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Immunology and Infection

मानवीय इन विट्रो में इम्यून असंतुलन का एक प्रारंभिक राज्य की मान्यता के लिए स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में दमन

Published: July 22, 2011 doi: 10.3791/3071
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Pediatrics/Allergy, Medical College of Wisconsin, 2Flow Cytometry Core Facility, Medical College of Wisconsin, 3Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetes and Human Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin

Summary

Tregs प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रबल दमन कर रहे हैं. अद्वितीय सतह मार्करों की एक कमी के लिए उन्हें परिभाषित है, इसलिए, Tregs की परिभाषा मुख्य रूप से कार्य कर रहे हैं. यहाँ हम एक अनुकूलित वर्णन

Protocol

1. एक दमन परख की स्थापना से पहले, सेल और बाद में उत्तेजना के लिए एक मानव विरोधी CD3 (UCHT1 क्लोन, अंतिम एकाग्रता 1μg/ml) के साथ कोट tosylactivated मोती की जरूरत है की जाँच करें कि क्या मोती कुशलता से इन विट्रो प्रसार परख में एक की स्थापना मानव का उपयोग करके लेपित हैं टी कोशिकाओं

  1. मूल शीशी, चुंबकीय स्टैंड में जगह M-450 tosylactivated मोतियों की 1ml ले लो और पकड़ जब तक सभी मोती ट्यूब की ओर का पालन किया है. बफर निकालें जबकि ट्यूब चुंबकीय स्टैंड में अभी भी है. ट्यूब चुंबकीय स्टैंड के बाहर और buffer1 के 1ml जोड़ लो, चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब फिर से जगह और buffer1 हटायें जबकि ट्यूब चुंबकीय स्टैंड में है, 1ml buffer1 में resuspend मोती और मानव विरोधी CD3 के 40μl जोड़, 37 पर आंदोलन ° सी 15 मिनट के लिए, 0.1% w / ध् BSA जोड़ सकते हैं और अगले 16 घंटे के लिए आंदोलन जारी है.
  2. Buffer2 में मोती दो बार धो 2-8 ° C और एक बार buffer3 5 मिनट के लिए में 2-8 पर डिग्री सेल्सियस चुंबकीय स्टैंड का उपयोग कर के रूप में ऊपर समझाया पर 5 मिनट के लिए, बफर हटाने और 1ml buffer2 में मोती resuspend मोती हैं; 4x10 8 मिलीग्राम / अंतिम एकाग्रता और इस्तेमाल के लिए तैयार है .
  3. 50,000 विभाज्य और / अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से थाली में triplicates में और CD3 लिपटे मोतियों की चर संख्या (4x10 8 / मोती मिलीलीटर, CD3 1μg/ml, उदाहरण के लिए 1, 2, 3, 4, 5 मोती / सेल जोड़ने २५००० PBMC ) क्रम में सेल प्रति मोती का इष्टतम संख्या का निर्धारण करने के लिए. संस्कृति में 72 घंटे के बाद, 1μCi [3 एच] thymidine जोड़ने और 37 में incubating ° C अगले 16 घंटे के लिए जारी है . Multiscreen फसल प्लेट (Millipore) में हार्वेस्ट कोशिकाओं, जगमगाहट तरल जोड़ने और मायने रखता है (सीपीएम) प्रति मिनट / शीर्ष गणना NXT (पैकार्ड, सीटी) का उपयोग अच्छी तरह से पढ़ा. Tregs, जो दमनकारी समारोह खो सकता है के overstimulation से बचने के लिए मोती / सेल अनुपात जब सीपीएम को 5000 से ऊपर हैं, लेकिन कम से कम 15000 का उपयोग करें. आमतौर पर, 3 मोती / सेल का अनुपात इतना 1-4 तक परीक्षण सभी विषय समूहों में दोनों प्रत्युत्तर और Treg कोशिकाओं को उत्तेजित करता है .

2. पूरे रक्त से स्वस्थ दाताओं से या PBMC मानव leukopacks या buffy कोट (ई.पू.) आम तौर पर स्वस्थ स्वयंसेवकों और स्थानीय रक्ताधान केंद्र से प्रभार से मुक्त उपलब्ध से ली गई है (चित्रा 1) से अलगाव

  1. ई.पू. (~ 50ml) 01:06 पीबीएस (250ml जोड़ने के) के साथ पतला. अब वहाँ 300ml कुल मात्रा है. धीरे धीरे Ficoll - Paque 15ml के शीर्ष पर पतला ई.पू. के 25ml परत PLUS परतों परेशान बिना 50ml फाल्कन ट्यूबों के लिए, कहा. 800xg में 4 में 30 मिनट ° सी ब्रेक के साथ के लिए अपकेंद्रित्र (1400rpm झूल बाल्टी एसएच-3000 रोटर के साथ एक Sorvall अपकेंद्रित्र में) बंद कर दिया.
  2. ध्यान PBMC परत (मध्यवर्ती चरण) इकट्ठा और यह एक ताजा 50ml फाल्कन ट्यूबों के लिए स्थानांतरण. ट्यूब भरने DPBS साथ 50ml के लिए PBMC धो लें. एक ट्यूब में 2 सेल छर्रों लीजिए. 4 में 10 मिनट के लिए 400xg पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस कदम दो बार धोने हैं, हर बार एक एकल ट्यूब में 2 सेल छर्रों के संयोजन दोहराएँ. एक एकल 50ml ट्यूब में सभी सेल छर्रों का मिश्रण.
  3. PBMC गणना Trypan ब्लू अपवर्जन परीक्षण का उपयोग. Trypan ब्लू के 180μl दाग PBMC के 20μl जोड़कर Trypan ब्लू में 1:10 कमजोर पड़ने बनाओ. अच्छी तरह से मिलाएं और तुरंत hemacytometer में गिनती 20μl ले. सभी अस्थिर और केवल नीला दाग दो वर्ग 16 छोटे वर्गों से युक्त प्रत्येक ब्लॉक में स्थित कोशिकाओं की संख्या गिनो. दोनों संख्याओं का औसत लो और 10 से गुणा. PBMC / मिलीलीटर की संख्या 100 से इस संख्या में फूट डालो. व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में की गणना [1 - नीले / कुल कोशिकाओं की कोशिकाओं की संख्या (संख्या) x100]. आगे बढ़ें अगर व्यवहार्यता ≥ 95% है.

3. एमएसीएस की तरह टी कोशिकाओं CD4 पूर्व

  1. आगे बढ़ने से पहले, एक नया ट्यूब में PBMC के 1ml हस्तांतरण, मीडिया के 4ml जोड़ने के लिए - 5000rad इन के साथ विकिरण के लिए कक्षों को तैयार प्रतिजन कोशिकाओं पेश (APC) हो जाएगा.
  2. 10min के लिए 4 में PBS/2mM EDTA/0.5% BSA बफर में 250xg कोशिकाओं के बाकी अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस 4ml PBS/2mM EDTA/0.5% BSA बफर में सतह पर तैरनेवाला, और resuspend कोशिकाओं डालो.
  3. एमएसीएस विरोधी CD4 microbeads 200μl जोड़ें और 4 बजे सेते ° C 20 मिनट के लिए.
  4. 10min के लिए 250xg पर PBS/2mM EDTA/0.5% BSA बफर और अपकेंद्रित्र के 40ml जोड़कर 4 पर धो ° सी. 8ml degassed, कमरे के तापमान PBS/2mM EDTA/0.5% BSA बफर में और सतह पर तैरनेवाला resuspend डालो.
  5. फ़िल्टर - अलग सेल उन्हें एक रास स्तंभ पर लोड करने से पहले पूर्व - जुदाई फिल्टर का उपयोग निलंबन.
  6. सेल निलंबन और परत 4ml भाजित प्रत्येक पर calibrated लोकसभा स्तंभ (3ml deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% BSA बफर के साथ). रास स्तंभ MidiMACS विभाजक में तय हो गई है. इससे पहले सेल निलंबन बाहर चलाता है, या तो फिर से चलाने के flowthrough या deggassed कमरे के तापमान के 3ml PBS/2mM EDTA/0.5% BSA बफर जोड़ने के लिए और बफर के माध्यम से चलाने. अधिक बफर जोड़ें जब तक बाहर साफ आता है.
  7. पिपेट लोकसभा स्तंभ पर 5ml deggassed बफर, MidiMACS विभाजक और जगह से एक नई बाँझ 15ml संग्रह के माध्यम से ~ 1.0ml रन दे ट्यूब में रास कॉलम हटा दें. स्तंभ में सवार रखो और धीरे धीरे के बाकी को धक्काबाहर की मात्रा.
  8. दोनों लोकसभा कॉलम के साथ एक ही मत करो और दो सीडी 4 + भिन्न गठबंधन. पीबीएस 50ml और गिनती कोशिकाओं को जोड़ें. उम्मीद उपज 5x10 8 कोशिकाओं के लिए है. 400xg में अच्छी तरह से 10 मिनट और resuspend कोशिकाओं के लिए अपकेंद्रित्र 2ml PBS/2mM EDTA/0.5% BSA बफर में.

4. प्रतिदीप्त सक्रिय सेल छंटनी अलगाव (FACS) (चित्रा 2)

  1. निम्न कोशिका की सतह मार्करों (प्रकाश से सुरक्षित रखना) सीडी मार्करों के लिए एंटीबॉडी के एक कॉकटेल बनाओ: मानव विरोधी CD8-FITC (क्लोन RPA-T8), विरोधी मानव CD14 FITC (M5E2 क्लोन के 20 μl के 20 μl; रिसेप्टर LPS), 20 μl विरोधी मानव CD32 FITC (FLI8.26 क्लोन, FcγR-प्रकार द्वितीय) और मानव विरोधी CD116 - FITC (M5D12 क्लोन के 6 μl, जीएम - CSFRα श्रृंखला) और, वैकल्पिक रूप से, विरोधी 40μl जोड़ने मानव CD4 APCCy7 (क्लोन RPA-टी -4).
  2. 5μl बाहर 2ml सेल निलंबन के दाग कॉकटेल के 2μl साथ दाग लो, इस दहलीज (Fluorochrome ऋण एक FMO) 5 का निर्धारण करने के लिए एक ट्यूब है.
  3. दाग कॉकटेल के लिए, और सेल निलंबन और सेते 4 ° C 30 मिनट पर कॉकटेल जोड़ने, मानव विरोधी CD25 पीई (आईएल - 2Rα क्लोन एम A251) के 50 μl जोड़ें. 400xg पर 10 मिनट 7 / 10 मिलीलीटर की एक सेल एकाग्रता और resuspend कोशिकाओं के लिए धो PBS बफर, अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं .
  4. बेदाग कोशिकाओं और कोशिकाओं या FACS Aria (बी.डी. बायोसाइंसेज, सैन जोस, NJ) पर सेल छँटाई के लिए मुआवजा नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए एकल fluorochrome साथ दाग मोती तैयार.
  5. FMO ट्यूब में कोशिकाओं जो उपयोगकर्ता CD25 + टी कोशिकाओं (2a चित्रा) की छंटाई के लिए सीमा निर्धारित करने के लिए अनुमति देगा मोल. FITC नकारात्मक कोशिकाओं के चारों ओर एक फाटक सेट FITC पॉजिटिव monocytes मैक्रोफेज, और अन्य सभी सीडी 4 + गैर-टी कोशिकाओं (चित्रा 2b) शामिल कोशिकाओं को बाहर.
  6. साजिश में एक अलग, CD25, CD25low और CD25high कोशिकाओं Tregs (शीर्ष CD25 के उच्चतम संख्या व्यक्त कोशिकाओं की 1%) (चित्रा 2c) टी के लिए फाटकों आकर्षित. सेल सबसेट को आम तौर पर उच्च शुद्धता (चित्रा 2d, 2e और 2 एफ) दिखाते हैं.
  7. अपकेंद्रित्र 400xg में 10 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ संग्रह ट्यूबों और चढ़ाना जब तक बर्फ पर उन्हें रखो.

5. 200μl/well में 96 अच्छी तरह से थाली (योजना Table1 के रूप में संलग्न) में सेल संस्कृति सेट

  1. CD3 लिपटे मोतियों के विभाज्य 50μl (1 μg / एमएल) के लिए 3 मोती / प्रत्युत्तर सेल, एक अच्छी तरह से में 10% जमा मानव अटल बिहारी सीरम के साथ पूरा मीडिया में U नीचे में resuspended प्लेटें 96 अच्छी तरह से होने की गणना की. (उदाहरण के लिए, CD3-लेपित के साथ 2ml मीडिया, CD3-लेपित के शेयर मोती अंतिम एकाग्रता 4x10 8 मिलीग्राम / से 7.5μl ले और 2ml मीडिया के में पतला, हर 50μl 75,000 beads-3beads/cell शामिल होंगे).
  2. 5x10 5 मिलीलीटर / सेल एकाग्रता विकिरणित APC पतला और 50μl जोड़ने के लिए (2.5 x 10 4 कोशिकाओं में शामिल होंगे) पहले जोडी कुओं "केवल Tregs" के रूप में चिह्नित, "केवल APC" और "तालिका में केवल मीडिया" सहित उत्तेजना, के साथ एक अच्छी तरह से में 1.
  3. तालिका 1 में डिजाइन निम्नलिखित triplicates में 2.5 10 x 4 / अच्छी तरह से CD4CD25 या CD4CD25low टी कोशिकाओं जोड़ें.
  4. 1:10 अनुपात (2,500 Treg कोशिकाओं) में सह संस्कृतियों (पंक्ति बी, तालिका 1) और "केवल Tregs" के रूप में लेबल कुओं Tregs जोड़ें और सीओ 2 इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के साथ 37 पर थाली ° सी सेते नमी में 72 घंटे के लिए संतृप्त.
  5. [3 एच] thymidine 1μCi के साथ पल्स कुओं और 37 ° अगले 16 घंटे के लिए सी ऊष्मायन जारी है .

6. फसल काटने वाले और गिनती

  1. Multiscreen फसल प्लेट पर हार्वेस्ट कोशिकाओं पैकार्ड filtermate हारवेस्टर या वैकल्पिक प्रणाली का उपयोग कर.
  2. जगमगाहट तरल (20 Microscint) जोड़ें, पारदर्शी प्लास्टिक कवर के साथ अंतिम चरण के लिए तैयारी में थाली की कटाई को कवर किया.
  3. पढ़ें मायने रखता है (सीपीएम) प्रति मिनट / अच्छी तरह से शीर्ष गणना (पैकार्ड, सीटी) NXT या वैकल्पिक प्रणाली का उपयोग कर.

7. दमन के कम्प्यूटिंग प्रतिशत

  1. के रूप में कोशिकाओं triplicates में सुसंस्कृत थे, औसत हर हालत के लिए गणना की है. यदि विभिन्नता का गुणांक> 30% है, ग़ैर सफाया है और केवल दो कुओं से सीपीएम रहे हैं औसत. दमन के प्रतिशत कंप्यूटिंग के द्वारा प्राप्त की है [(सुप्रीम कोर्ट) / s] x 100%, जहां सीपीएम = एकल संस्कृति में ग = सह संस्कृति में सीपीएम.
  2. के रूप में भोले (CD25) और vivo में सक्रिय (CD25low) में effector टी कोशिकाओं प्रत्युत्तर टी कोशिकाओं के रूप में चढ़ाया जाता है, Tregs इन कैंपेन्स के प्रत्येक दबाने की क्षमता में अंतर पर कब्जा कर लिया है और एक संभावित कार्यात्मक शकुन आधार पर आधारित संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया कि सक्रिय कोशिकाओं को दबाने कठिन हैं.

8. प्रतिनिधि परिणाम:

महान तरीकों में परिवर्तनशीलता का इस्तेमाल किया और इन विट्रो मानव दमन परख में से प्राप्त परिणामों हमें परख प्रभावित 1 शर्तों के एक व्यापक अध्ययन करने के लिए प्रेरित किया. हम एक परख है कि न केवल Treg समारोह का परीक्षण है, लेकिन यह भी उनकी शुद्धता विकसित किया है, Tregs के बीच कम अनुपात पर विचार: (1:10) Teffs, जो हम पहले 6 से निर्धारित है. इसके अलावा, Tregs वीं में अलगeir क्षमता को सफलतापूर्वक भोले और vivo में स्वस्थ विषयों में भी सक्रिय टी कोशिकाओं, के रूप में चित्रा 3 में और हमारे पिछले 2,4 अध्ययन है, जो अधिक प्रमुख हो जाता है में दिखाया में दबाने अगर प्रतिरक्षा संतुलन समझौता किया है, के रूप में जोखिम में विषयों में विकसित करने के लिए T1D . परख अध्ययन जहाँ हम (nTregs) प्राकृतिक, inducible (iTregs) और विस्तारित nTregs इन विट्रो में के दमनकारी समारोह की तुलना में बहुत अच्छी तरह से काम किया है, हमें स्वस्थ नियंत्रण के बीच उनके कार्य की तुलना करने के लिए अनुमति देता है, हाल ही में शुरुआत (आरओ ) T1D और पुराना (रास ) T1D विषयों. हम निष्कर्ष निकाला है कि आरओ T1D विषयों रास T1D और स्वस्थ नियंत्रण 7 विषयों की तुलना में कार्यात्मक दोनों iTregs और विस्तार nTregs पैदा करने की बेहतर क्षमता थी . इस प्रकार, इस परख दोनों प्रतिरक्षा असंतुलन के जल्दी और देर से राज्य की मान्यता में एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

योजना 1 इन विट्रो दमन परख में शामिल कदम के योजनाबद्ध प्रस्तुति

चित्रा 1
चित्रा 1 के इन विट्रो दमन परख में तस्वीरों के साथ प्रस्तुत कदम .

चित्रा 2
चित्रा 2. FACS सेल अलगाव में Gating रणनीति. एक) CD25 + दहलीज Fluorochrome ऋण (FMO), ख के अनुसार समायोजित किया गया था) कोशिकाओं FITC - नकारात्मक रूप में gated थे, ग) FITC - नकारात्मक कोशिकाओं आगे gated थे और सीडी + CD25, सीडी + CD25low और सीडी + CD25high के रूप में एकत्र ( Tregs) प्रतिशत, घ के साथ दिखाया गया है) छँटाई के बाद Tregs सॉर्ट किया गया FACS, ई छँटाई के बाद CD + CD25low हल FACS), और च) छँटाई के बाद हल सीडी 4 + CD25 - टी कोशिकाओं FACS

चित्रा 3
चित्रा 3 स्वस्थ विषयों के प्रतिनिधि परिणाम) प्रति मिनट की गिनती के प्रतिनिधि स्वस्थ सभी सेल सबसेट शामिल के लिए एक संस्कृति के रूप में प्रस्तुत विषयों (भोले - CD25, सक्रिय CD25low vivo में, प्रतिजन पेश कोशिकाओं APC के परिणाम (सीपीएम) और . प्रत्येक CD25 और ऑटोलॉगस Tregs द्वारा CD25low प्रत्युत्तर टी कोशिकाओं को स्वस्थ नियंत्रण विषयों के लिए प्रस्तुत किया जाता है (एन दमन का प्रतिशत विनियामक कोशिकाओं Treg टी) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रत्युत्तर टी कोशिकाओं की सह - संस्कृतियों (CD25 - या CD25low) और Tregs ख .) =) 4. [दमन (अनुसूचित जाति) / एस] के रूप में गणना किया गया था x 100%, जहां सीपीएम = एकल संस्कृति में ग = सीपीएम सह संस्कृति में. हालांकि Tregs की क्षमता के लिए प्रत्युत्तर टी कोशिकाओं को दबाने में मामूली अंतर देखा गया था, यह महत्वपूर्ण (बनती टी परीक्षण = 0.08 पी) ग) प्रस्तुत जोखिम विषयों पर प्रत्येक एकल संस्कृति के लिए सीपीएम CD25 और प्रत्युत्तर के रूप में CD25low सहित रहे हैं, नहीं था टी के रूप में अच्छी तरह के रूप में कोशिकाओं APC और Tregs, और सह संस्कृतियों जहां प्रत्येक प्रत्युत्तर टी सेल सबसेट Tregs प्रतिशत (CD25-/Tregs और CD25low/Tregs) घ) प्रत्येक CD25 और CD25low प्रत्युत्तर टी कोशिकाओं के दमन के साथ ऑटोलॉगस द्वारा वरीयता दी गई है Tregs जोखिम विषयों (n = 4) के लिए प्रस्तुत किया है. Tregs की क्षमता में अंतर CD25 बनाम CD25low प्रत्युत्तर टी कोशिकाओं को दबाने के लिए महत्वपूर्ण था (पी टी परीक्षण = 0.04 बनती).

तालिका 1. योजनाबद्ध इन विट्रो दमन परख में सेट

1-3 4-6 7-9 10-12
एक CD4CD25 - CD4CD25low केवल मीडिया केवल मीडिया
बी Tregs CD4CD25 - / / CD4CD25low Tregs केवल Tregs APC केवल
सी
डी
ई
एफ
जी
एच

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Discussion

केवल Tregs के लिए अनूठी विशेषता के रूप में विषयों के बीच, दमनकारी समारोह मज़बूती से और समान परीक्षण किया जाना चाहिए एक ही के भीतर और विभिन्न अध्ययनों के बीच रोग के विकास के विभिन्न चरणों पर. हम दमन हमारे इस परख के मानकीकरण के लिए योगदान के रूप में हमारी प्रयोगशाला में विकसित परख का विवरण प्रदान करते हैं. हमारे व्यापक अनुकूलन अध्ययन में, हम निर्धारित किया है कि विरोधी मानव CD3 (1μg/ml की एकाग्रता में UCHT1 क्लोन, (के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 5μg/ml विरोध) APC के रूप में PBMC के साथ संयोजन में लिपटे मोतियों के साथ टी सेल उत्तेजना प्राकृतिक उत्तेजना प्रदान अच्छी तरह से परीक्षण किया 1 विषयों में दोनों प्रत्युत्तर टी कोशिकाओं और Tregs सक्रिय करने में सक्षम है. विरोधी मानव CD3 एंटीबॉडी का चुनाव काफी महत्व की है, के रूप में हमारे हाथ में केवल Ancell एंटीबॉडी अपेक्षित परिणाम दिए विरोधी मानव CD3 और विरोधी के साथ एक साथ उत्तेजना. मानव CD28 विषय समूहों (नहीं दिखाया परिणाम) के बीच मतभेदों का पता लगाने के लिए पर्याप्त नहीं था, जबकि PBMC सह stimulatory संकेतों के एक पूरा पैलेट की पेशकश संकेत transduction और कुशल उत्तेजना का मौका बढ़ रही है.

इस प्रोटोकॉल दोनों leukopacks और रोगी के रक्त के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. फर्क सिर्फ इतना खून की राशि है कि PBMC अलगाव प्रक्रिया में PLUS Ficoll Paque के शीर्ष पर लोड होने की जरूरत है. मीडिया इस परख में इस्तेमाल किया 10% जमा मानव अटल बिहारी सीरम, जो हम परख के लिए एक महान इसके अलावा हो निर्धारित शामिल हैं. हालांकि, इस्तेमाल किया जा रहा से पहले, सीरम 72 घंटे के नाड़ी के बाद करने के लिए अपने स्वयं के (sixplicate में बीज PBMC पर PBMC सक्रिय करने और पुराने सीरम के साथ पूरा RPMI मीडिया के साथ कोई सीरम और एक नई सीरम के साथ, जोड़ने की क्षमता के लिए परीक्षण किया है. थाली, 37 डिग्री सेल्सियस, फसल कोशिकाओं पर 16 अतिरिक्त घंटे सेते और सीपीएम रीडिंग प्राप्त). PBMC सीपीएम की वृद्धि नई सीरम के साथ सुसंस्कृत अच्छे परिणाम नहीं है और नए बहुत संख्या के साथ एक सीरम के लिए एक की जरूरत का सुझाव है.

हमने निर्धारित किया है कि प्रत्येक नमूने के लिए एक नया लोकसभा स्तंभ के साथ मैन्युअल रूप से किया छँटाई एमएसीएस Automax के लिए सीडी 4 की तुलना में काफी बेहतर उपज + टी कोशिकाओं देता है. इसके अलावा, शुद्धता Treg> 95% निर्धारित किया गया था, के रूप में CD25 अभिव्यक्ति (चित्रा 2d), इन विट्रो (चित्र 3a) प्रसार, Treg के बीच एक अनुपात 1:10 में स्वस्थ विषयों में उच्च suppressive क्षमता की कमी के द्वारा न्याय: responders ( 3ab चित्रा) और पृथक टी सेल सबसेट (नहीं दिखाया डेटा) के बीच उच्चतम Foxp3 अभिव्यक्ति. contaminating कोशिकाओं FITC डंप के रूप में अगले कदम (चित्रा 2b) में FACS छँटाई प्रक्रिया के दौरान समाप्त हो जाते हैं. CD4 मार्कर के धुंधला FACS आवश्यक नहीं है और इस सेल की आबादी एक साजिश में FSC के माध्यम से देखा जा सकता है है जब मानव विरोधी CD25 के साथ संयुक्त, लेकिन यह किया जा सकता है. Tregs सभी विषय समूहों में CD25 की संख्या सबसे ज्यादा व्यक्त कोशिकाओं के शीर्ष 1% के रूप में हल कर रहे हैं. रोग की स्थिति की स्वतंत्र रूप से सभी विषयों को इस कठोर प्रक्रिया लागू हमें केवल Tregs और सभी विषय परीक्षण समूहों में प्रत्युत्तर टी कोशिकाओं (01:10) के बीच एक अनुपात का उपयोग करने के लिए सक्षम होना चाहिए. इसके अतिरिक्त, एक ही स्थिति इतनी अच्छी तरह से काम करते हैं कि दमनकारी संभावित Treg में एक फर्क भोले और vivo में सक्रिय टी responders, है, जो उन दोनों के बीच मतभेद के आधार पर के रूप में इस्तेमाल किया कोशिकाओं में, 1 उम्मीद की जा सकती के बीच में देखा गया था. हम यह भी निर्धारित किया है कि FACS बाद छँटाई कोशिकाओं दमन परख में स्थापित किया जा रहा से पहले नीचे घूमती हो.

परमाणु अप्रसार tritiated thymidine का उपयोग कर मापा गया था. वैकल्पिक रूप से, सेल प्रसार 5 - ब्रोमो 2'- deoxyuridine, एक pyrimidine अनुरूप, जो नव संश्लेषित डीएनए के बजाय thymidine में शामिल है का उपयोग करके मापा जा सकता है. BrdU की जांच युरोपियम के पृथक्करण, एक आयन BrdU (विरोधी BrdU - यूरोपीय संघ) है कि संकेत का पता लगाने की प्रक्रिया में dissociated रिहा प्रतिदीप्ति है कि एक 8 fluorometer में मापा जा सकता हो जाता है पहचानने एंटीबॉडी के लिए बाध्य पर आधारित है. निर्माता के अनुसार (DELFIA) इस परख [3 एच] thymidine तुलनीय संवेदनशीलता है. ट्रैकिंग सेल प्रसार भी उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, tetrazolium नमक की MTT या XTT ATCC, जहां सेल नंबर और संकेत उत्पादन के बीच के रिश्ते पहले से स्थापित हो गया है से उपलब्ध assays में डेरिवेटिव सेल की दर में परिवर्तन के spectrophotometric मात्रा का ठहराव की अनुमति प्रसार और व्यवहार्यता. अभी तक एक और विकल्प डीएचएल सेल व्यवहार्यता और प्रसार परख का उपयोग जीवित कोशिका संख्या और व्यवहार्यता के fluorimetric मात्रा का ठहराव के आधार पर. अन्य संभावित विकल्प CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर) के साथ ही प्रत्युत्तर टी कोशिकाओं दाग और संवर्धन समय के दौरान हर अगले विभाजन के साथ दाग को कम करने की निगरानी है. हालांकि, उत्तेजना परख में इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है, अधिक से अधिक 48 घंटे की लंबी ऊष्मायन CFSE पॉजिटिव कोशिकाओं के अप्रभेद्य चोटियों पैदा कर सकता है. इस प्रकार, प्रत्येक assays के कुछ फायदे और नुकसान है और करने के लिए वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना है.

सीपीएम विरोधी मानव CD3 लेपित परीक्षण करने के लिए हमेशा पर प्रदर्शन कर रहे हैंलेकिन 5000 के ऊपर नहीं +१५,००० ऊपर स्वस्थ PBMC और वे एक परख के इस प्रकार में इस्तेमाल किया जा मोतियों के लिए आदेश में होना चाहिए. हम आम तौर पर स्थापित विभिन्न मोती / सेल अनुपात जब मोती हम बनाने के प्रत्येक बैच परीक्षण, और ज्यादातर मामलों में हम 3 / 25,000 / अच्छी तरह से कोशिकाओं के साथ मोती सेल के साथ सबसे लगातार सीपीएम है. हम आम तौर पर कोटिंग दोहराने अगर बैच परीक्षण के दौरान सीपीएम +३००० नीचे हैं, जब तक हम सीपीएम 5,000-15,000 / अच्छी तरह से पहुँच है. इस प्रकार, कोटिंग की प्रक्रिया कई स्तरों पर जाँच की है और हम इसे विश्वसनीय पर विचार. इसलिए, जब सीपीएम (T1D विकसित जोखिम पर ऑटो एंटीबॉडी पॉजिटिव विषयों की तरह) विषयों के कुछ समूह के लगातार स्वस्थ विषयों की तुलना में कम कर रहे हैं, हम एक निष्कर्ष है कि संकेत transduction प्रक्रिया समझौता हो सकता है कारण है. , हालांकि कई अध्ययनों दमन अब तक 9-12 प्रकाशित assays में responders के रूप में भोले कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है, कुछ, उदाहरण के लिए, बहुत अलग परख responders के रूप में 13 या शर्तों PBMC में responders के रूप में या तो सीडी 4 का उपयोग किया है, और APC के रूप में PBMC की उपस्थिति में उन्हें एकल और जोडी 14 Tregs या दमन के रूप में 15 monocytes के साथ सह संस्कृति में स्थापित . हालांकि सीपीएम सभी परख प्रसार बनाया जाएगा के बारे में विविधताओं और निष्कर्ष में उत्पन्न हो जाएगा, हमें लगता है कि purer वर्दी सेल सबसेट के रूप responders के अधिक विशिष्ट परिणाम देता है और दोनों Tregs और responders के बारे में अतिरिक्त निष्कर्ष आकर्षित की क्षमता रखती है. हमारे दमन यहाँ प्रस्तुत परख के रूप में दो अलग - अलग responders (सीडी 4 + CD25 और सीडी 4 CD25low +) के रूप में शुद्ध सेल सबसेट शामिल है, यह प्रतिरक्षा homeostasis के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्राप्त करने के लिए संभव है जब स्वस्थ विषयों से परिणाम के लिए जोखिम पर प्रभावित या विषयों की तुलना में कर रहे हैं एक प्रतिरक्षा homeostasis (T1D की तरह) की गड़बड़ी से उत्पन्न रोग का विकास. पढ़ाई के vivo में सक्रिय टी कोशिकाओं में बढ़ती संख्या के द्वारा दिखाया (सीडी 4 CD25low +) 16-19 Tregs की दमनकारी प्रभाव को संवेदनशीलता दिखा बिगड़ा . उस व्यवहार के लिए सटीक विवरण और अधिक जांच की आवश्यकता है. इस के अलावा, और हम दूसरों से पता चला है कि T1D के साथ विषयों में Tregs एक कार्यात्मक 2,9,10 दोष है, जो ऑटो एंटीबॉडी पॉजिटिव विषयों के लिए भी सच है, T1D विकसित जोखिम पर, के रूप में हम में से पता चला है हमारे हाल ही में एक रिपोर्ट में 6 चित्रा. संभावनाओं की है कि सभी सीडी 4 प्रभावित विषयों में और जोखिम को विकसित करने में कोशिकाओं टी T1D संकेत transduction में एक आम दोष उन्हें रोकने उत्तेजना पर पर्याप्त रूप से प्रतिक्रिया और उनके effector समारोह को प्रभावित. समझौता संकेत transduction के परिणाम के रूप में, प्रत्युत्तर टी कोशिकाओं कम है (चित्र -3 सी में दिखाया) सीपीएम और Tregs कुशलता से दबा नहीं होगा उत्पन्न होता है. इस या अन्य संभावनाओं के लिए आगे का पता लगाया जा रहते हैं. स्वास्थ्य और रोग में महान भूमिका Tregs खेलने के कारण, कई प्रयोगशालाओं को उनकी जरूरतों और क्षमताओं को परख Treg समायोजन समारोह मापा है. इस प्रकार, परख में कई कारकों (प्रत्युत्तर / Treg अलगाव लिखें, और responders, और उत्तेजना, और APC, प्रत्युत्तर / Tregs, संस्कृति में समय, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से निगरानी प्रसार की विधि के बीच अनुपात के प्रकार और संख्या की प्रकृति की शक्ति की संख्या भिन्न हो सकता है ), Treg समारोह को प्रभावित. इस काम है, इसलिए, एक अलग Treg समारोह का आकलन अध्ययन के आसान है और प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति परख के मानकीकरण की प्रक्रिया शुरू करने का लक्ष्य है.

यदि अपनाया है, इस प्रोटोकॉल T1D और अन्य autoimmune रोगों के साथ प्रभावित विषयों के लिए विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच Treg समारोह की तुलना के लिए अनुमति देगा. इस प्रोटोकॉल व्यापक आवेदन किया है और किसी भी विषय के Treg समारोह, रोग की कोई बात नहीं के एक मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि इसकी शकुन मूल्य केवल रोगों कि प्रतिरक्षा homeostasis के गड़बड़ी का नतीजा हैं संबंधित.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस अध्ययन अधिकतम McGee किशोर Diabetesat विस्कॉन्सिन और Wisconsin के बच्चों के अनुसंधान संस्थान के मेडिकल कॉलेज के लिए राष्ट्रीय अनुसंधान केंद्र द्वारा समर्थित किया गया. funders अध्ययन डिजाइन में कोई भूमिका नहीं थी, डेटा संग्रह और विश्लेषण, या पांडुलिपि की तैयारी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque PLUS Amersham 17-1440-03
DPBS-1X GIBCO, by Life Technologies 14190-144
Trypan Blue Invitrogen 15250-061
anti-CD4 microbeads Miltenyi Biotec 130-045-101
Pre-separation filters Miltenyi Biotec 130-041-407
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
EDTA Invitrogen 15575-020
BSA Sigma-Aldrich B4287
Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) BD Biosciences 557852
Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) BD Biosciences 555432
Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) BD Biosciences 555366
Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) BD Biosciences 555397
Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) BD Biosciences 555448
Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) BD Biosciences 554532
Dynalbeads M-450 tosylactivated Invitrogen 140-13
Anti-human CD3 Ancell 144-024
Buffer1 Home made 0.1M Na2B4O7 pH7.6
Buffer2 Home made PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4
Buffer3 Home made 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5
Complete RPMI media Home made RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate
[3H] thymidine PerkinElmer, Inc. NET027Z005MC
human pooled AB serum Atlanta Biologicals S40110
Multiscreen harvest plate EMD Millipore MAHFC1H60
Microscint 20 PerkinElmer, Inc. 6013621

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References

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इम्यूनोलॉजी 53 अंक दमन विनियामक टी कोशिकाओं Tregs सक्रिय टी कोशिकाओं autoimmune रोग टाइप 1 मधुमेह (T1D)
मानवीय<em> इन विट्रो में</em> इम्यून असंतुलन का एक प्रारंभिक राज्य की मान्यता के लिए स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में दमन
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Waukau, J., Woodliff, J., Glisic, S. … More

Waukau, J., Woodliff, J., Glisic, S. Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance. J. Vis. Exp. (53), e3071, doi:10.3791/3071 (2011).

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