अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ ग्लास मनका भी उपयोगी है. सर्जरी के दौरान सभी उपकरण साफ (विशेषकर rongeur) के रखें, क्योंकि इस प्रक्रिया बहुत आसान कर देगा. कोई शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान प्रयोग किया जाता सामग्री बाँझ की जरूरत है.
  4. उपकरण है कि जैसे शल्य खुर्दबीन निष्फल नहीं किया जा सकता है एक उपयुक्त निस्संक्रामक के साथ नीचे सफाया करना चाहिए और बाँझ सामग्री (जैसे धुंध) के साथ कवर संभालती इतना है कि सर्जन, एक बार बाँझ दस्ताने के साथ पहना, उसका / उसकी दस्ताने नहीं दूषित करता है.
  5. सर्जन सर्जरी की शुरुआत से पहले एक निस्संक्रामक (chlorhexidine साफ़) के साथ उसकी / उसके हाथ धोने चाहिए. सर्जन बाँझ दस्ताने, एक facemask, और एक साफ गाउन पहनना होगा.

3. सर्जरी: पशु तैयार करना और सर्जरी

पशु तैयारी:

  1. पशु का वजन, और संज्ञाहरण की उचित खुराक प्रशासन: Isofluorane साँस लेना या संवेदनाहारी कॉकटेल (आईपी के माध्यम से दिया) [acepromazine maleate (0.7 मिलीग्राम / किग्रा), ketamine (95 मिग्रा / किग्रा), और (10 मिग्रा / किग्रा) xylazine].
  2. चुटकी पैर के अंगूठे और / या नेत्रच्छद प्रतिवर्त (कपास इत्तला दे दी निमिष निरीक्षण applicator के साथ ऊपरी पलक छू) का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए अगर ठीक anesthetized जानवर है. corneas सर्जरी से पहले एक कृत्रिम आँसू मरहम लगाने के द्वारा संरक्षित किया जाना चाहिए.
  3. वापस बिजली के रेजर (कोई लगाव की जरूरत है) के साथ बाल दाढ़ी. थोड़ा कान करने के लिए विजय - स्तम्भ से जानवर की पीठ के मध्य में दाढ़ी. अच्छी तरह दाढ़ी, और त्वचा से कट बालों को हटाने के लिए चीरा में हो रही है बालों को रोकने. शल्य चिकित्सा प्रस्तुत करने का क्षेत्र है जहां सर्जरी शल्य साइट के आवारा बाल के साथ संक्रमण से बचने के लिए प्रदर्शन किया जाएगा से दूर किया जाना चाहिए.
  4. Povidine आयोडीन एंटीसेप्टिक समाधान के साथ धुंध भिगोएँ, और मुंडा क्षेत्र पर त्वचा के लिए लागू होते हैं. शल्य साइट झाड़ी Povidine-आयोडीन समाधान के साथ कम से कम दो बार जाना चाहिए, परिधि की ओर साइट के केंद्र से हाथ धोने के लिए सावधान किया जा रहा है. साइट तो 70% शराब या पतला पदार्थविषयक साफ़ के साथ rinsed जा सकता है. क्षेत्र बाँझ पर्दे के साथ कवर किया जाना चाहिए.
  5. सर्जरी के दौरान, एक हीटिंग का उपयोग मैं पैडअत्यधिक जानवर के सामान्य शरीर के तापमान को बनाए रखने की सिफारिश की. इसके अलावा, शरीर के तापमान की निगरानी की जानी चाहिए. लुढ़का धुंध पैड पर रखें जानवर. एक वयस्क चूहे के लिए, लुढ़का धुंध पैड ~ मोटाई में 1.0 इंच और ~ 6.0 इंच की लंबाई में होना चाहिए. टेप शल्य चिकित्सा बोर्ड के लिए इस पैड इतना है कि यह कदम नहीं करता है. प्लेस पशु / सीने और कंधे के स्तर पर पैड पर. सर्जरी के बोर्ड को हथियार के नीचे पैड पर दोनों हाथ, और टेप खींचो. विचार करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी के ऊपर इतना है कि यह आसान करने के लिए सर्जरी भर काम के बाद से गर्भाशय ग्रीवा की हड्डी त्वचा की सतह के नीचे गहरे पाया जाता है सहारा है.

सर्जरी:

  1. सबसे कम खुर्दबीन बढ़ाई में (हम x 8 बढ़ाई उपयोग), स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करने के लिए midline चीरा बनाने. त्वचा laterally दूसरे हाथ त्वचा तना हुआ (जो त्वचा को काटकर अलग कर देना आसान बनाता है) के साथ, खींचो और खोपड़ी के आधार से चीरा हँसिया. (चित्रा 1 देखें)
  2. स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग करें 3 मांसपेशियों की परतों के माध्यम से स्पाइनल कॉलम पर चीरा बनाने के लिए. थोड़ा मांसपेशी निचोड़ (औसत दर्जे के लिए पार्श्व) दूसरे हाथ से दोनों पक्षों पर. स्केलपेल के साथ मजबूती से पर्याप्त प्रेस करने के लिए संभव के रूप में कटौती की कम संख्या के साथ सभी मांसपेशी परतों में कटौती इतना है कि मांसपेशियों चीरों दांतेदार नहीं हो सकता है, जो सर्जरी के अंत आसान में suturing बनाता सुनिश्चित करें. हालांकि, बहुत मजबूती से नहीं प्रेस गहरे ऊतकों में नुकसान (स्पाइनल कॉलम) बनाने से रोकने के.
  3. दो कपास इत्तला दे दी applicators के साथ, घुमा गति का उपयोग करें paraspinal मांसपेशियों से overlying मांसपेशियों अलग. एक जोरदार यहाँ किया जा सकता है. कटौती या आँसू के रूप में इस रक्तस्राव का कारण होगा मत करो. Applicators के साथ गति घुमा अच्छी तरह से क्षति या रक्तस्राव के कारण के बिना ऊतक के अलावा तंग करेगा. यदि रक्तस्राव सर्जरी के किसी भी स्तर पर होता है, यह सबसे अच्छा है के लिए रोगी हो. रक्तस्राव के साथ बहुत आगे भीड़ क्योंकि रक्त शल्य चिकित्सा क्षेत्र की दृष्टि अस्पष्ट की कोशिश मत करो. दाग़ना या प्रकाश दबाव रक्तस्राव की साइट के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन हमें लगता है कि धैर्य सबसे अच्छा है. अभ्यास के साथ, वहाँ इस सर्जरी भर में कम या कोई रक्तस्राव होना चाहिए.
  4. 4 घर का retractors (देखें चित्र 2) के साथ मांसपेशियों को वापस लेना. ये retractors तगड़ा पेपर क्लिप एक retractor (चित्रा 2 - इनसेट देखें) में आकार से बनाया जा सकता है . सर्जरी से पहले इन आटोक्लेव. केयर retractors की छोर कुंद के ऊतकों को नुकसान से बचने लिया जाना चाहिए. Retractor के लिए स्ट्रिंग टाई. एक्सपोजर / वर्ग आयत के आकार का होना चाहिए. इस आकार 4 4 retractors का उपयोग कोनों को खींच कर प्राप्त किया जा सकता है. टेप क्रम में retractors सुरक्षित (देखें चित्र 2) बोर्ड के लिए स्ट्रिंग. वाणिज्यिक उपलब्ध retractors भी, प्रयोग किया जा सकता है लेकिन हम इन का उपयोग नहीं पसंद करते हैं. यह करने के लिए एक अच्छा शल्य चिकित्सा क्षेत्र बनाने के क्रम में सर्जरी भर में स्पष्ट रूप से देख महत्वपूर्ण है. "आँख बंद करके" के साथ जारी रखने के मत करो.
  5. स्पाइनल कॉलम की पृष्ठीय सतह से साफ paraspinal मांसपेशियों. स्पाइनल कॉलम की पृष्ठीय सतह पर paraspinal मांसपेशियों के साथ सौदा करने के लिए, वहाँ दो संभावित रणनीतियों रहे हैं. पहली रणनीति के लिए, चूहा दांतेदार संदंश और मध्यम आकार के वसंत कैंची का उपयोग करने के लिए कशेरुकाओं की पृष्ठीय सतह से paraspinal मांसपेशियों को हटाने. हड्डी को बहुत करीब करने के लिए बेहतर हड्डी की सतह का पर्दाफाश कटौती करने की कोशिश करो. कशेरुकाओं की सतह के समानांतर कटौती करें, लेकिन हड्डी में कटौती नहीं नीचे है. दूसरे दृष्टिकोण के लिए, पैरा रीढ़ की मांसपेशियों में एक midline चीरा बनाने के लिए, और छोटे retractors के साथ laterally वापस लेना. दूसरे दृष्टिकोण में, मांसपेशियों को फिर सर्जरी के बाद वापस एक साथ कर सकते हैं sutured हो.
  6. कशेरुका अस्थि की अच्छी तरह से साफ़ सतह. C4, C5, और C6 (चित्रा 3 देखें) के स्तर से दूर मांसपेशी खींच rongeur (सबसे महत्वपूर्ण शल्य चिकित्सा उपकरण) का उपयोग करें. यह, ज़ाहिर है, रीढ़ की हड्डी का स्तर है कि लक्षित कर रहे हैं पर निर्भर करता है. जबकि एक हाथ से rongeur का उपयोग, C2 प्रक्रिया पर दूसरे हाथ में चूहा दांतेदार संदंश के साथ मांसपेशियों को लोभी द्वारा पूरे स्पाइनल कॉलम सुरक्षित. C2 शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में बड़ी विजय - स्तम्भ प्रक्रिया है. C3 मांसपेशियों के नीचे थोड़ा के रूप में अच्छी तरह से है. C4, C5, और C6 का उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं क्योंकि वे थोड़ा मांसपेशी उन्हें overlying.
  7. C5 के laminectomy के साथ शुरू करो. फिर, चूहा दांतेदार संदंश के साथ पकड़े C2 द्वारा सुरक्षित है. Rongeur के साथ: पूरे लामिना (midline निकट हड़पने चित्र देखने) ले लो. स्थिति rongeur ताकि उपकरण स्पाइनल कॉलम की धुरी के लिए पूरी तरह सीधा है. धीरे लामिना कुचलने. रीढ़ की हड्डी में नीचे धक्का मत करो, के रूप में इस रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को नुकसान का कारण बन जाएगा. क्रश और धीरे हड्डी ऊपर का टूटा हुआ टुकड़ा खींच. Rongeur टुकड़ा कुचलने इतना है कि एक आसानी से दूर खींचने के लिए निकाल सकते हैं चाहिए. यदि हड्डी का टुकड़ा अभी भी लामिना का आराम करने के लिए जुड़ा हुआ है, के रूप में इस नकसीर और रीढ़ की हड्डी को संभव चोट के कारण होगा tug नहीं करते. Rongeur स्वच्छ और तेज किया जाना चाहिए. Rongeur के रूप में ऐसे उपकरण / धोया जाना चाहिए बाँझ खारा है, जो एक बाँझ कटोरा में प्रदान किया जा सकता है (चित्रा 4) के साथ नष्ट .
    Laminectomy के प्रारंभिक खोलने, rongeur perpen स्थिति के लिएस्पाइनल कॉलम dicular बेहतर है. यह कदम तब छोटे "nibbles" लेने rongeur धीरे एक लगभग 30-60 डिग्री की हड्डी की सतह के सापेक्ष कोण के साथ हड्डी के तहत डालने laminectomy विस्तार के द्वारा पीछा किया जा सकता है.
  8. C4-C6 laminae के सभी laminectomy बढ़ाएँ. हड्डी में एक रीढ़ की हड्डी में तीन स्तर पर निरंतर खोलने बनाओ. laminectomy की हद तक intraspinal इंजेक्शन के वांछित स्थान (ओं) पर आधारित समायोजित किया जा सकता है.
  9. Laminectomy बहुत दूर laterally विस्तार है क्योंकि इस नकसीर कारण होगा मत करो. आदेश में वेंट्रल सींग, इंजेक्शन साइट को लक्षित करने के लिए अपेक्षाकृत औसत दर्जे का है, तो यह laminectomy दूर laterally विस्तार करने के लिए अनावश्यक है. (चित्रा 5 देखें)
  10. ~~ 15 एक्स के लिए बढ़ाई बढ़ाएँ
  11. Dura के तेज / सीधे संदंश # 5 के साथ शीर्ष पर साफ संयोजी ऊतक (और संभव सूखे रक्त). संयोजी ऊतक और dura के बीच अंतर करने के लिए अनुभव के साथ सीखा जा जरूरत है.
  12. काटकर अलग कर देना dura, या तो मिनी वसंत कैंची या microknife के साथ एक बहुत ही कठिन तानिका संबंधी परत,. स्पाइनल कॉलम बस पृष्ठीय rootlets के प्रवेश क्षेत्र के लिए औसत दर्जे की धुरी के समानांतर चीरा बनाओ. यह एक वेंट्रल सींग लक्षित करने की अनुमति देगा. (चित्रा 6)
  13. तेज / सीधे # 5 संदंश का प्रयोग करें हड़पने के लिए और थोड़ा dura रीढ़ की हड्डी के बंद उठा. चुटकी रीढ़ की हड्डी को चोट पहुंचाना नहीं / यह कुछ अभ्यास लेता है. Microknife या बहुत छोटे वसंत कैंची के साथ चीरों बनाओ. रीढ़ की हड्डी को घायल मत करो.
  14. विजय - स्तम्भ - दुम का अक्ष में चीरा थोड़ा बढ़ाएँ. Dura के तनाव थोड़ा dura अलग करने के लिए रीढ़ की हड्डी का एक अच्छा जोखिम पैदा करेगा.
  15. इरादा प्रत्येक इंजेक्शन के लिए सभी उपयुक्त स्थलों पर चीरों बनाओ. Dura एक धुंधला पारदर्शी उपस्थिति है, जबकि रीढ़ की हड्डी की सतह एक उज्जवल सफेद रंग की उपस्थिति है. एक करने के लिए इन अलग भेद जानने के लिए की आवश्यकता होगी. यह इंजेक्शन की सुई के साथ dura के माध्यम से इंजेक्षन करने की कोशिश नहीं की सलाह दी जाती है. dura कठिन है, इतना है कि यह मुश्किल के माध्यम से बेध जाएगा. इसके अलावा, dura के माध्यम से भेदी सुई प्रविष्टि की गति को प्रभावित करते हैं और इसलिए कोशिकाओं के anatomically लक्षित वितरण को प्रभावित करेगा कर सकते हैं.
  16. कोशिकाओं को द्विपक्षीय स्तर 3 (6 कुल साइटों) के स्तर पर ग्रीवा बढ़ने के बड़े क्षेत्र लक्ष्य इंजेक्षन. संख्या और इंजेक्शन के स्थान (ओं), ज़ाहिर है, विशिष्ट प्रयोग पर निर्भर करता है.
  17. भेदी dura के बाद, मस्तिष्कमेरु द्रव बाहर डालना होगा. कॉर्ड और धुंध या कपास इत्तला दे दी applicator के साथ पूरे जोखिम की सूखी सतह.
  18. सेल इंजेक्शन के लिए, 10.0μL हैमिल्टन gastight आर.एन. सिरिंज का उपयोग करें.
  19. 33 गेज / 45 डिग्री संलग्न धातु आर.एन. हैमिल्टन सुई beveled. सुई तेज होना चाहिए. केवल ~ 20 इंजेक्शन (सुई कम इंजेक्शन के साथ तेज हो जाएगा) के लिए एक ही सुई का प्रयोग करें. एक भी सुइयों के लिए खींच गिलास केशिका ट्यूब का उपयोग कर सकते हैं. Epoxy का प्रयोग करें 26-गेज कुंद हैमिल्टन धातु सुई के लिए खींच लिया गिलास टिप देते हैं. एक शल्य खुर्दबीन और सुक्ष्ममापी स्लाइड का उपयोग: बाहरी टिप व्यास ~ 75.0-100.0 μL (एक इंजेक्शन की प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं को नुकसान नहीं चाहता है कोशिकाओं के व्यास पर निर्भर करता है) को छाँटो. हम 33 गेज सुई धातु पसंद करते हैं.
  20. कक्ष निलंबन के बाहर बर्फ पर Eppendorf ट्यूब के अंदर आसानी से गिर जाएगी. तुरंत पहले इंजेक्शन सिरिंज लोड हो रहा है, धीरे ट्यूब नल जब तक कोशिकाओं निलंबन में वापस जाओ. क्या झटका नहीं भी तीव्रता के रूप में यह कोशिकाओं और / या कारण बुलबुले घायल होगा. वैकल्पिक रूप से, 20.0μL विंदुक आदमी का उपयोग करने के लिए धीरे कोशिकाओं मिश्रण: विंदुक सेल निलंबन केवल एक या दो बार ऊपर और नीचे.
  21. केवल एक इंजेक्शन साइट के लिए पर्याप्त सेल निलंबन मात्रा लोड. कक्ष इंजेक्शन सिरिंज अंदर निलंबन से बाहर गिर अगर एक योजना एकाधिक इंजेक्शन करना होगा. धीरे धीरे सिरिंज में कोशिकाओं को लेने के लिए बुलबुले और / या कोशिकाओं को नुकसान से बचने के. विशेष रूप से glial पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं है कि हम हमारी प्रयोगशाला में साथ काम करने के लिए, हम 2-5 मिनट पर 50,000-75,000 1.0 μL प्रति कोशिकाओं की एक कमजोर पड़ने पर 2.0 सेल निलंबन की μL इंजेक्षन. हमने पाया है कि 2uL/site ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में ऊतकों को नुकसान में परिणाम नहीं करता है है. इसके बजाय, हमारे अनुभव से पता चलता है कि बहुत इस मात्रा में कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि (विशेषकर यदि वे हमारे glial progenitors की तुलना में आकार में बड़े होते हैं: व्यास में 10.0 -20.0 सुक्ष्ममापी) रीढ़ की हड्डी पैरेन्काइमा को नुकसान का कारण हो सकता है. हम एक व्यापक सेल dosing कोशिकाओं के इष्टतम संख्या का निर्धारण प्रयोग करने के लिए प्रत्येक साइट पर इंजेक्षन (कम से कम बरकरार ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में) का आयोजन किया. पैरामीटर को विशेष सेल प्रकार और रोग की स्थिति के लिए निर्धारित होना चाहिए.
  22. रीढ़ की हड्डी को ठीक से वांछित संरचनात्मक क्षेत्र लक्ष्य स्तंभ की धुरी के साथ समानांतर / सिरिंज सुई अप लाइन. सुई बस पर्याप्त angled है (लगभग शल्य मेज के सापेक्ष 80 डिग्री) के लिए शल्य चिकित्सा गुंजाइश सिर टक्कर नहीं है, लेकिन के रूप में संभव के रूप में 90 डिग्री के करीब है. रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय माइक्रोस्कोप का उपयोग सतह की ओर निचले टिप (चित्रा 7 देखें).
  23. उद्देश्य सिर्फ प्रविष्टि Zo औसत दर्जे सुईपृष्ठीय rootlets के पूर्वोत्तर (चित्र 8 देखें). धीरे सुई की नोक के साथ रीढ़ की हड्डी की सतह को छूने. थोड़ा सुई के साथ रीढ़ की हड्डी दबाना. सुई वापस लेना जब तक वापस सामान्य करने के लिए रीढ़ की हड्डी है. इस स्थिति के रूप में रिकॉर्ड z = micromanipulator पर शासक का उपयोग कर 0.0.
    नोट: हम नियमित रूप से ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में इंजेक्शन के दौरान कशेरुका स्तंभ स्थिर नहीं करते. हमारे संवेदनाहारी आहार का उपयोग करना, भारी साँस लेने के कारण गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी के ऊपर और नीचे आंदोलन एक मुद्दा कभी नहीं किया गया है. हालांकि, अगर भारी साँस लेने में एक समस्या है, स्पाइनल कॉलम धीरे हड्डी clamping और C2 और C7 संशोधित संदंश का उपयोग स्तरों पर पैरा रीढ़ की मांसपेशियों आसपास के द्वारा एक स्वनिर्धारित फ्रेम का उपयोग कर स्थिर कर सकते हैं, सावधान किया जा रहा कशेरुका अस्थि नहीं कुचलने या घायल रीढ़ की हड्डी के ऊतकों अंतर्निहित. यदि जानवर श्वास प्रक्रिया के दौरान उथले हो जाता है, अधिक चतनाशून्य करनेवाली औषधि दवा दी जानी चाहिए. सर्जरी जब तक किया गया है संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान शुरू करने से पहले फिर से हासिल बाधित होना चाहिए.
  24. रीढ़ की हड्डी में सुई से थोड़ा कम. माइक्रोस्कोप में देखो, जबकि यह कर सुनिश्चित करें. लोअर 1.5 मिमी के लिए वयस्क चूहों में वेंट्रल सींग लक्ष्य की गहराई के लिए सुई. लोअर .75 मिमी के लिए वयस्क चूहों में वेंट्रल सींग लक्ष्य की गहराई के लिए सुई. (चित्रा 9 को देखें) . ये गहराई संख्या वयस्क के प्रतिनिधि कर रहे हैं (कम से कम 3 महीने पुराने) महिला और पुरुष Sprague-Dawley (250-450 ग्राम) चूहों और C57BL / 6 चूहों (20-35 ग्राम). बेशक, गहराई और पार्श्व स्थिति हित के विशिष्ट क्षेत्र पर निर्भर करते हैं. जबकि रीढ़ की हड्डी में सुई डाला जाता है रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को नुकसान से बचने के इंजेक्शन बोर्ड / प्रणाली सर्जरी या शल्य चिकित्सा की मेज को परेशान मत करो.
  25. वांछित गहराई इंजेक्शन से पहले सुई कम करने के बाद दो मिनट (अब भी बेहतर है) रुको.
  26. 2-5 मिनट से अधिक पंप नियंत्रक का उपयोग करते हुए निरंतर दर पर 2.0 μL इंजेक्षन.
  27. इंजेक्शन के बाद धीरे से रीढ़ की हड्डी से सुई को हटाने से पहले दो मिनट (अब बेहतर है) रुको.
  28. प्रत्येक इंजेक्शन के बाद dH2O साथ साफ़ सिरिंज क्रम में clogging रोकने के. धीरे धीरे आकर्षित और 3-5 बार निष्कासित. सिरिंज में हवा आकर्षित मत करो.
  29. निम्नतम बढ़ाई (: ~ x 8 उसी के रूप में सर्जरी की शुरुआत में प्रयोग किया जाता है) पर लौटें. सीवन dura 9-0 सीवन का उपयोग कर बंद कर दिया, लेकिन यह निश्चित रूप से आवश्यक नहीं है. यह भी चुनौतीपूर्ण है. हम sutured dura अतीत में बंद कर दिया, लेकिन हम जानवर व्यवहार, प्रत्यारोपण के अस्तित्व या रीढ़ की हड्डी ऊतक विज्ञान जब dura सीवन के साथ बंद नहीं है में कोई फर्क नहीं पाते. dura बाँझ जेल फोम की एक सुरक्षात्मक टुकड़ा के साथ कवर किया जा सकता है. जेल फोम dural चीरा साइट के शीर्ष पर सीधे रखा जाना चाहिए. हालांकि, यह महत्वपूर्ण है gelfoam के इस टुकड़े अचानक खींच नहीं विच्छेदन के बाद छिड़काव के दौरान रीढ़ की हड्डी की सतह के रूप gelfoam कभी कभी कसकर रीढ़ की हड्डी की सतह का पालन कर सकते हैं में ख्याल रखना.
  30. वैकल्पिक: सीवन paraspinal मांसपेशी 4-0 सीवन के साथ बंद कर दिया.
  31. सीवन एक समय में 4-0 सीवन के साथ तीन overlying मांसपेशियों परतों बंद कर दिया. विजय - स्तम्भ - दुम का अक्ष में तीन स्थानों पर सीवन मांसपेशियों (चित्र 10 देखें).
  32. स्टेपल त्वचा 9.0 मिमी घाव क्लिप (चित्रा 11 देखें) के साथ बंद हुआ . सुई धारकों के साथ स्टेपल कस बंद पूर्ण घाव भरने से पहले स्टेपल खींच से पशुओं को रोकने के. अंतरिक्ष स्टेपल लगभग अलावा 0.5cm. घाव क्लिप पर कस के रूप में इस बिगड़ा उपचार और परिगलन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं मत करो.
  33. Povidine-आयोडीन एंटीसेप्टिक लथपथ धुंध के साथ क्षेत्र घाव समाधान लागू.
  34. पशु के लिए गर्म पानी पैड परिसंचारी पर ठीक करने के लिए अनुमति दें. तुरंत सर्जरी के बाद, बाँझ lactated है घंटी समाधान (माउस के लिए 0.5 एमएल चूहे के लिए 5.0 एमएल) के उप cutaneous इंजेक्शन दे. अनुवर्ती इंजेक्शन भी अगर पशु निर्जलित और / या उदासीन दिखाई देता है उपलब्ध कराया जा सकता है. रोगनिरोधी एंटीबायोटिक Cefazolin के 6.0mg/kg का उपयोग कर उपचार में इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, हमारे अनुभव से पता चलता है कि इस प्रत्यारोपण प्रक्रिया शल्य चिकित्सा के बाद संक्रमण में अगर सड़न रोकनेवाला तकनीक का पीछा किया और सभी उपकरणों / शल्य चिकित्सा की आपूर्ति निष्फल कर रहे हैं परिणाम नहीं करता है. यदि इन सावधानियों का पालन कर रहे हैं, एंटीबायोटिक प्रशासन हतोत्साहित किया जाता है.
  35. सीएसए या बलिदान जब तक FK-506/Rapamycin दैनिक जारी रखें.
  36. पूरे सर्जरी ~ 45 मिनट (6 इंजेक्शन साइटों के साथ) की तुलना में कम लेना चाहिए. अन्यथा, पशु को जगाने के लिए शुरू और अधिक भारी साँस लेने जाएगा, जो प्रतिकूल रीढ़ की हड्डी में इंजेक्शन को प्रभावित करेगा.

प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों के साथ संबंधित समस्याओं के लिए समस्या निवारण युक्तियाँ

/ गरीब सेल अस्तित्व का अभाव: यह संभावना है, लेकिन नहीं एक तकनीकी इंजेक्शन के साथ जुड़े मुद्दे शायद सेल जा रहा है और / या immunesuppression आहार इंजेक्शन प्रकार के गुण के कारण है . इन मुद्दों को empirically एक सेल प्रकार और पशु मॉडल विशिष्ट आधार पर मूल्यांकन करने की आवश्यकता है. प्रतिरक्षा कमी चूहा और माउस मॉडल की एक संख्या की उपलब्धताभी immunesuppression के साथ समस्याओं को दरकिनार करने के लिए उपलब्ध हैं, तथापि, इन जानवरों को भी वर्तमान लागत, एक कॉलोनी को बनाए रखने के लिए की जरूरत है, और शल्य चिकित्सा और आवास के दौरान अतिरिक्त सावधानी आवश्यक जैसे कठिनाइयों.

कार्यात्मक घाटे सर्जरी के बाद मनाया: हमारे अनुभव में, हम किसी भी कार्यात्मक इस प्रक्रिया के बाद जब forelimb और hindlimb पकड़ ताकत और तंत्रिका / यौगिकों मांसपेशियों कार्रवाई क्षमता डायाफ्राम श्वासपटलीय जैसे उपायों द्वारा मूल्यांकन घाटे की घटना में 6 इंजेक्शन साइटों के साथ भी नहीं देखा है, ( 2μL की ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में प्रत्येक). ऊतक विनाश भी नहीं देखा गया है. इन समस्याओं की घटना के लिए संभावित कारणों में शामिल हैं हैं: का उपयोग करते हुए, नहीं सुझाया गया सुई गेज बड़ी मात्रा में और / या सेल नंबर, unintentional अनुचित laminectomy की वजह से क्षति, विनम्रता की कमी इंजेक्शन जबकि dura (में # 5 के साथ की हड्डी pinching के रूप में काटने ) संदंश या रीढ़ की हड्डी (सुस्त सुई की जगह) में हैमिल्टन सुई डालने की प्रक्रिया के दौरान.

कक्ष वेंट्रल ग्रे मामले में नहीं मिला: यह मुद्दों का एक नंबर के लिए कारण हो सकता है है. यदि इंजेक्शन लक्ष्य medially या पार्श्व याद करते हैं, ठीक से ऊपर रीढ़ की हड्डी की धुरी के साथ इंजेक्शन प्रणाली समानांतर लाइन, और सिर्फ पृष्ठीय rootlets के प्रवेश के लिए औसत दर्जे का सुई डालने के लिए सुनिश्चित करें. यदि इंजेक्शन लक्ष्य को पीछे की ओर या औदरीयता याद करते हैं, करने के लिए अपने z-अक्ष पढ़ने शून्य करने के लिए सुनिश्चित करें कि जब सुई की नोक अभी मुश्किल से रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सतह को छूने, उचित (बेवल अब एक bevel के साथ सुझाव दिया हैमिल्टन सुई का उपयोग करें लक्ष्यीकरण को प्रभावित कर सकते हैं) विश्वास दिलाता हूं कि रीढ़ की हड्डी जब सुई डालने सेक नहीं करता है, वास्तव में गहराई मापने micromanipulator का उपयोग में ख्याल रखना, और सुझाया गया वजन सीमा के भीतर जानवरों का उपयोग. तदनुसार अगर आप लगातार एक स्थान में हैं कोशिकाओं को इंजेक्शन (जो histological मूल्यांकन और बाद में तकनीक संशोधन की आवश्यकता है) अपनी तकनीक को समायोजित. यदि इंजेक्शन बेतरतीब ढंग से अपने इंजेक्शन साइटों के सभी बिखरे हुए हैं, तो आप स्थिरता में सुधार करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होगी. यदि कोशिकाओं को ज्यादातर सुई ट्रैक के साथ रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय पहलू पर स्थित होते हैं, सेल इंजेक्शन के पहले और बाद में लंबे समय तक इंतजार, और समय की एक लंबी अवधि में वास्तविक इंजेक्शन का विस्तार.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

माउस - व्युत्पन्न glial पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (50,000 कोशिकाओं / साइट) एक वयस्क SOD1 G93A चूहे में रीढ़ की हड्डी स्तर C4 के वेंट्रल सींग में प्रत्यारोपित किया गया. माउस व्युत्पन्न प्रतिरोपित कोशिकाओं का पता लगाने के माध्यम से मेजबान चूहा ऊतक से माउस विशिष्ट एंटीबॉडी, M2 के साथ प्रतिष्ठित किया जा सकता है. इस छवि को 1 महीने के बाद प्रत्यारोपण M2 + प्रत्यारोपण व्युत्पन्न कोशिकाओं (चित्रा 12 देखें) के अस्तित्व से पता चलता है. कोशिकाओं वेंट्रल ग्रे बात स्थानीयकृत, लेकिन इंजेक्शन साइट medially पार्श्व वेंट्रल सींग (सबसे श्वासपटलीय मोटर न्यूरॉन्स के स्थान: बिंदीदार रेखा से चिह्नित) याद किया. पुटी गठन नहीं देखा गया था जब 50,000 कोशिकाओं साइट प्रति अंतःक्षिप्त थे, और कोई व्यवहार हानि इंजेक्शन प्रक्रिया से परिणामस्वरूप. हालांकि, कक्षों की बहुत अधिक संख्या (वास्तविक संख्या कोशिका प्रकार के अनुसार बदलता रहता है, और व्यवस्थित मूल्यांकन किया जाना चाहिए) इंजेक्शन स्थल पर नुकसान में और सुई ट्रैक साथ परिणाम (देखें चित्र 13: astrocyte मार्कर के साथ immunohistochemistry, GFAP) का इंजेक्शन .

चित्रा 1
चित्रा 1. त्वचा की प्रारंभिक चीरा सबसे कम खुर्दबीन बढ़ाई में (हम x 8 बढ़ाई उपयोग), स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करने के लिए midline चीरा बनाने . त्वचा laterally दूसरे हाथ त्वचा तना हुआ (जो त्वचा में कटौती करने के लिए आसान बनाता है) के साथ, खींचो और खोपड़ी के आधार (कान के पीछे के स्तर पर) से कंधे ब्लेड से चीरा (मोटी बिंदीदार रेखा से चिह्नित) (चिह्नित पतली बिंदीदार रेखा से).

चित्रा 2
चित्रा 2. शल्य चिकित्सा क्षेत्र के एक्सपोजर. शल्य चिकित्सा जोखिम / वर्ग आयत के आकार का होना चाहिए . इस आकार 4 retractors का उपयोग कर चार कोनों की ओर आसपास की मांसपेशियों को खींच द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. टेप स्ट्रिंग है कि शल्य चिकित्सा बोर्ड के लिए retractors के लिए संलग्न क्रम में retractors सुरक्षित और ठीक से क्षेत्र खुले रखने.

2-इनसेट चित्रा. शल्य चिकित्सा क्षेत्र के प्रदर्शन के लिए retractors retractors. वापस मांसपेशी खींच क्रम में दोनों रीढ़ की हड्डी और सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त अंतरिक्ष स्पष्ट दृश्यता के साथ एक शल्य चिकित्सा क्षेत्र बनाने के लिए उपयोग किया जाता है. Retractors इच्छित आकृति और आकार में मजबूत पेपर क्लिप आकार देने के द्वारा बनाया जा सकता है. पहले सर्जरी के लिए retractors आटोक्लेव. Retractor के लिए स्ट्रिंग टाई.

चित्रा 3
आंकड़ा3. कशेरुकाओं paraspinal की मांसपेशी के बाद हटाने, rongeur के साथ अच्छी तरह से साफ कशेरुकाओं की पृष्ठीय सतह. व्यक्तिगत लामिना, के रूप में पृष्ठीय rootlets स्पाइनल कॉलम के पार्श्व पहलू से प्रवेश करने के रूप में अच्छी तरह से देखा जा सकता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. Laminectomy. रीढ़ की हड्डी के स्तर C5 पर laminectomy शुरू करो . चूहा दांतेदार संदंश के साथ मांसपेशियों overlying स्तर C2 पकड़े द्वारा सुरक्षित स्पाइनल कॉलम. Rongeur के साथ: पूरे लामिना (midline निकट हड़पने चित्र देखने) ले लो. स्थिति rongeur ताकि उपकरण स्पाइनल कॉलम की धुरी के लिए पूरी तरह सीधा है. धीरे लामिना कुचलने. रीढ़ की हड्डी में नीचे धक्का मत करो, के रूप में इस रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को नुकसान का कारण बन जाएगा. क्रश और धीरे हड्डी ऊपर का टूटा हुआ टुकड़ा खींच. Rongeur टुकड़ा कुचलने इतना है कि एक आसानी से दूर खींचने के लिए निकाल सकते हैं चाहिए. यदि हड्डी का टुकड़ा अभी भी laminae के आराम करने के लिए जुड़ा हुआ है, के रूप में इस नकसीर और रीढ़ की हड्डी को संभव चोट के कारण होगा tug नहीं करते. Rongeur स्वच्छ और तेज किया जाना चाहिए.

चित्रा 5
चित्रा 5. रीढ़ की हड्डी के ऊतकों निम्नलिखित laminectomy के एक्सपोजर. Laminectomy बढ़ाएँ C4 - सी 6 रीढ़ की हड्डी के सभी बेनकाब . 1 3 रीढ़ की हड्डी स्तर पर हड्डी में निरंतर खोलने बनाओ. Laminectomy बहुत दूर laterally विस्तार है क्योंकि इस नकसीर कारण होगा मत करो. आदेश में वेंट्रल सींग, इंजेक्शन साइट को लक्षित करने के लिए अपेक्षाकृत औसत दर्जे का है, तो यह कशेरुका अस्थि की पूरी पार्श्व हद तक laminectomy विस्तार करने के लिए अनावश्यक है.

चित्रा 6
चित्रा 6. रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सतह की उच्च बढ़ाई प्रमुख पृष्ठीय रक्त वाहिका नीचे रीढ़ की हड्डी के midline चल देखा जा सकता है है . यह रक्त वाहिनियों पैटर्न ज्यादातर मामलों में मनाया जाता है, तथापि, कुछ जानवरों के रक्त वाहिका का एक गैर midline प्रक्षेपवक्र प्रदर्शित. पृष्ठीय rootlets रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सतह के पार्श्व पहलुओं पर देखा जा सकता है है. Dura के लिए सापेक्ष रीढ़ की हड्डी overlying, इन तंत्रिकाओं एक धुंधला उपस्थिति है.

7 चित्रा
7 चित्रा. इंजेक्शन सेटअप. रीढ़ की हड्डी को ठीक से वांछित संरचनात्मक क्षेत्र लक्ष्य स्तंभ की धुरी के साथ समानांतर / सिरिंज सुई ऊपर रेखा. सुई बस पर्याप्त angled है (लगभग शल्य मेज के सापेक्ष 80 डिग्री) के लिए शल्य चिकित्सा गुंजाइश सिर टक्कर नहीं है, लेकिन के रूप में करीब (बाएं पैनल) संभव के रूप में 90 डिग्री कम है. रीढ़ की हड्डी की पृष्ठीय सतह की ओर इंजेक्शन टिप का उपयोग खुर्दबीन (राइट पैनल). धीरे सुई की नोक के साथ रीढ़ की हड्डी की सतह को छूने. थोड़ा सुई के साथ गर्भनाल दबाना. सुई वापस लेना रीढ़ की हड्डी तक सामान्य फ्लैट राज्य को वापस आ गया है. इस स्थिति को रिकार्ड के रूप में z = 0.0 micromanipulator पर शासक का उपयोग.

8 चित्रा
8 चित्रा. रीढ़ की हड्डी में इंजेक्शन निशाना लगाओ बस पृष्ठीय rootlets (बिंदीदार रेखा से चिह्नित) की प्रविष्टि क्षेत्र के लिए औसत दर्जे का सुई के उच्च बढ़ाई.

9 चित्रा
9 चित्रा. रीढ़ की हड्डी आरेख: ब्याज की संरचनात्मक क्षेत्र को लक्षित कैसे जब वेंट्रल सींग, पाछना dura स्पाइनल कॉलम की धुरी के समानांतर बस पृष्ठीय rootlets के प्रवेश क्षेत्र के लिए औसत दर्जे का लक्ष्य करने का प्रयास. यह एक वेंट्रल सींग लक्षित करने की अनुमति देगा. लोअर 1.5 से वयस्क चूहों में वेंट्रल सींग लक्ष्य मिमी (और जानवर की आयु, लिंग ज्यादा गहराई पर अंतर बनाने के लिए नहीं) की गहराई के लिए सुई. लोअर .75 मिमी के लिए वयस्क चूहों में वेंट्रल सींग लक्ष्य की गहराई के लिए सुई. बेशक, गहराई और पार्श्व स्थिति हित के विशिष्ट क्षेत्र पर निर्भर करते हैं.

10 चित्रा
10 चित्रा. शल्य साइट की क्लोजर सीवन एक समय में 4-0 सीवन के साथ तीन overlying मांसपेशियों परतों बंद . विजय - स्तम्भ - दुम का अक्ष में 3 स्थानों पर मांसपेशियों सिवनी.

11 चित्र
11 चित्रा. त्वचा की स्टैपल. स्टेपल त्वचा 9.0 मिमी घाव क्लिप के साथ बंद हुआ . सुई धारकों के साथ स्टेपल कस बंद पूर्ण घाव भरने से पहले स्टेपल खींच से पशुओं को रोकने के. अंतरिक्ष स्टेपल लगभग 0.5 अलावा मिमी.

12 चित्रा
12 चित्रा. ग्रीवा वेंट्रल सींग में glial progenitors के ट्रांसप्लांटेशन 50,000 माउस व्युत्पन्न glial पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं एक SOD1 G93A चूहे में रीढ़ की हड्डी स्तर C4 के वेंट्रल सींग में प्रत्यारोपित किया गया. M2 + माउस व्युत्पन्न प्रतिरोपित कोशिकाओं को 1 महीने के बाद प्रत्यारोपण बच गया. कोशिकाओं वेंट्रल ग्रे बात स्थानीयकृत, लेकिन इंजेक्शन साइट medially पार्श्व वेंट्रल सींग (चिह्नित याद कियाबिंदीदार रेखा से).

13 चित्रा
13 चित्रा. तंत्रिका अग्रदूत साबित कोशिकाओं की उच्च संख्या के ऊतक चोट के बाद प्रत्यारोपण कक्षों की बहुत अधिक संख्या (वास्तविक संख्या कोशिका प्रकार के अनुसार बदलता रहता है, और व्यवस्थित मूल्यांकन किया जाना चाहिए) इंजेक्शन स्थल पर नुकसान में परिणाम और सुई ट्रैक साथ इंजेक्शन.

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Discussion

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SOD1 G93A चूहों और चूहों, उम्र और एक समूह के भीतर पशुओं सेक्स मैच, और विभिन्न समूहों के लिए एक ही कूड़े भीतर जानवरों को वितरित. शामिल अध्ययन के लिए यह दोनों ए एल एस और एससीआई मॉडल के लिए एक ही सेक्स से सभी जानवरों का उपयोग करें, क्योंकि रोग प्रक्रियाओं पुरुषों और महिलाओं के बीच अलग हो सकता बेहतर है, तथापि, यह भी उपयोगी हो करने के लिए दोनों लिंगों से पर्याप्त पशुओं के लिए संभव सेक्स विशिष्ट प्रभाव का पता लगाने सकता है के रूप में, इस घटना SOD1 G93A 13 चूहों और SOD1 G93A 14,15 चूहों के साथ सूचित किया गया है . / रोग की उम्र बिंदु (ए एल एस जानवरों के लिए) पशुओं में कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए या समय के बाद चोट (एससीआई मॉडल के लिए) पर विचार करें. इस रणनीति की संभावना विशेष सेल तंत्र है कि संबोधित किया जा रहा है पर निर्भर करता है अलग होगा.

प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित दोनों चूहा और माउस ग्रीवा रीढ़ की हड्डी डोरियों 11, चूहा और माउस जैसे वक्ष और काठ का स्तर 14 स्पाइनल तार के दूसरे स्तर में प्रत्यारोपण के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आदेश में इन विभिन्न रीढ़ की हड्डी के स्तर में विशिष्ट संरचनात्मक ढांचे (ventral सींग की तुलना में अन्य) को लक्षित करने के लिए, यह सलाह है कि पहले से औसत दर्जे का है / पार्श्व और एक रंग या कुछ अन्य साधनों का उपयोग करने के लिए निर्देशांक की सटीकता का मूल्यांकन इंजेक्शन की स्थिति गहराई का परीक्षण.

परिणाम उपायों सेल प्रत्यारोपण के भाग्य का विस्तृत विश्लेषण, रीढ़ की हड्डी के जैव रासायनिक, histological, और कार्यात्मक राज्यों, और व्यवहार प्रत्यारोपण के स्थान के लिए प्रासंगिक परिवर्तन शामिल हैं. व्यवहार परीक्षण, histological विश्लेषण और अन्य परिणाम प्रत्यारोपण के बाद का विश्लेषण उपायों की बारीकियों को प्रयोगात्मक की जरूरत है / मॉडल के अनुरूप होना चाहिए.

Anesthetize, दाढ़ी, "खुला" और "बंद" जानवरों के लिए एक शल्य चिकित्सा सहायक होने आसानी से संभव के रूप में सबसे अधिक पशुओं के माध्यम से प्राप्त करने के लिए काफी उपयोगी है. इसके अलावा, एक शल्य चिकित्सा सहायक सर्जन मदद करने के लिए प्रक्रिया के दौरान बाँझ रह सकते हैं.

इष्टतम संख्या और कोशिकाओं की एकाग्रता इंजेक्शन कोशिकाओं के आकार के आधार पर अलग अलग होंगे, प्राप्तकर्ता, पशु, और रोग की स्थिति की प्रजातियों. उदाहरण के लिए, बरकरार रीढ़ की हड्डी की तुलना में वृद्धि हुई है, कोशिकाओं की संख्या एक एससीआई साइट में दिया जा सकता है अगर एक गुहा पहले से ही 16 का गठन किया है. हालांकि, विशिष्ट मापदंडों के लिए व्यवस्थित करने के लिए एक बड़े अध्ययन के उपक्रम से पहले अनुकूलित की जरूरत है.

एक विशिष्ट एनपीसी प्रकार के साथ एक बड़े अध्ययन का आयोजन करने से पहले लंबी अवधि के प्रतिरक्षा दमन आहार की प्रभावशीलता का मूल्यांकन. इसके अलावा, सेल अस्तित्व एक दिया सेल रोग मॉडल या और प्रत्यारोपण के समय और स्थान के आधार पर प्रकार के लिए भिन्न हो सकते हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

मैं धन्यवाद देना चाहूंगा: Lepore के सभी सदस्यों, Maragakis और उपयोगी चर्चा के लिए रोथस्टीन प्रयोगशालाओं, अमेरिका और वित्तपोषण के लिए क्रेग एच. Neilsen फाउंडेशन के झोले के मारे हुए दिग्गजों.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS GIBCO, by Life Technologies 14170
0.05% Trypsin GIBCO, by Life Technologies 25300
Soybean Trypsin Inhibitor (optional) Sigma-Aldrich T-6522
Acepromazine maleate (0.7 mg/kg) Fermenta Animal Health
Ketamine (95 mg/kg) Fort Dodge Animal Health
Xylazine (10 mg/kg) Bayer AG
#11 Feather surgical blade Electron Microscopy Sciences 72044-11
Cotton-tipped applicators (6 inch) Fisher Scientific 23-400-101
Rat-toothed forceps Fine Science Tools Rat: 11023-15; Mouse: 11042-08
Medium-sized spring scissors Fine Science Tools 15012-12
Mini spring scissors Fine Science Tools 15000-10
Rongeur Fine Science Tools Rat: 16121-14; Mouse: 16221-14
Microknife Fine Science Tools 10056-12
Needle holders Fine Science Tools 12502-14
Suture: 4-0 Vicryl S-183
Staples: 9 mm Autoclip 427631
Stapler: 9 mm (Reflex #203-1000) World Precision Instruments, Inc. 5000344
Warm water pump (T/Pump) Gaymar Industries P/N 07999-000
Cyclosporin A: 250.0 mg/5.0 mL ampules Novartis AG NDC 0078-0109-01
FK-506 LC Laboratories F-4900
Rapamycin LC Laboratories R-5000
Injector World Precision Instruments, Inc. UMP2
Micro 4 Microsyringe Pump Controller World Precision Instruments, Inc. UMC4
Micromanipulator World Precision Instruments, Inc. Kite-R
10.0 μL Hamilton syringe Hamilton Co 80030
Hamilton needles: 33-gauge, 45° bevel, 1 inch Hamilton Co 7803-05
Glass 20.0 μL microcapillary pipettes (optional) Kimble Chase 71900-20

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References

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Intraspinal Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस और अभिघातजन्य स्पाइनल कॉर्ड चोट में सरवाइकल ventral हॉर्न का लक्ष्य निर्धारण के लिए सेल प्रत्यारोपण
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Lepore, A. C. Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (55), e3069, doi:10.3791/3069 (2011).More

Lepore, A. C. Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (55), e3069, doi:10.3791/3069 (2011).

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