Summary
성장 요인과 단백질의 다양한 세포가 개발하는 동안 다른 세포 운명을 맡을 유도하는 상호 작용. 여기 E2.5 여자의 배아에 구슬을 배치하여 개발에 서로 다른 단백질 간의 상호 작용 가능성을 해결하기 위해 비켜 준비의 사용을 보여줍니다.
Abstract
신경 튜브 개발하는 동안 특정 spatiotemporal 패턴에 많은 단백질을 표현하고 있습니다. 이러한 단백질은 세포 운명 결정, 세포 마이 그 레이션 및 신경 회로 형성을 위해 중요한 것으로 표시되었습니다. 의 연결을 유도하고 patterning 다른 사람 사이에 뼈 morphogenetic 단백질 (BMP), 소닉 헤지 호그 (쉬이잇), fibroblast의 성장 인자 (FGF)를 포함. 특히, Fgf8의 표현 패턴 BMP4 및 쉿 표현 지역 가까이에 있습니다. 이 표현식 패턴은 telencephalon의 patterning을 촉진 발달 상호 작용과 일치합니다.
우리가 비켜 준비가 forebrain의 형성에 Fgfs의 효과를 테스트하는 데 사용할 수있는 방식의 시각적 데모를 제공합니다. 비즈는 단백질로 코팅하고 지속적인 노출을 제공하는 개발 신경 튜브에 배치됩니다. 절차는 작고, 신중하게 배치 구슬을 사용하기 때문에, 그것은 법으로서 여러 구슬이 하나의 신경 튜브 내에 배치 수 있습니다. 배아는 해부학과 신경 patterning의 변화를 감지하는보다 성숙한 단계에서 분석할 수 있도록 또한, 방법은 지속적인 발전을 위해 수 있습니다. 이 간단하지만 유용한 프로토콜은 실시간으로 영상을 허용합니다. 그것은 내생 단백질 수준에 공간과 temporally 제한을 변경할 수있는 수단을 제공합니다.
Protocol
1. 인큐베이터에서 계란을 제거합니다
E2 - 2.5에서 (~ 성 17 HH), 계란을 제거하고 그에 따라 그들을 준비합니다. 그들은 즉시에 근무하거나 몇 시간 동안 인큐베이터에 제공될 수 있습니다. 계란은 한 시간 넘게 안전하게 상온에서 설치할 수 있습니다. 계란은 노는 기간 동안 빠져 있습니다. 때때로 이들은 한 시간 이상이 걸릴 수 있습니다.
참고 : 더 이상 그들은 상온에서 앉아, 확률 그들이 생존하는 것입니다.
2. 인도 잉크의 준비
- 멸균 PBS에서 4퍼센트 인도 잉크의 새로운 솔루션을 준비합니다.
- 솔루션 3 ML의 주사기를 채우십시오.
- 주사기에 27 게이지, ½ 인치의 주사를 놓으십시오.
- hemostats 한 켤레를 사용하여 90 ° 각도로 바늘을 구부.
3. 인도 잉크의 계란과 사출 열기
- 다시 테이프 껍질, 포셉 한 켤레를 사용하고 계란의 뒷면에 테이프의 뒷면을 사용하여 그것을 확보, 창을 엽니다.
- 그것은 배 (胚) 아래에 자리잡고 단지까지 직각 바늘에 가이드. 부동 디스크에서 바늘을 배치하면 배아에 독성있는 잉크가, 직접 접촉되지 않습니다 처리됩니다.
- 당신은 편안하게 대조를 만들 정도로 잉크를 주입에만 필요합니다. 이것은 일반적으로 ¼ ML보다 적습니다.
4. 신경 튜브 열기
- 미세 절개의 가위를 타고 꼭대기에 자리잡고 얇은 막, 혹은 때로는 주위의 배아를 잘라.
- 55 포셉 한 쌍의 또는 텅스텐 탐침을 가지고 앞쪽이 후부에서 신경 튜브를 엽니다. 시작가에 구슬을 배치하기 위해 충분히 큰 있는지 확인하십시오.
참고 : 나이에 따라 훌륭한 텅스텐 프로브가 같은 일을하는 데 사용할 수 있습니다.
5. 코팅 헤파린 - 아크릴 비드를 검색하는
- 55 포셉 한 켤레를 사용하여 솔루션에 그대로 구슬을 찾으십시오. 비드가 끝에 자신을 첨부하자 천천히 포셉를 닫습니다.
- 솔루션에서 비드를 제거하고 계란 위에 그것을 데려와.
- 비드는 솔루션의 아웃되면 그것은 알부민에 배치되었습니다 때까지 그것은 가능성에서 오지 않습니다.
6. 비드 배치
- 비드는 대상 지역의 상단에 배치되면, forebrain 방향을 안내하거나 hindbrain에서 문제를 해결하기 위해 텅스텐 탐침을 사용합니다.
- 10 μL 피펫을 사용하여 PBS 몇 방울을 추가합니다.
7. 계란 닫기
- 창을 종료하는 테이프의 얇은 조각을 사용하여 계란을 닫습니다.
- 에서 사용할 수있는 준비 프로토콜에 따라 계란, 인감 http://jove.com/index/Details.stp?ID=306을 .
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Discussion
사용하고자하는 단백질에 따라 구슬을 준비하는 방법에 대한 다른 프로토콜이 있습니다. 이 실험에서, 우리는 헤파린 - 아크릴 구슬을 사용하지만 affi - 겔 비즈도 사용할 수 있습니다. 우리는 헤파린 - 아크릴 구슬은 알부민 계란의 수성 환경에서 조작하기 쉽게 것으로 나타났습니다. 비즈 4 ° C.에서 하룻밤 단백질의 5리터에 적셔 놓은 거지 제어 구슬은 배치의 시간까지 멸균 PBS에 배치됩니다. 비켜 준비를 사용하여 장점은 배아가 아직 살아와 정상적으로 한 개발 무료이다. explant가 유지되는 환경이 특정 변수에 대해 제어할 수 있지만, 살아있는 배아가 발달 패턴에 단백질 2-3의 영향을의 정확한 표현을 허용합니다. 당신이 explant에서 수행할 수있는 모든 assays, 당신은 배 (胚)와 함께하실 수 있습니다.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD Biosciences | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments, Inc. | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
References
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
