Summary
Tregs são potentes supressores do sistema imune. Há uma falta de marcadores de superfície única para defini-los, portanto, definições de Tregs são principalmente funcionais. Aqui nós descrevemos um otimizado
Abstract
Células T reguladoras (Tregs) são mediadores críticos de tolerância imune a auto-antígenos. Além disso, eles são reguladores fundamentais da resposta imune após uma infecção. Apesar dos esforços para identificar marcador de superfície única sobre Tregs, a única característica única é a sua capacidade para suprimir a proliferação e função das células T efectoras. Embora seja claro que só em ensaios in vitro podem ser utilizados na avaliação da função Treg humano, este torna-se problemático quando se avalia os resultados de estudos transversais, onde as células saudáveis e células isoladas de indivíduos com doenças auto-imunes (como Diabetes Tipo 1-DM1) precisam a serem comparados. Há uma grande variabilidade entre laboratórios no número e tipo de células T responder, a natureza e força de estimulação, Treg: rácios de resposta eo número e tipo de células apresentadoras de antígenos (APC) usado em humanos em testes de supressão vitro. Esta variabilidade dificulta a comparação entre os estudos que medem a função Treg difícil. O campo precisa de um ensaio de Treg supressão padronizados que vai funcionar bem com ambos os indivíduos saudáveis e aqueles com doenças auto-imunes. Nós desenvolvemos um ensaio in vitro em supressão que mostra muito pouco da variabilidade intra-ensaio na estimulação de células T isolados de voluntários saudáveis em comparação a indivíduos com base destruição auto-imune do pâncreas β-células. O objetivo principal desta peça é descrever um ensaio in vitro que permite a supressão humana comparação entre grupos de sujeitos diferentes. Além disso, este ensaio tem o potencial para delinear uma pequena perda em função nTreg e antecipar ainda mais a perda de, no futuro, assim, identificar temas que poderiam se beneficiar da terapia com imunomoduladores preventiva 1. Abaixo, fornecemos descrição detalhada das etapas envolvidas neste procedimento. Esperamos contribuir para a padronização do ensaio in vitro em supressão usado para medir a função Treg. Além disso, oferecemos este ensaio como uma ferramenta para reconhecer um estado inicial de desequilíbrio imunológico e um biomarcador em potencial funcional para DM1.
Protocol
1. Antes de configurar supressão de um ensaio, um precisa de contas de revestimento tosylactivated com anti-CD3 humano (clone UCHT1, 1μg/ml concentração final) para a estimulação das células e, depois, verificar se as contas são eficientemente revestido através da criação de um ensaio de proliferação in vitro utilizando humana células T
- Tomar 1ml de M-450 contas tosylactivated do frasco original, realizada em suporte magnético e segure até que todas as contas tenham aderido ao lado do tubo. Remova o tubo de buffer enquanto ainda está no suporte magnético. Leve tubo de suporte magnético e adicionar 1 ml de buffer1, coloque o tubo no suporte magnético novamente e remover o buffer1 enquanto tubo está no suporte magnético; contas ressuspender em 1 ml de buffer1 e adicionar 40μl de anti-CD3 humano, agite a 37 ° C por 15 minutos, adicionar 0,1% w / v BSA e continuar agitando para o próximo 16 horas.
- Lave as contas em buffer2 duas vezes durante 5 minutos a 2-8 ° C e de vez em buffer3 por 5 minutos a 2-8 ° C usando suporte magnético, como explicado acima; remover o tampão e ressuspender as contas em 1ml de buffer2; as contas são concentração de 4x10 8 ml / final e pronto para uso.
- Alíquota de 50.000 e 25.000 PBMC / poço, em triplicata em placa de 96 poços e adicione número variável de CD3-revestido contas (4x10 8 contas / ml, CD3 1μg/ml, por exemplo 1, 2, 3, 4, 5 esferas / células ), a fim de determinar o número ideal de contas por célula. Após 72 horas de cultura, adicionar 1μCi [3 H] timidina e continuar incubando a 37 ° C para os próximos 16 horas. Células colheita em chapa de colheita Multiscreen (Millipore), adicione líquido de cintilação e ler contagens por minuto (cpm) / poço usando Top Conde NXT (Packard, CT). Use as contas / razão entre células quando CPMs são acima de 5000, mas menos de 15 mil para evitar a superestimulação de Tregs, que pode perder função supressiva. Normalmente, a razão de 3 esferas / células estimula tanto responder e células Treg em todos os grupos sujeitos testados até agora 1-4.
2. PBMC isolamento do sangue total de doadores saudáveis ou de leukopacks humano ou buffy coat (BC), geralmente tiradas de voluntários saudáveis e disponível gratuitamente a partir de centros de transfusão de sangue locais (Figura 1)
- Diluir o BC (~ 50ml) 1:06 com PBS (adicione 250ml). Agora não há volume total de 300ml. Lentamente camada de 25ml de BC diluída em cima de 15ml Ficoll-Paque PLUS adicionado 50ml tubos Falcon, sem perturbar as camadas. Centrifugar a 800xg (1400 rpm em uma centrífuga Sorvall com rotor girando balde SH-3000) por 30 minutos a 4 ° C, com freios desligado.
- Recolher com cuidado a camada de PBMC (fase intermediária) e transferi-lo para uma nova 50ml tubos Falcon. Lavar PBMC preenchendo os tubos de até 50ml com DPBS. Coletar 2 pellets de células em um tubo. Centrifugar a 400xg por 10 min a 4 ° C. Repita o passo de lavagem duas vezes, cada vez que combina dois pellets de células em um tubo único. Combine todos os pellets de células em um tubo de 50ml único.
- Contagem de PBMC usando Trypan teste de exclusão Azul. Fazer uma diluição de 1:10 em Trypan Blue adicionando 20μl de PBMC de 180μl de Trypan Blue mancha. Misture bem e leve 20μl a contar em hemocitômetro imediatamente. Contar números de todas as células sem mácula e apenas azul manchado localizados em dois blocos quadrados cada um contendo 16 quadrados menores. Tomar a média dos dois números e multiplicar por 10. Divida este número por 100 para obter o número de PBMC / ml. Porcentagem de células viáveis calcular como [1 - (número de células azuis / número de células total) x100]. Proceder se a viabilidade é ≥ 95%.
3. MACS tipo pré-CD4 células T
- Antes de prosseguir, a transferência de 1 ml de PBMC em um novo tubo, adicionar 4ml de mídia para preparar células de irradiação com 5000rad-estes serão células apresentadoras de antígenos (APC).
- Centrifugar o resto das células em 250xg em PBS/2mM tampão BSA EDTA/0.5% por 10 min a 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante de células, e ressuspender em 4ml de tampão BSA PBS/2mM EDTA/0.5%.
- Adicionar 200μl de microesferas de MACS anti-CD4 e incubar a 4 ° C por 20 minutos.
- Lavagem adicionando 40 ml de tampão BSA PBS/2mM EDTA/0.5% e centrifugar a 250xg de 10min a 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante e ressuspender em 8ml de desgaseificado à temperatura ambiente, PBS/2mM EDTA/0.5% tampão BSA.
- Filtro-separada de suspensão da célula usando filtros pré-separação antes de carregá-los em uma coluna de LS.
- Dividir a suspensão de células e 4ml camada de cada coluna LS mais calibrada (com 3 ml de tampão BSA deggassed PBS/2mM EDTA/0.5%). LS coluna é fixa no separador MidiMACS. Antes de suspensão celular se esgota, ou fluxo contínuo re-run ou adicionar 3 ml de temperatura ambiente deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% tampão BSA e deixar que o tampão de corrida completamente. Adicione mais buffer até que ele sai claro.
- Pipetar 5 ml tampão deggassed na coluna LS, LS remover Coluna do separador MidiMACS e coloque em um tubo de nova coleção estéril 15ml deixar ~ 1,0 ml por rodar. Coloque o êmbolo na coluna e empurre lentamente o resto dode volume para fora.
- Faça o mesmo com as duas colunas LS e combinar as duas CD4 + frações. Adicione até 50ml células PBS e contar. Rendimento esperado é de até 5x10 8 células. Centrifugar a 400xg por 10 minutos e ressuspender as células bem em 2ml PBS/2mM tampão BSA EDTA/0.5%.
4. Fluorescente ativado Celular classificação de isolamento (FACS) (Figura 2)
- Faça um coquetel de anticorpos para marcadores de CD para os marcadores de células seguintes superfície (manter protegido da luz): 20 l de anti-humano CD8-FITC (clone RPA-T8), 20 l de anti-CD14 humano-FITC (clone M5E2; LPS receptor), 20 l de anti-CD32 humano-FITC (clone FLI8.26; FcγR do tipo II) e 6 mL de anti-humano CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα cadeia) e, alternativamente, adicionar anti 40μl -humanas CD4-APCCy7 (clone RPA-T4).
- Tome 5μl de suspensão de células de 2ml e mancha com 2μl de cocktail mancha, que é um tubo para determinar o limiar (Fluorocromo Minus One-FMO) 5.
- Adicionar 50 ul de anti-CD25 humano-PE (clone M-A251; IL-2Rα) para o coquetel de mancha, e adicione o cocktail de suspensão de células e incubar a 4 ° C 30 minutos. Lavar as células em tampão PBS, centrifugue a 400xg por 10 minutos e ressuspender as células a uma concentração de células de 10 7 / ml.
- Prepare células imaculada e células ou grânulos corados com fluorocromo único para usar como controle de compensação para separação de células em FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ).
- Aquisição de células no tubo FMO que permitirá ao usuário definir o limite para a classificação de células CD25 + T (Figura 2a). Definir uma porta em torno FITC-negativos para excluir as células-FITC células positivas compreendendo monócitos, macrófagos e todos os outros CD4 + T-não-células (Figura 2b).
- Em um lote separado, desenhar portas para CD25, CD25low e T-CD25high células Tregs (top 1% das células que expressam o maior número de CD25) (Figura 2c). Subpopulações de células normalmente apresentam alta pureza (Figura 2d, 2e e 2f).
- Centrifugar tubos de coleta com células em 400xg por 10 minutos e mantê-los no gelo até placas.
5. Criar cultura de células em placa de 96 poços (esquema anexado como Table1) em 200μl/well
- 50μl alíquota de CD3-revestido contas (1 mg / ml), calculado a ser três esferas / resposta celular em um poço, ressuspenso em media completo com 10% de soro AB humanos agrupados em U bottom-placas de 96 poços. (Por exemplo, para fazer media com 2ml CD3-revestido, tomar 7.5μl do estoque de CD3-revestido contas-final 4x10 concentração 8 ml / e diluir em 2 ml de mídia, cada 50μl conterá 75.000 beads-3beads/cell).
- Diluir APC irradiada para 5x10 concentração celular 5 ml / e adicionar 50μl (conterá 2,5 x 10 4 células) em cada poço com estimulação previamente adicionados, incluindo poços rotulados como "Tregs só", "A APC só" e "media apenas" na Tabela 1.
- Adicionar 2,5 x 10 4 / CD4CD25 bem-T ou células CD4CD25low em triplicatas seguinte projeto na Tabela 1.
- Adicionar Tregs para co-culturas (linha B, Tabela 1) na proporção 01:10 (2.500 células Treg) e poços rotulados como "Tregs only" e incubar a placa a 37 ° C em incubadora de CO 2 com 5% de CO 2 , na umidade saturada por 72 horas.
- Pulso de poços com 1μCi [3 H] timidina e continuar incubação a 37 ° C para o próximo 16 horas.
6. Colheita e contando
- Células colheita na placa colheita multiscreen usando Packard filtermate colheitadeira ou sistema alternativo.
- Adicionar líquido de cintilação (Microscint 20), tampa colheita placa com a cobertura de plástico transparente, em preparação para a etapa final.
- Leia contagens por minuto (cpm) / poço usando Top Conde NXT (Packard, CT) ou sistema alternativo.
7. Porcentagem de supressão de computação
- Como as células foram cultivadas em triplicatas, a média é calculada para cada condição. Se o coeficiente de variação é> 30%, o outlier é eliminado e apenas cpm a partir de dois poços são em média. Porcentagem de supressão é obtida pelo cálculo [(sc) / s] x 100%, onde s = cpm em cultura única e c = cpm em co-cultura.
- Como naïve (CD25) e in vivo ativado (CD25low) células T efetoras são banhados como células T responder, a diferença na capacidade de Tregs para suprimir a cada um desses subconjuntos é capturado e usado como um indicador de prognóstico potencial funcional baseada na premissa de que células ativadas são mais difíceis de suprimir.
8. Resultados representativos:
Grande variabilidade nos métodos utilizados e os resultados derivados do ensaio in vitro em supressão humana nos levou a realizar um estudo abrangente das condições que influenciam o ensaio 1. Temos desenvolvido um ensaio que os testes não só a função Treg, mas também a sua pureza, considerando a baixa relação entre Tregs: Teffs (1:10), que determinou anteriormente 6. Além disso, diferem em Tregs ªeir capacidade de suprimir com sucesso ingênua e vivo em células T ativadas, mesmo em indivíduos saudáveis, como mostrado na Figura 3 e em nossos estudos anteriores 2,4, que se torna mais proeminente se o equilíbrio imunológico está comprometido, como em indivíduos em risco de desenvolver DM1 . O ensaio funcionou muito bem no estudo onde comparou a função de supressão de recursos naturais (nTregs), induzível (iTregs) e em nTregs vitro expandido, permitindo-nos comparar a sua função entre o controle saudável, de início recente (RO) e DM1 de longa data (LS ) indivíduos DM1. Concluiu-se que assuntos RO DM1 tinham melhor capacidade de gerar funcional tanto iTregs e nTregs expandiu em comparação com indivíduos controle LS DM1 e saudável 7. Assim, este ensaio pode ser usado como uma excelente ferramenta para o reconhecimento tanto do Estado uma precoce e tardia de desequilíbrio imunológico.
Esquema de apresentação esquemática uma das etapas envolvidas no ensaio in vitro em supressão
Figura 1. Etapas do ensaio in vitro em supressão apresentados com fotografias
Figura 2. Estratégia Gating FACS em isolamento celular. a) CD25 limite + foi ajustada de acordo com Fluorocromo Minus One (FMO), b) as células foram fechadas como FITC-negativos, c) FITC-negativos células foram novamente fechados e recolhidos como CD + CD25-, CD + CD25low e CD + CD25high ( Tregs) mostrada com porcentagens, d) FACS classificadas Tregs após a triagem, e) FACS classificadas CD + CD25low após a triagem, e f) FACS CD4 + CD25-classificadas células T após triagem
Figura 3. Os resultados representativos de indivíduos saudáveis a) Os resultados representativos de contagens por minuto (cpm) de indivíduos saudáveis apresentado como único para todas as culturas de células subconjuntos envolvidos (naïve-CD25-, in vivo ativado-CD25low, células apresentadoras de antígenos-APC e células T reguladoras-Treg), bem como co-culturas de células de resposta T (CD25 ou CD25low) e Tregs. b) Percentagem de supressão de cada CD25 e células T CD25low responder por Tregs autólogo é apresentado para controle de indivíduos saudáveis (n = 4). Supressão foi calculada como [(sc) / s] x 100%, onde s = cpm em cultura única e c = cpm em co-cultura. Embora pequena diferença na capacidade de Tregs para suprimir as células T responder foi notado, não foi significativa (teste t pareado p = 0,08). C) Apresentado são cpm em indivíduos de risco para cada cultura única, incluindo-CD25 e CD25low como responder células T, bem como a APC e Tregs, e co-culturas, onde cada resposta subconjunto de células T é semeado com Tregs Percentagem (CD25-/Tregs e CD25low/Tregs). d) de supressão de cada CD25 e CD25low células T responder por autólogo Tregs é apresentado para em indivíduos de risco (n = 4). A diferença na capacidade de Tregs para suprimir CD25 versus CD25low células T responder foi significativa (teste t pareado p = 0,04).
Tabela 1. Esquemática criação de ensaio in vitro em supressão
| 03/01 | 06/04 | 09/07 | 12/10 | |
| A | CD4CD25- | CD4CD25low | somente mídia | somente mídia |
| B | CD4CD25 / Tregs | CD4CD25low / Tregs | Tregs apenas | APC só |
| C | ||||
| D | ||||
| E | ||||
| F | ||||
| G | ||||
| H |
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Discussion
Como a única característica única de Tregs, função supressiva deverá ser testado de forma confiável e de maneira uniforme entre os indivíduos em diferentes fases de desenvolvimento da doença dentro da mesma e entre diferentes estudos. Oferecemos os detalhes do ensaio de supressão desenvolvido em nosso laboratório como a nossa contribuição para a padronização deste ensaio. Em nosso estudo otimização, nós determinamos que a estimulação de células T com anti-CD3 humano revestido contas (UCHT1 clone, na concentração de 1μg/ml (em oposição a 5μg/ml disponível no mercado) em combinação com PBMC como APC fornecer estímulo natural capaz de ativar bem ambas as células T e responder Tregs em indivíduos testados 1. A escolha do anticorpo anti-CD3 humano é de grande importância, como em nossas mãos apenas de anticorpos Ancell deu os resultados esperados. estimulação simultânea com anti-humano e anti-CD3 CD28 humano não foi suficiente para detectar diferenças entre grupos de indivíduos (resultados não mostrados), enquanto PBMC ofereceu uma paleta completa de co-estimulatórias sinais, aumentando a chance de transdução de sinal e estímulo eficiente.
Este protocolo pode ser usado tanto com leukopacks e sangue do paciente. A única diferença é a quantidade de sangue que precisa ser carregado em cima do Ficoll-Paque PLUS em PBMC procedimento de isolamento. Mídia utilizada neste ensaio contém 10% de soro AB pooled humanos, que estamos determinados a ser um ótimo complemento para o ensaio. No entanto, antes de ser utilizado, o soro tem que ser testados para a capacidade de ativar PBMC em sua própria semente PBMC (em sixplicate e adicione meio completo RPMI com o soro de idade, sem soro e com um novo soro. Após 72 horas, o pulso , incubar 16 horas adicionais, a 37 ° C, as células colheita e obter leituras cpm). Cpm aumentado de PBMC cultivados com novo soro não é bom resultado e sugere a necessidade de um soro com número de lote novo.
Nós determinamos que MACS triagem feita manualmente com uma coluna LS nova para cada amostra dá melhor rendimento considerável de células T CD4 + em relação ao Automax. Além disso, a pureza Treg estava determinado a ser> 95%, a avaliar pela expressão CD25 (Figura 2d), falta de proliferação in vitro (Figura 3a), o potencial supressivo alta em indivíduos saudáveis em uma relação entre 01:10 Treg: respondedores ( Figura 3ab) e mais alta expressão Foxp3 entre isolados subpopulações de células T (dados não mostrados). As células contaminantes são eliminados como dump FITC durante FACS procedimento de classificação na próxima etapa (Figura 2b). FACS coloração do marcador CD4 não é necessário e esta população de células pode ser visto através do FSC em um lote, quando combinado com anti-CD25 humano, no entanto, poderia ser feito. Tregs são classificados como top 1% de células expressando o maior número de CD25 em todos os grupos assunto. Aplicando este procedimento rigoroso a todos os indivíduos independentemente do estado da doença nos permitiu utilizar apenas uma relação entre Tregs e as células T responder (1:10) em todos os grupos sujeitos testados. Além disso, as mesmas condições de trabalho tão bem que uma diferença de potencial Treg supressiva foi visto entre os ingênuos e vivo em células T ativadas usado como respondedores, que, com base nas diferenças entre eles, poderia ser esperado 1. Temos também determinou que após FACS células de classificação têm de ser girado para baixo antes de ser criada em ensaio de supressão.
Proliferação foi medida utilizando timidina tritiada. Alternativamente, a proliferação celular pode ser medida usando 5-bromo-2'-deoxiuridina, um análogo da pirimidina, que é incorporado ao DNA recentemente sintetizado em vez de timidina. Detecção de BrdU é baseada na dissociação de európio, um íon que se liga aos anticorpos reconhecendo BrdU (anti-BrdU-UE) que, no processo de detecção de sinais de fluorescência fica liberando dissociadas que podem ser medidos em um fluorímetro 8. Acordo com o fabricante (Delfia) este ensaio é a sensibilidade comparável ao [3 H] timidina. Proliferação celular de rastreamento também pode ser feito usando, por exemplo, derivados de sal de tetrazólio em MTT ou ensaios XTT disponível a partir de ATCC, onde a relação entre o número de células eo sinal produzido tem de ser estabelecida em primeiro lugar, permitindo a quantificação espectrofotométrica de mudanças na taxa de célula proliferação e viabilidade. No entanto, outra alternativa é o uso de viabilidade celular DHL e ensaio de proliferação, com base em quantificação fluorimétrica de números célula viva e viabilidade. Escolha potencial outro é colorir células T responder apenas com CFSE (carboxifluoresceína succinimidyl éster) e monitorar a redução da mancha em cada divisão próximos durante o tempo de cultivo. No entanto, dependendo de estimulação utilizada no ensaio, mais de incubação de mais de 48 horas pode causar picos indistinguíveis de células CFSE positivo. Assim, cada um dos ensaios tem algumas vantagens e desvantagens e tem que ser otimizados para alcançar os resultados desejados.
CPMs para o teste anti-CD3 humano revestido são sempre realizados emPBMC saudáveis e devem ser acima de 5.000, mas não acima de 15.000, a fim de contas a ser utilizado neste tipo de ensaio. Costumamos criar contas diferentes / razão entre células ao testar cada lote de contas que fazemos, e na maioria dos casos temos a cpm mais consistente com 3 esferas / células com 25.000 células / poço. Costumamos repetir revestimento se CPMs durante os testes lote estão abaixo de 3.000, até chegarmos 5,000-15,000 cpm / poço. Assim, o processo de revestimento tem sido verificado em vários níveis e consideramos que é confiável. Portanto, quando CPMs de determinado grupo de indivíduos (como auto-anticorpo-positivos em risco de desenvolver DM1) são consistentemente mais baixos em comparação com indivíduos saudáveis, nós temos uma razão para concluir que o processo de transdução de sinal pode ser comprometida. , Apesar de muitos estudos têm utilizado células naïve como respondedores em ensaios de supressão publicados até agora 12/09, alguns, por exemplo, têm usado tanto CD4 como respondedores em condições de ensaio muito diferente de 13 ou PBMC como respondedores, na presença de PBMC como APC e configurá-los em um único e co-cultura com Tregs adicionou 14 ou 15 como supressores de monócitos. Apesar de CPMs serão gerados em todas as variações de ensaio e conclusões sobre a proliferação será feita, pensamos que ter mais pura subconjunto de células uniforme como respondedores dá resultados mais específicos e tem potencial para tirar conclusões adicionais sobre os dois Tregs e respondedores. Como o nosso ensaio de supressão apresentados aqui inclui duas subpopulações de células separadas pura como respondedores (CD4 + CD25 e CD4 + CD25low), é possível obter informações valiosas sobre a homeostase imunológica quando os resultados obtidos em indivíduos saudáveis são comparados com afetado ou indivíduos em risco para desenvolver uma doença resultante de perturbação da homeostase imunológica (como DM1). Como mostrado pelo número crescente de estudos, em células T ativadas in vivo (CD4 + CD25low) mostram sensibilidade diminuída ao efeito inibitório da Tregs 16-19. A explicação exata para esse comportamento requer mais investigação. Além disso, nós e outros têm mostrado que Tregs em indivíduos com DM1 têm um defeito funcional 2,9,10, que também é válido para auto-anticorpo-positivos, com risco de desenvolver DM1, como já mostrado na Figura 6 no nosso relatório recente 1. Uma das possibilidades é que todas as células CD4 T em indivíduos afetados e em risco de desenvolver DM1 tem um defeito comum na transdução de sinal impedindo-os de responder na estimulação adequada e que afectam a sua função efetora. Como resultado de transdução de sinal comprometida, as células T responder geraria cpm inferior (mostrado na Figura 3c) e Tregs não suprimir de forma eficiente. Possibilidades de esta ou outras ainda precisam ser mais exploradas. Devido à grande dramatização Tregs na saúde e na doença, muitos laboratórios têm medido função Treg ajustando o ensaio para as suas necessidades e habilidades. Assim, muitos fatores no ensaio pode variar (responder / Treg isolamento, tipo e número de respostas da natureza, ea força do tipo de estimulação, e número de APC, a relação entre a responder / Tregs, o tempo na cultura, bem como método de proliferação de monitoramento ), afetando a função Treg. Este trabalho, portanto, tem o objetivo de iniciar o processo de padronização do ensaio que permitissem a comparação mais fácil e direta de diferentes estudos avaliando a função Treg.
Se for aprovada, este protocolo permitirá a comparação da função Treg entre laboratórios diferentes para indivíduos afetados com DM1 e outras doenças auto-imunes. Este protocolo tem ampla aplicação e pode ser usado para uma avaliação da função Treg de qualquer assunto, não importa de doença, embora seu valor prognóstico pertence únicas doenças que são resultado de perturbação da homeostase imunológica.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetesat Medical College of Wisconsin e infantil Research Institute of Wisconsin. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Biosciences | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Biosciences | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Biosciences | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Biosciences | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Biosciences | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Biosciences | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Home made | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Home made | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Home made | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Home made | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | PerkinElmer, Inc. | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | EMD Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | PerkinElmer, Inc. | 6013621 |
References
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