Summary
Çeşitli büyüme faktörleri ve proteinler, hücre gelişimi sırasında farklı hücre kaderi almaya ikna etmek için etkileşim. Burada E2.5 civciv embriyolarının boncuk koyarak gelişimin farklı proteinler arasındaki etkileşimleri adresine ovo hazırlanmasında kullanımı göstermektedir.
Abstract
Nöral tüp gelişimi sırasında özel Spatiotemporal desen birçok proteinleri ifade eder. Bu proteinler, hücre kaderinin belirlenmesi, hücre göçü ve nöral devrelerin oluşumu için kritik olduğu gösterilmiştir. Nöronal indüksiyon ve desenlendirme, diğerlerinin yanı sıra, kemik morfogenetik proteini (BMP), sonik kirpi (SSH), fibroblast büyüme faktörü (FGF), içerir. Özellikle, Fgf8 ifade deseni BMP4 ve SSH ifade bölgelere yakınlığı. Bu ifade, desen telencephalon desenlendirme kolaylaştırmak gelişimsel etkileşimler ile tutarlıdır.
Burada bir yöntem ovo hazırlık önbeyin oluşumunu FGFs etkilerini test etmek için kullanılabilir hangi bir görsel gösteri sağlar. Boncuk protein ile kaplı ve sürekli maruz kalma sağlamak için gelişmekte olan nöral tüp yerleştirilir. Prosedürü, küçük, özenle yerleştirilen boncuklar kullandığı için, bu minimal invaziv ve çeşitli boncuk tek bir nöral tüp içinde yerleştirilmesini sağlar. Ayrıca, yöntem embriyolar, daha olgun bir aşamada anatomi ve sinir dokusunda değişiklikleri belirlemek için analiz edilebilir, böylece sürekli gelişimi için olanak sağlar. Bu basit ama kullanışlı bir protokol gerçek zamanlı görüntüleme için izin verir. Endojen protein düzeyleri mekansal ve zamansal olarak sınırlı değişiklikler yapmak için bir araç sağlar.
Protocol
1. Inkübatör yumurta kaldırın
E2-2.5 (~ St 17 HH), yumurta kaldırmak ve onları buna göre hazırlamak. Onlar hemen üzerinde çalışmış ya da bir kaç saat için inkübatör iade edilebilir. Yumurta, bir saatten fazla oda sıcaklığında güvenle yerleştirilebilir. Yumurta manipülasyonlar süresi dışında kalmak. Bazen bu bir saat veya daha fazla sürebilir.
Not: uzun süre oda sıcaklığında oturup, daha az olasılıkla onlar hayatta kalmak için.
2. Çini mürekkebi hazırlanması
- % 4 steril PBS Hindistan Mürekkep taze bir çözüm hazırlayın.
- Çözümü ile 3 ml şırınga doldurun.
- Şırıngaya 27 gauge ½ inç iğne yerleştirin.
- Hemostat bir çift kullanarak, 90 ° lik bir açı ile iğne bükün.
3. Açılış çini mürekkebi, yumurta ve enjeksiyon
- Geri bant kabuğu, bir çift forseps kullanma ve yumurta arka yüzünde bandın ters tarafında kullanarak güvenliği, pencereyi açmak.
- Embriyo hemen altında yer kadar açılı iğne Kılavuzu. Kayan diskin altına iğnenin embriyo için toksik olan mürekkep, doğrudan temas etmeyeceğini garanti eder.
- Rahat bir kontrast oluşturmak için yeterli mürekkep enjekte etmek gerekir. Bu genellikle ¼ ml daha azdır.
4. Nöral tüp açma
- Bir çift ince diseksiyon makas alın ve üstünde yer alan ince bir zar veya bazen etrafında, embriyonun kesmek.
- 55 forseps veya tungsten probu bir çift atın ve anterior posterior nöral tüp açık. Açılış içine bir boncuk yerleştirmek için yeterince büyük olduğundan emin olun.
Not: yaşına bağlı olarak, ince bir tungsten prob aynı şeyi yapmak için kullanılabilir.
5. Kaplamalı bir heparin-akrilik boncuk alınıyor
- 55 forseps bir çift kullanarak sağlam bir boncuk, çözüm bulabilirsiniz. Boncuk ucu tutunmasını, forseps yavaşça kapatın.
- Çözüm boncuk çıkarın ve yumurtanın üstüne getirmek.
- Albümin yerleştirilen kadar, boncuk çözümü sonra büyük olasılıkla kapalı gelmemiş olacaktır.
6. Boncuk yerleştirmek
- Boncuk hedef alan üst verildikten sonra, önbeyin doğru veya Beyin bunu düzeltmek için bir tungsten prob kullanın.
- 10 mcL pipet kullanarak PBS birkaç damla ekleyin.
7. Kapanış yumurta
- Pencereyi kapatmak için ince parça bant kullanarak yumurta kapatın.
- Prepping protokole göre yumurta, mevcut Seal http://jove.com/index/Details.stp?ID=306 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kullanmak istediğiniz protein bağlı, boncuklar nasıl hazırlamak için farklı protokoller vardır. Bu deneylerde, heparin-akrilik boncuk, ancak Affi-jel boncuklar da kullanılabilir. Biz heparin akrilik boncuk, albümin, yumurta, sulu bir ortamda işlemek için kolay olduğunu bulduk. Boncuk 4 ° C'de gece protein 5 l batırılmış Kontrol boncuklar yerleştirme zamanına kadar steril PBS yerleştirilir. Ovo hazırlanmasında kullanarak avantaj embriyo hala hayatta ve normalde 1 geliştirmek için ücretsiz olmasıdır. Bir eksplant tutulduğu bir ortamda, belirli değişkenler için kontrol edilebilir olsa da, canlı embriyo gelişim modelleri üzerinde bir protein 2-3 etkileyecek doğru bir temsilini sağlar . Eksplant gerçekleştirebileceğiniz tüm yazı, bir embriyo ile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD Biosciences | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments, Inc. | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
References
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
