Summary
배아의 접근의 용이성은 여자 퀘일 chimeras 및 초점 염료 라벨 등 여러 방법을 사용하여 세포의 운명을지도하기 위해 실험에 사용할 수 있습니다. 이 문서에서 우리는 긴 생존 시간에 최적화된있는 하나의 계란 준비 방법을 보여줍니다.
Abstract
개발의 연구는 크게 실험 모델로 여자의 배아를 사용하여 주었되었습니다. 배아의 접근의 용이성은 여자 퀘일 chimeras 및 초점 염료 라벨 등 여러 방법을 사용하여 세포의 운명을지도하기 위해 실험에 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 단백질 코팅 구슬과 비켜 electroporation을 사용하여 플라스미드 DNA의 도입의 배치를 포함한 여러 종류의 분자 perturbations에 대한 수 있습니다. 이러한 실험은 중앙과 주변 신경 시스템의 개발에 중요한 데이터를 굴복했습니다. 이러한 연구의 많은 경우, 그것은 달걀 껍질을 열고 배아의 성장을 perturbing없이 reclose 필요합니다. 배아는 달걀 껍질을 다시 열어 연속 발달 단계에서 검사를하실 수 있습니다. 이 문서에서, 닭고기 계란을 열 몇 가지 훌륭한 방법이 있지만 우리는 긴 생존 시간에 대한 최적화된 한 가지 방법을 보여줍니다. 이 방법에서, 계란은 측면에 달려 있으며 작은 창이 껍질에 상처입니다. 실험 절차 후, 쉘은 개발 기간 동안 계란을 커버하는 데 사용됩니다. 달걀 껍질을 overlying 투명한 플라스틱 테이프는 배아를 보호하고 부화 기간의 남은 기간 동안 수화를 유지하는 데 도움이됩니다. 이 방법은 배양이 이틀 동안에 처음 사용되었으며, 성숙 배아 세를 통해 생존을 허용하고 있습니다.
Protocol
1. 인큐베이터에서 계란을 제거합니다
- 37 ° C 유지 60% 위에 설정된 상대 습도.
- 계란을 제거, 계란 90 ° 회전 큰 기지가 수평으로 놓여 있도록.
2. 면봉 계란 소독을
- 70 % 에탄올과 비 멸균 거즈의 스택을 포화.
- 5 달걀까지 면봉에 2 ~ 3 조각을 사용합니다. 거즈가 더러워진 경우 폐기하십시오.
3. 준비 횐자위 제거 사이트
- 그냥 알부민이 밖으로 그려진 것입니다 지역을 보호하기 위해 기본 왼쪽 3M 플라스틱 테이프 1 "X 1"조각을 잘라 장소.
4. 횐자위 제거
- 테이프의 중간에 작은 구멍을 만들기 위해 가위의 요점을 사용합니다.
- 18 게이지 1 인치 바늘과 10 CC 주사기를 사용하면 천천히 가위에 의해 만들어진 구멍을 통해 바늘을 드릴.
- 계란의 바닥을 향해 45 ° C 각도에서 바늘을 아래로 드라이브.
- 중앙쪽으로 바늘을 기울이기 및 횐자위의 3-4 ML을 그립니다.
5. 윈도우
- 플라스틱 테이프 3 "X 3"조각을 잘라 계란의 상단에 맞게 그것을 스트레칭. 너무 열심히 끌어 않도록 조심하고, 계란의 수평 표면의 둥근 끝을 주변 광장의 모서리를 확장합니다. 그것이없이 주름과 달걀의 표면에 대한 꽉되도록 테이프를 당겨.
- 날카로운 직선 4 "해부 가위의 쌍을 사용하여 테이프가 위치했던 지역의 하단 중앙에 구멍을 비꼬아. 천천히 안쪽에 대한 도움말을 계속해야되는 계란에 가위의 낮은 블레이드 안내 쉘은. 기본 향해 칼날을 직접 천천히 껍질을 잘라 시작합니다. 시계 반대 방향으로 방식으로 진행 그냥 맨 중심에 도달하기 전에 중지.만이 작은 비트까지 가위를 제거하고 반대 방향으로가는 반복 계란 첨부. 난자가 수정된 있는지 확인 확인은. 창을 닫아 남아있다.
6. 폐쇄 재개와 계란을 씰링.
- 넓은 비닐 테이프 "2분의 1의 길이"2-3에 대한 절단하고 절단했던 구멍으로 다시 맞는 있도록 창을 종료. 테이프의 다른 한 X 1 "조각을 가지고 계란이 말라 버린하는 구멍을 밀봉. 모든 조작을 할 수있는 계란을 재개하기 위해 포셉의 한 켤레를 사용. 당신은 인큐베이터에 달걀을 반환하는 준비가되면, 한 조각 잘라 창문을 봉인하고 계란의 전체 수평 표면을 충당하기 위해 충분히 큰 테이프.
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Discussion
이 방법은 실험 조작에 따라 긴 생존 시간을 허용합니다. 예를 들어, 염료 라벨링 연구는 나중에 운명 매핑 연구 (1) E10 또는 생존을 허용했다. 또한, 그것은 유전자 발현 수준의 변경 및 나중에 발달 단계 (2-6)를 진행하는 데 필요한 개발을 제공 비켜 electroporation 연구에 사용되었습니다. 이 윈도우 기술은 배아에 조작 후 생존을 요구하는 절차와 함께 사용할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating incubator | Profi | Maintain at 37° Degrees with relative humidity set above 60% | ||
| 70 % EtOH | ||||
| gauze | ||||
| 3M plastic tape | ||||
| 10cc syringe | 1/egg | |||
| 18G needles | 1½ inch needle, 1/syringe | |||
| Dissection scissors | 4" sharp straight blades | |||
| Fertilized Eggs |
References
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).
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- Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).
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