Summary
Tregs הם מדכאי עוצמה של מערכת החיסון. קיים מחסור של סמנים משטח ייחודי להגדיר אותם, ולכן, הגדרות של Tregs הם פונקציונליים בעיקר. כאן אנו מתארים אופטימיזציה
Abstract
תקינה בתאי T (Tregs) הם מתווכים קריטית של סובלנות החיסונית העצמית אנטיגנים. בנוסף, הם הרגולטורים חיוני של התגובה החיסונית בעקבות זיהום. למרות המאמצים כדי לזהות סמן משטח ייחודי על Tregs, התכונה הייחודית רק הוא יכולתם לדכא את שגשוג ותפקוד של תאים T מפעיל. בעוד שברור כי רק מבחני חוץ גופית ניתן להשתמש בהערכת תפקוד Treg אדם, זה הופך להיות בעייתי כאשר להערכת תוצאות חתך מחקרים שבהם תאים בריאים ותאים שבודדו נבדקים עם מחלות אוטואימוניות (כמו סוכרת מסוג 1-T1D) צורך כדי להשוות. קיימת שונות רבה בין מעבדות במספר וסוג של תאים המגיב T, טבע וכוח של גירוי, Treg: יחסי המגיב לבין מספר וסוג אנטיגן הצגת תאים (APC) בשימוש האדם מבחני חוץ גופית דיכוי. השתנות זו הופכת את ההשוואה בין המחקרים מדידת תפקוד Treg קשה. השדה Treg צריך assay דיכוי סטנדרטית זה יעבוד גם עם שני אנשים בריאים ואנשים עם מחלות אוטואימוניות. פיתחנו ב assay דיכוי במבחנה שמראה מעט מאוד התוך assay משונות גירוי של תאים T מבודד במתנדבים בריאים לעומת נבדקים עם הבסיס הרס אוטואימונית של הלבלב β-תאים. המטרה העיקרית של היצירה הזאת היא לתאר ב assay דיכוי במבחנה אנושי המאפשר השוואה בין קבוצות נושא שונות. בנוסף, assay הזה יש פוטנציאל להתוות הפסד קטן nTreg לתפקד צופים הפסד נוסף בעתיד, ובכך נושאים בזיהוי מי יכול להפיק תועלת מטיפול מניעתי המערכת החיסונית 1. להלן, אנו מספקים תיאור מעמיק של השלבים הכרוכים בהליך זה. אנו מקווים לתרום סטנדרטיזציה של ב assay דיכוי חוץ גופית המשמשת למדידת תפקוד Treg. בנוסף, אנו מציעים זה assay ככלי לזהות מצב של חוסר איזון מוקדם החיסונית סמן פונקציונלי פוטנציאל T1D.
Protocol
1. לפני הקמת assay דיכוי, צריך חרוזים מעיל tosylactivated עם אנטי אנושי CD3 (שיבוט UCHT1, 1μg/ml הריכוז הסופי) לגירוי התא ולאחר מכן לבדוק אם חרוזים הם מצופים ביעילות על ידי הגדרת ב assay שגשוג במבחנה באמצעות אדם T לתאים
- קח 1ml של M-450 חרוזים tosylactivated מבקבוקון המקורי, מקום לעמוד מגנטי להחזיק עד שכל החרוזים יש דבק בצד של הצינור. הסר את חיץ תוך הצינור עדיין עומדים המגנטי. קחו את הצינור מתוך עמדה מגנטי להוסיף 1ml של buffer1, במקום את הצינורית לעמוד מגנטי שוב להסיר את buffer1 תוך צינור הוא עומד המגנטי; חרוזים resuspend ב 1ml של buffer1 ולהוסיף 40μl של CD3 אנטי אנושית, להתסיס בשעה 37 ° C במשך 15 דקות, להוסיף 0.1% w / v BSA ולהמשיך התססה במשך 16 השעות הבאות.
- לשטוף את החרוזים buffer2 פעמיים במשך 5 דקות ב 2-8 מעלות צלזיוס ופעם buffer3 במשך 5 דקות ב 2-8 מעלות צלסיוס תוך שימוש לעמוד מגנטי כפי שהוסבר לעיל, להסיר את החיץ ואת resuspend את החרוזים 1ml של buffer2; חרוזים הם 8 / ml 4x10 ריכוז סופי ומוכן לשימוש.
- Aliquot 50,000 ו 25,000 PBMC / היטב triplicates בצלחת 96-היטב ולהוסיף מספר משתנה של CD3 מצופה חרוזים (4x10 8 חרוזים / ml, CD3 1μg/ml, למשל 1, 2, 3, 4, 5 חרוזים / תא ) על מנת לקבוע את המספר האופטימלי של חרוזים לכל תא. לאחר 72 שעות בתרבית, להוסיף 1μCi [3 ח] thymidine ולהמשיך דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 16 השעות הבאות. תאים בצלחת קציר קציר Multiscreen (Millipore), להוסיף נוזל הנצנץ ולקרוא לכל ספירות דקות (CPM) / גם באמצעות למעלה הרוזן NXT (פקארד, CT). השתמש חרוזים / יחס התא כאשר הם מעל לאלף הופעות 5000 אך פחות מ 15,000 כדי למנוע גירוי יתר של Tregs, אשר עלול לאבד את הפונקציה מדכאים. בדרך כלל, יחס של 3 חרוזים / תא מעורר שני המגיב ותאי Treg בכל קבוצות הנושא נבדק עד כה 1-4.
2. PBMC במנותק מן הדם כולו מתורמים בריאים או leukopacks אדם או מעיל באפי (BC) שנלקח בדרך כלל ממקורות מתנדבים בריאים וזמינים ללא תשלום מרכזי עירוי דם מקומי (איור 1)
- לדלל את לפנה"ס (~ 50 מ"ל) 01:06 עם PBS (להוסיף 250 מ"ל). עכשיו יש הנפח הכולל 300 מ"ל. לאט לאט שכבת 25ml של BC מדולל על גבי 15 מ"ל Ficoll Paque-PLUS הוסיף 50 מ"ל צינורות פלקון, מבלי להפריע את השכבות. צנטריפוגה ב 800xg (1400rpm בצנטריפוגה Sorvall עם דלי הרוטור מתנדנד SH-3000) במשך 30 דקות ב 4 ° C, עם הבלמים כבוי.
- בזהירות לאסוף את שכבת PBMC (שלב ביניים) ולהעביר אותו ל 50 מ"ל צינורות טרי פלקון. לשטוף PBMC ידי מילוי צינורות עד 50 מ"ל עם DPBS. איסוף 2 כדורי תא לתוך צינור אחד. צנטריפוגה ב 400xg במשך 10 דקות ב 4 ° C. חזור כביסה צעד פעמיים, בכל פעם שילוב 2 כדורי תא לתוך צינור אחד. מערבבים את כל כדורי תא לתוך שפופרת 50 מ"ל אחד.
- הרוזן PBMC באמצעות Trypan מבחן כחול הדרה. ביצוע דילול 1:10 ב Trypan כחול על ידי הוספת 20μl של PBMC כדי 180μl של Trypan כתם כחול. מערבבים היטב ולקחת 20μl לספור hemacytometer מיד. ספירת המספרים של כל התאים מוכתמת בלא כתם כחול רק ממוקם שני רחובות כל ריבוע ובו 16 ריבועים קטנים יותר. קח את הממוצע של שני המספרים ולהתרבות על ידי 10. מחלקים את המספר הזה על ידי 100 כדי לקבל את מספר PBMC / ml. אחוז תאים לחשב כמו קיימא [1 - (מספר התאים כחול / מספר התאים הכולל) x100]. אם המשך הכדאיות היא ≥ 95%.
3. MACS מראש מסוג CD4 ותאי T
- לפני שנמשיך, העברת 1ml של PBMC לתוך צינור חדש, להוסיף 4ml התקשורת להכין תאים עם הקרנה 5000rad, אלה יהיו אנטיגן הצגת תאים (APC).
- צנטריפוגה שאר התאים בכל 250xg במאגר PBS/2mM BSA EDTA/0.5% עבור 10min ב 4 ° C. יוצקים את התאים supernatant ו resuspend ב 4ml של חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%.
- הוסף 200μl של microbeads MACS אנטי CD4 ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
- שטפי ידי הוספת 40ml של חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5% ו צנטריפוגות ב 250xg עבור 10min ב 4 ° C. יוצקים את supernatant ו resuspend ב 8ml של הטמפרטורה degassed, חדר חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%.
- מסנן להפריד את ההשעיה התא באמצעות טרום הפרדה מסננים אותם לפני העמסה על עמודה LS.
- פיצול ההשעיה התא 4ml שכבה כל עמודה LS מכויל על (עם 3ml של deggassed חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%). טור קבוע ב LS מפריד MidiMACS. לפני ההשעיה תא שנגמר, או להפעיל מחדש flowthrough או להוסיף 3ml של בטמפרטורת החדר deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% חיץ BSA ולתת למאגר לרוץ דרך. הוסף חוצץ יותר עד שזה מגיע ברורה החוצה.
- חיץ פיפטה 5 מ"ל deggassed על הטור LS, להסיר עמודה LS מ מפריד MidiMACS ומקום לתוך צינור איסוף סטרילית חדש 15 מ"ל לתת ~ לרוץ 1.0ml דרך. מכניסים את הבוכנה לתוך עמוד ולאט לאט לדחוף את שארנפח החוצה.
- לעשות את אותו הדבר עם שתי עמודות LS לשלב את שני שברים מסוג CD4 +. הוספת עד 50 מ"ל תאים PBS ולספור. התשואה הצפויה היא עד 5x10 8 תאים. צנטריפוגה ב 400xg במשך 10 דקות ותאי resuspend היטב 2ml חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%.
4. מיון פלורסנט Activated Cell (FACS) בידוד (איור 2)
- הפוך את קוקטייל של נוגדנים סמנים CD אל פני השטח סמנים הבאים לתא (לשמור מוגנים מפני אור): 20 μl של אנטי אנושי CD8-FITC (שיבוט RPA-T8), 20 μl של אנטי אנושי CD14-FITC (שיבוט M5E2; קולטן LPS), 20 μl של אנטי אנושי CD32-FITC (שיבוט FLI8.26; FcγR-type II) 6 μl של אנטי אנושי CD116-FITC (שיבוט M5D12: GM-CSFRα שרשרת) וכן, לחילופין, להוסיף אנטי 40μl אדם-CD4-APCCy7 (שיבוט RPA-T4).
- קח 5μl מתוך ההשעיה תא 2ml ואת הכתם עם 2μl של קוקטייל כתם, זה צינור לקביעת סף (Fluorochrome מינוס אחד FMO) 5.
- הוסף 50 μl של אנטי אנושי CD25-PE (שיבוט M-A251, IL-2Rα) לקוקטייל כתם, ולהוסיף את קוקטייל ההשעיה התא דגירה על 4 מעלות צלזיוס 30 דקות. שטפו תאים PBS חיץ, צנטריפוגות ב 400xg במשך 10 דקות ותאי resuspend לריכוז תאים של 10 7 / מ"ל.
- הכן בלא כתם תאים תאים או חרוזים מוכתם fluorochrome יחיד שישמש לשלוט פיצוי מיון התא על FACS אריה (BD Biosciences, סן חוזה, ניו ג'רזי).
- רוכשת את התאים בצינור FMO אשר יאפשר למשתמש להגדיר את סף למיון של CD25 תאים + T (איור 2 א). קביעת השער סביב FITC שלילי תאים להוציא FITC חיובי התאים המרכיבים מונוציטים, מקרופאגים וכל CD4 + אחרים שאינם-T לתאים (איור 2b).
- בחלקה נפרדת, לצייר השערים-CD25, CD25low ו CD25high T-Tregs התאים (למעלה 1% של תאים המבטאים את המספר הגבוה ביותר של CD25) (איור 2 ג). תת Cell בדרך כלל להראות הטוהר גבוהה (איור 2, 2e ו 2f).
- צנטריפוגה צינורות אוסף עם תאים ב 400xg במשך 10 דקות ולשמור אותם על הקרח עד ציפוי.
5. הגדרת התרבות תאים בצלחת 96-היטב (ערכת המצורף טבלה 1) ב 200μl/well
- 50μl Aliquot של CD3 מצופה חרוזים (1 מיקרוגרם / מ"ל) מחושב להיות 3 חרוזים / תא המגיב היטב, resuspended בתקשורת להשלים עם 10% נקווה האדם א.ב. בסרום בתחתית U-96-גם הצלחות. (לדוגמה, כדי להפוך את התקשורת עם 2ml CD3 מצופה, לקחת 7.5μl ממלאי של CD3 חרוזים מצופים הגמר 4x10 ריכוז 8 / מ"ל ו לדלל ב 2ml של התקשורת; 50μl כל יכיל 75,000 beads-3beads/cell).
- מדולל APC מוקרן ריכוז 5x10 תא 5 / ml ולהוסיף 50μl (יכיל 2.5 x 10 4 תאים) לתוך הבאר עם כל גירוי נוסף בעבר, כולל בארות שכותרתו "Tregs בלבד", "APC רק" ו "התקשורת רק" בטבלה 1.
- הוסף 2.5 x 10 4 / טוב CD4CD25 או CD4CD25low בתאי T ב triplicates הבאים עיצוב בטבלה 1.
- הוסף Tregs לשתף תרבויות (שורה ב 'טבלה 1) ביחס 1:10 (2500 תאים Treg) ו לבארות שכותרתו "Tregs רק" ו דגירה את הצלחת ב 37 ° C ב-CO 2 באינקובטור עם 5% CO 2 , רווי בלחות למשך 72 שעות.
- דופק בארות עם 1μCi [3 ח] thymidine ולהמשיך הדגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 השעות הקרובות.
6. קציר ועוד היד נטויה
- קציר תאים על הצלחת הקציר multiscreen באמצעות Packard filtermate מקצרה או מערכת חלופית.
- הוסף נוזל הנצנץ (Microscint 20), מכסים קצירת צלחת עם מכסה פלסטיק שקוף כהכנה לשלב הסופי.
- קריאה לכל ספירות דקות (CPM) / גם באמצעות למעלה הרוזן NXT (פקארד, CT) או מערכת חלופית.
7. מחשוב אחוז דיכוי
- כאשר התאים בתרבית triplicates, הממוצע מחושב עבור כל תנאי. אם מקדם השונות הוא> 30%, outlier מסולקת ו לדקה רק שתי בארות הם ממוצעים. אחוז דיכוי מתקבל על ידי מחשוב [(sc) / s] x 100%, כאשר s = לדקה בתרבות אחת c = לדקה בתרבות המשותפת.
- כפי נאיבי (CD25-) ו - in vivo מופעל (CD25low) ותאי T מפעיל הם מצופה כמו תאים המגיב T, ההבדל ביכולת של Tregs לדכא כל תת אלו שנתפסו בשימוש כמדד מנבא פוטנציאל תפקודי מבוסס על ההנחה כי תאי מופעל קשה יותר לדכא.
8. נציג תוצאות:
השונות הגדולה בשיטות המשמש והתוצאות הנגזרות ב assay דיכוי במבחנה האדם מתבקש לנו לבצע מחקר מקיף על התנאים המשפיעים על assay 1. פיתחנו assay כי בדיקות לא רק פונקציה Treg, אלא גם הטוהר שלהם, בהתחשב יחס נמוך בין Tregs: Teffs (01:10), אשר קבענו קודם 6. בנוסף, Tregs שונים הeir היכולת לדכא בהצלחה נאיבית in vivo המופעל בתאי T גם בנבדקים בריאים, כפי שמוצג באיור 3 ו במחקרים קודמים שלנו 2,4, אשר הופך בולט יותר, אם האיזון החיסונית נפגעת, כמו נושאים בסיכון לפתח T1D . Assay עבדו היטב במחקר שבו אנו מדכאים לעומת פונקציה של טבע (nTregs), ועין מתנהלת (iTregs) והן nTregs במבחנה מורחב, המאפשר לנו להשוות בין תפקידם לשלוט בריא, לאחרונה התפרצות (RO) T1D ו ארוכת שנים (LS ) נושאים T1D. הגענו למסקנה נושאים T1D RO לו יכולת טובה יותר לייצר תפקודית בשתי iTregs ו nTregs התרחב בהשוואה לנושאים LS לשלוט T1D ובריא 7. לפיכך, assay זה יכול לשמש ככלי מעולה הכרה של מדינה בשלבים מוקדמים ומאוחרים של חוסר איזון מערכת החיסון.
1 תוכנית סכמטי מצגת הצעדים מעורב ב assay דיכוי חוץ גופית
באיור 1. צעדים של דיכוי ב assay במבחנה הציג עם תמונות
איור 2. אסטרטגיה gating בבידוד תא FACS. סף) CD25 + הותאם על פי Fluorochrome מינוס אחת (FMO), ב) תאים היו סגורות כמו FITC שלילית, ג) FITC שלילי התאים היו מגודרת נוספים שנאספו CD + CD25-, CD + CD25low ו CD + CD25high ( Tregs) מוצג עם האחוזים, ד) FACS מיון Tregs לאחר מיון, ה) FACS מיון CD + CD25low לאחר מיון, ו) FACS CD4 + CD25 מיון-T לתאים לאחר מיון
איור 3. תוצאות נציג של נבדקים בריאים) תוצאות נציג ספירות לדקה (CPM) של נבדקים בריאים כפי שהוצגו תרבויות יחיד עבור כל תת תא מעורב (נאיבי-CD25-, in vivo הופעל-CD25low, אנטיגן הצגת תאים ו-APC T רגולטוריים תאים-Treg), כמו גם שיתוף ותרביות של תאים המגיב T (CD25 או CD25low) ו Tregs. ב) אחוז דיכוי כל CD25 ו CD25low המגיב בתאי T על ידי Tregs עצמיים מוצג עבור קבוצת הבקרה בריאים (n = 4). דיכוי היה כפי שחושב [(sc) / s] x 100%, כאשר s = לדקה בתרבות אחת c = לדקה בתרבות המשותפת. למרות הבדל קטן קיבולת של Tregs לדכא המגיב בתאי T היה שם לב, זה לא היה משמעותי (לזווג מבחן t p = 0.08). ג) הוצג הן של עותקים לדקה בכל הנושאים סיכון תרבות כל אחת, כולל CD25 ו CD25low כמו המגיב בתאי T, וכן APC ו Tregs, ושיתוף תרבויות שבו כל תת T המגיב תא זרע עם אחוז (CD25-/Tregs ו CD25low/Tregs). ד) Tregs של דיכוי של כל CD25 ו CD25low תאים המגיב T על ידי עצמיים Tregs מוצג בכל הנושאים סיכון (n = 4). ההבדל ביכולת של Tregs לדכא CD25-מול CD25low המגיב בתאי T היה משמעותי (לזווג מבחן t p = 0.04).
טבלה 1. סכמטי להגדיר ב assay של דיכוי חוץ גופית
| 1-3 | 4-6 | 7-9 | 10-12 | |
| CD4CD25- | CD4CD25low | התקשורת רק | התקשורת רק | |
| ב | CD4CD25-/ Tregs | CD4CD25low / Tregs | Tregs בלבד | APC בלבד |
| ג | ||||
| D | ||||
| E | ||||
| F | ||||
| G | ||||
| H |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי תכונה ייחודית רק Tregs, פונקציה מדכאים יש לבדוק באופן מהימן ואחיד בין הנושאים בשלבים שונים של התפתחות המחלה בתוך אותו בין מחקרים שונים. אנו מציעים פרטי assay דיכוי שפותחו במעבדה שלנו תרומתנו סטנדרטיזציה של assay זה. במחקר אופטימיזציה הנרחב שלנו, יש לנו קבעו כי גירוי תא T עם אנטי אנושי CD3 מצופה חרוזים (UCHT1 שיבוט, בריכוז של 1μg/ml (להבדיל 5μg/ml זמינים מסחרית) בשילוב עם PBMC כמו APC לספק גירוי טבעי מסוגל להפעיל גם הן תאים T ו המגיב Tregs בנושאים שנבדקו 1. הבחירה של נוגדן אנטי CD3 אדם היא בעלת חשיבות רבה, שכן בידינו רק נוגדן Ancell נתן את התוצאות הצפויות. גירוי סימולטני עם CD3 אנטי אנושי ואנטי CD28 אדם לא היה מספיק כדי לזהות הבדלים בין קבוצות נושא (תוצאות לא מוצגות), בעוד PBMC הציע לוח מלאה של שיתוף גירוי אותות, מגדילים את הסיכוי הולכת אותות וגירויים יעיל.
פרוטוקול זה יכול לשמש גם עם leukopacks דם החולה. ההבדל היחיד הוא את כמות הדם שצריכה להיות טעון על גבי PLUS Ficoll-Paque בהליך בידוד PBMC. מדיה המשמשים assay זה מכיל 10% נקווה האדם א.ב. בסרום, שאנו נחושים להיות תוספת נהדרת assay. עם זאת, לפני בשימוש, סרום צריך להיבדק על היכולת להפעיל PBMC PBMC על עצמו (שלה זרע sixplicate ולהוסיף להשלים התקשורת RPMI עם סרום הישן, ללא בסרום עם סרום חדש. הדופק לאחר 72 שעות צלחת, דגירה 16 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, תאים הקציר ולקבל קריאות CPM). עותקים לדקה מוגברת של PBMC תרבותי עם הסרום החדש אינו תוצאה טובה ומציע צורך בסרום עם מספר הרבה חדש.
יש לנו קבעו כי MACS המיון נעשה באופן ידני עם עמודה LS חדשה מדגם זה נותן תשואה טובה יותר ניכר של תאים מסוג CD4 + T לעומת Automax. בנוסף, טוהר Treg היה נחוש בדעתו להיות> 95%, דהיינו על ידי ביטוי CD25 (איור 2), חוסר שגשוג במבחנה (איור 3 א), מדכאים פוטנציאל גבוה בנבדקים בריאים ב 1:10 יחס בין Treg: המגיבים ( איור 3ab) והביטוי Foxp3 הגבוה ביותר בקרב מבודדת תת T תא (מידע לא מוצג). התאים לזהם מסולקות כמו מזבלה FITC במהלך FACS הליך מיון בשלב הבא (איור 2b). FACS מכתים של הסמן CD4 אין צורך וזה האוכלוסייה התא ניתן לראות דרך FSC במזימה בשילוב עם אנטי אנושי CD25, אולם זה יכול להיעשות. Tregs ממוינות כמו 1% העליון של תאים המבטאים את המספר הגבוה ביותר של CD25 בכל קבוצות נושא. החלת הליך קפדני על כל הנושאים של מעמד עצמאי למחלות אפשרה לנו להשתמש רק אחת היחס בין Tregs ואת המגיב ותאי T (01:10) בכל קבוצות הנושא נבדק. בנוסף, באותם תנאים לעבוד כל כך טוב את ההבדל Treg פוטנציאל מדכאים נתפסה בין נאיבי in vivo לתאי T מופעל לשמש המגיבים, אשר, בהתבסס על ההבדלים ביניהם, ניתן היה לצפות 1. קבענו גם כי לאחר FACS בתאים המיון צריך להיות סובב מטה בטרם הקים בשנת assay דיכוי.
הפצת נמדדה בעזרת thymidine tritiated. לחלופין, התפשטות תאים ניתן למדוד באמצעות 5-bromo-2'-deoxyuridine, אנלוגי פירימידין, אשר שולבו לתוך ה-DNA מסונתז החדש במקום thymidine. גילוי BrdU מבוסס על ניתוק של אירופיום, יון חייב נוגדנים להכיר BrdU (אנטי BrdU-EU), כי בהליך של גילוי אותות הקרינה יקבל שחרור ניתק כי ניתן למדוד fluorometer 8. על פי היצרן (DELFIA) assay זה רגישות דומה [3 ח] thymidine. מעקב אחר התפשטות תאים יכול להיעשות גם באמצעות, לדוגמה, נגזרות של מלח tetrazolium ב MTT או מבחני XTT זמינים ATCC, שם היחס בין מספר התא האות המיוצר יש הוקם לראשונה, המאפשר כימות spectrophotometric של השינויים בשער של התא התפשטות הכדאיות. עם זאת, חלופה אחרת היא שימוש כדאיות התא DHL ו assay שגשוג, מבוסס על כימות fluorimetric מספרים תא חי הכדאיות. בחירה אפשריים אחרים היא כתם המגיב בתאי T רק עם CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl אסתר) ולעקוב אחר צמצום של הכתם עם חלוקה כל הבא בזמן culturing. עם זאת, בהתאם גירוי בשימוש assay, דגירה ארוכה של יותר מ -48 שעות יכול לגרום פסגות נבדל של תאים CFSE חיובי. לפיכך, כל מבחני יש כמה יתרונות וחסרונות וצריך להיות מותאם להשגת התוצאות הרצויות.
לאלף הופעות עבור בדיקות אנטי אנושי CD3 מצופה מבוצעים תמיד עלPBMC בריאים הם צריכים להיות מעל 5000 אבל לא מעל 15,000 מנת חרוזים לשמש לסוג זה של assay. אנחנו בדרך כלל להגדיר חרוזים שונים / יחס התא כאשר בודקים כל אצווה של חרוזים שאנחנו עושים, וברוב המקרים יש לנו עותקים לדקה העקבי ביותר עם 3 חרוזים / תא עם 25,000 תאים / היטב. אנחנו בדרך כלל לחזור על הציפוי אם לאלף הופעות במהלך בדיקות האצווה נמצאים מתחת 3000, עד שנגיע 5,000-15,000 לדקה / היטב. לכן, תהליך הציפוי נבדקה בכמה רמות ואנחנו רואים את זה אמין. לכן, כאשר המחיר לאלף הופעות של קבוצה מסוימת של נבדקים (כמו Auto-נוגדנים חיובי נושאים בסיכון לפתח T1D) באופן עקבי נמוך יותר לעומת אנשים בריאים, יש לנו סיבה להגיע למסקנה כי תהליך התמרה האות עשוי להיות בסכנה. , למרות מחקרים רבים השתמשו בתאים נאיבי כמגישי מבחני דיכוי שפורסם עד כה 9-12, כמה, למשל, השתמשו גם CD4 כמגישי בתנאים assay שונה מאוד 13 או PBMC כמגישי, בנוכחות PBMC כמו APC ו להגדיר אותם חד ושיתוף תרבות עם Tregs הוסיף 14 או 15 מונוציטים כמו מדכאי. למרות המחיר לאלף הופעות ייווצר כל הווריאציות assay ומסקנות על התפשטות ייעשה, אנו סבורים כי לאחר משנה אחיד טהורים תא כמגישי נותנת תוצאות ספציפיות יותר, בעל פוטנציאל להסיק מסקנות נוסף על שני Tregs ואת המגיבים. כפי assay דיכוי שלנו המובאים כאן כולל שני תת תא נפרד טהור כמגישי (CD4 + CD25 ו CD4 + CD25low), ניתן לקבל מידע רב ערך על הומאוסטזיס החיסון כאשר תוצאות בריאים מושווים או מושפעים נושאים בסיכון לפתח מחלה הנובעת ההפרעות של הומאוסטזיס החיסון (כמו T1D). כפי שמוצג על ידי מספר גדל והולך של מחקרים in vivo תאים מופעל T (CD4 + CD25low) מראות לקויה רגישות אפקט מדכא של Tregs 16-19. ההסבר המדויק על התנהגות הדורש חקירה נוספים. בנוסף לכך, אנו ואחרים הראו כי Tregs בנבדקים עם T1D לעשות יש פגם תפקודי 2,9,10, וזה נכון גם לגבי Auto-נוגדנים חיובי נושאים בסיכון לפתח T1D, כפי שהראינו איור 6 בדו"ח האחרון שלנו 1. אחת האפשרויות היא כי T מסוג CD4 כל התאים הנבדקים מושפעים בסיכון לפתח T1D להיות בעל מום שכיח הולכת אותות למנוע מהם להגיב על גירויים המשפיעים לתפקד כראוי ועל מפעיל שלהם. כתוצאה של הולכת אותות נפגעת, המגיב בתאי T יעורר לדקה נמוך יותר (שמוצג באיור 3c) ו Tregs לא לדכא ביעילות. האפשרויות זה או אחר להישאר כדי להיחקר נוספת. בשל לשחק תפקיד גדול Tregs בבריאות ומחלות, במעבדות רבות מדדו תפקוד Treg התאמת assay הצרכים והיכולות שלהם. לכן, גורמים רבים assay יכול להשתנות (המגיב / Treg, בידוד סוג ומספר של הטבע, המגיבים וכוח סוג גירוי, ומספר APC, היחס בין המגיב / Tregs, זמן תרבות, כמו גם שיטת מעקב אחר התפשטות ), המשפיעים על תפקוד Treg. עבודה זו, אם כן, יש מטרה כדי להתחיל בתהליך של סטנדרטיזציה של assay ומאפשר השוואה קלה וישירה של מחקרים שונים להערכת תפקוד Treg.
אם תתקבל, פרוטוקול זה יאפשר השוואה של פונקציה Treg בין מעבדות שונות בנושאים מושפע עם מחלות אוטואימוניות T1D אחרים. פרוטוקול זה כולל יישום רחב והוא יכול לשמש לצורך הערכה של תפקוד Treg של כל נושא, לא משנה של המחלה, אם כי ערך פרוגנוסטי שלה נוגע מחלות רק כי הם תוצאה של ההפרעות של הומאוסטזיס החיסונית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מקס McGee הלאומית למחקר המרכז לנוער Diabetesat לרפואה של וויסקונסין ומחקר ילדים של המכון ויסקונסין. הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, או הכנה של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Biosciences | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Biosciences | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Biosciences | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Biosciences | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Biosciences | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Biosciences | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Home made | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Home made | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Home made | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Home made | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | PerkinElmer, Inc. | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | EMD Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | PerkinElmer, Inc. | 6013621 |
References
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
- Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
- Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
- Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
- Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
- Major, J. L., Meade, T. J. B. ioresponsive Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
- Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
- Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
- Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
- Yoo, B., Pagel, An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
- Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
- Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
- Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
- Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
- Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).
