Summary
مجموعة متنوعة من العوامل المساعدة على النمو وبروتينات الخلايا تتفاعل للحث على تحمل مصائر مختلفة من الخلايا خلال التنمية. نحن هنا لشرح استخدام من البيضة استعدادا لمواجهة التفاعلات المحتملة بين مختلف البروتينات في التنمية من خلال وضع حبات الحمص E2.5 على الأجنة.
Abstract
الأنبوب العصبي يعرب العديد من البروتينات في أنماط محددة خلال spatiotemporal التنمية. وقد تبين أن هذه البروتينات لتكون حاسمة لتحديد مصير الخلايا ، والهجرة الخلية ، وتشكيل الدوائر العصبية. تحريض الخلايا العصبية والعظام تشمل الزخرفة تخلقية البروتين (BMP) ، القنفذ الصوتي (SHH) ، عامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل) ، وبين الآخرين. على وجه الخصوص ، تعبيرا عن نمط Fgf8 هو على مقربة من المناطق معربا عن BMP4 وSHH. هذا النمط هو التعبير بما يتفق مع التفاعلات التنموية التي تسهل الزخرفة في telencephalon.
هنا نقدم مظاهرة البصرية من الطريقة التي يمكن استخدام البيضة في التحضير لاختبار آثار Fgfs في تشكيل الدماغ المقدم. والمغلفة مع حبات من البروتين ، ووضعها في أنبوب العصبي النامية لتوفير التعرض المستمر. لأن يستخدم الإجراء الصغيرة والخرز وضعت بعناية ، فمن مينيملي ويسمح لتوضع حبات عدة داخل أنبوب العصبي واحدة. وعلاوة على ذلك ، فإن الأسلوب يسمح لاستمرار التنمية بحيث يمكن تحليل الأجنة في مرحلة اكثر نضجا للكشف عن تغيرات في التشريح والعصبية في الزخرفة. هذا البروتوكول بسيطة ولكنها مفيدة تسمح للتصوير في الوقت الحقيقي. فإنه يوفر وسيلة لإحداث تغييرات محدودة مكانيا وزمانيا إلى مستويات البروتين الذاتية.
Protocol
1. إزالة البيض من الحاضنة
في E2 - 2.5 (17 ~ سانت سمو) ، إزالة البيض وإعدادهم وفقا لذلك. يمكن عملوا على الفور أو إعادتها إلى حاضنة لبضع ساعات. يمكن وضع البيض في درجة حرارة الغرفة بأمان لأكثر من ساعة. البيض يمكن أن تبقى خارج لمدة التلاعب. أحيانا يمكن لهذه يستغرق ساعة أو أكثر.
ملاحظة : يعد من الجلوس في درجة حرارة الغرفة ، وأقل احتمالا أنها من أجل البقاء.
2. إعداد الحبر الهند
- يعد حلا جديدة من الحبر الهند بنسبة 4 ٪ في برنامج تلفزيوني العقيمة.
- حقنة ملء مل 3 مع الحل.
- وضع إبرة قياس 27 ½ ، بوصة على الحقنة.
- باستخدام زوج من المرقأة ، ينحني الإبرة إلى زاوية 90 درجة.
3. فتح البيض وحقن الحبر الهند
- باستخدام زوج من الملقط ، قشر الشريط الى الوراء وفتح النافذة ، وذلك باستخدام تأمين الجانب العكسي للشريط على الجانب الخلفي من البيض.
- دليل الإبرة في الزاوية حتى انها تقع فقط تحت الجنين. وضع الإبرة تحت القرص عائم يؤمن أن الحبر ، والتي هي سامة بالنسبة للجنين ، لن تأتي في الاتصال المباشر.
- تحتاج إلى ضخ الحبر فقط ما يكفي لخلق النقيض مريحة. هذا هو عادة أقل من ربع مل.
4. فتح الأنبوب العصبي
- أخذ مقص تشريح غرامة وقطع غشاء رقيق التي تقع على أعلى ، أو في بعض الأحيان حولها ، والجنين.
- أخذ الزوج من 55 ملقط أو التحقيق التنغستن وفتح الأنبوب العصبي الخلفي من لالأمامي. تأكد من أن فتح هي كبيرة بما يكفي لوضع حبة فيه.
ملاحظة : اعتمادا على العمر ، ويمكن استخدام مسبار التنغستن غرامة أن تفعل الشيء نفسه.
5. استرداد مغلفة الهيبارين - الاكريليك حبة
- باستخدام زوج من 55 ملقط ، والعثور على حبة سليمة في الحل. السماح للحبة تعلق نفسها إلى الطرف ، على مقربة ببطء ملقط.
- إزالة حبة من الحل ، وجعله على رأس أكثر من البيض.
- مرة واحدة خارج حبة من حلها ، فإنه لن يأتي على الأرجح قبالة حتى تم وضعها في ألبومين.
6. وضع حبة
- مرة واحدة وقد تم وضع حبة على رأس المنطقة المستهدفة ، واستخدام مسبار التنغستن لترشدها نحو الدماغ الأمامي أو إصلاحه في الدماغ المؤخر.
- إضافة بضع قطرات من برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة 10 ميكرولتر.
7. إغلاق البيض
- إغلاق البيض باستخدام قطعة رقيقة من الشريط لاغلاق النافذة.
- ختم البيض وفقا للبروتوكول الإستعداد ، وهي متاحة على http://jove.com/index/Details.stp؟ID=306 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اعتمادا على البروتينات التي ترغب في استخدامها ، وهناك بروتوكولات مختلفة حول كيفية إعداد الخرز. في هذه التجارب ، ونحن نستخدم الهيبارين - الاكريليك الخرز ، ولكن يمكن استخدامها أيضا افى هلام حبات يكون. لقد وجدنا أن الهيبارين - الاكريليك الخرز هي أسهل للتلاعب في البيئة المائية من زلال البيض. الخرز هي غارقة في 5 لتر من البروتين بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. توضع حبات التحكم في برنامج تلفزيوني العقيمة حتى وقت التنسيب. ميزة في استخدام استعدادا البيضة هو أن الجنين لا يزال على قيد الحياة والحرية في وضع طبيعي 1. بالرغم من أنه يمكن السيطرة على البيئة التي أبقت على ازدراع للمتغيرات معينة ، يعيش الجنين يسمح لتمثيل دقيق لتؤثر على البروتين على أنماط تنموية 2-3. جميع المقايسات التي يمكن تنفيذها على يزدرع ، يمكنك مع الجنين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD Biosciences | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments, Inc. | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
References
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
