Summary
Tregs är potenta dämpning av immunsystemet. Det finns en brist på unik yta markörer för att definiera dem, alltså, definitioner av Tregs är främst funktionell. Här beskriver vi ett optimerat
Abstract
Regulatoriska T-celler (Tregs) är kritiska förmedlare av immuntolerans att själv antigener. Dessutom är de viktiga regulatorer av immunsvaret efter en infektion. Trots insatser för att identifiera unika yta markör på Tregs, är det enda unika med deras förmåga att undertrycka spridning och funktion effektor T-celler. Även om det är tydligt att endast in vitro-analys kan användas för att bedöma mänskliga Treg funktion, blir detta problematiskt när man bedömer resultaten från tvärsnittsstudier där friska celler och celler som isolerats från patienter med autoimmuna sjukdomar (som typ 1-diabetes-T1D) behöver som ska jämföras. Det finns en stor variation mellan laboratorier i antalet och typen av responder T-celler, typ och styrka av stimulering, Treg: responder nyckeltal och antalet och typen av antigen-presenterande celler (APC) som används inom human in vitro-hämning analyser. Denna variation gör att jämförelser mellan studier som mäter Treg funktion svårt. Den Treg område behöver ett standardiserat dämpning analysmetod som kommer att fungera bra med både friska försökspersoner och patienter med autoimmuna sjukdomar. Vi har utvecklat en in vitro-hämning analys som visar mycket lite inom assay variation i stimuleringen av T-celler isolerade från friska försökspersoner jämfört med personer med underliggande autoimmun förstörelse av bukspottkörtelns β-celler. Huvudsyftet med denna pjäs är att beskriva en in vitro-mänskliga dämpning analys som möjliggör jämförelser mellan olika ämnesgrupper. Dessutom har denna analys potential att avgränsa en mindre förlust i nTreg funktion och räknar med ytterligare förluster i framtiden, på så sätt identifiera patienter som kan dra nytta av förebyggande immunmodulerande behandling 1. Nedan ger vi utförlig beskrivning av stegen i detta förfarande. Vi hoppas kunna bidra till standardisering av in vitro-suppression test används för att mäta Treg funktion. Dessutom erbjuder vi denna analys som ett verktyg för att känna igen ett tidigt stadium av immun obalans och en potentiell funktionell biomarkör för T1D.
Protocol
1. Innan du ställer in en dämpning analys, ett måste att bestryka tosylactivated pärlor med anti-humant CD3 (klon UCHT1, slutlig koncentration 1μg/ml) för cell stimulering och därefter kontrollera om pärlorna effektivt är belagda genom att inrätta ett in vitro-spridning test med humana T-celler
- Ta 1 ml M-450 tosylactivated pärlor från original flaska, placera i magnetiska stå och hålla tills alla pärlorna har anslutit sig till sidan av röret. Ta bort bufferten medan röret är fortfarande i den magnetiska monter. Ta tuben av magnetiska står och lägger 1 ml buffer1, placera röret i magnetiska stå igen och ta bort buffer1 medan röret är i den magnetiska monter, återsuspendera pärlor i 1 ml buffer1 och lägga 40μl av anti-humant CD3, agitera i 37 ° C i 15 minuter, tillsätt 0,1% w / v BSA och fortsätter agitera för nästa 16 timmar.
- Tvätta pärlor i buffer2 två gånger i 5 minuter vid 2-8 ° C och en gång i buffer3 i 5 minuter vid 2-8 ° C med hjälp av magnetiska stå som ovan, ta bort bufferten och återsuspendera pärlor i 1 ml buffer2, pärlorna är 4x10 8 / ml slutlig koncentration och klar för användning.
- Alikvotera 50.000 och 25.000 PBMC / brunn i tre exemplar på en 96-brunnars platta och lägg varierande antal CD3-belagd pärlor (4x10 8 pärlor / ml, CD3 1μg/ml till exempel 1, 2, 3, 4, 5 pärlor / cell ) för att fastställa den optimala antalet pärlor per cell. Efter 72 timmar i kultur, lägga 1μCi [3 H] tymidin och fortsätta inkuberas vid 37 ° C under de närmaste 16 timmarna. Harvest celler i Multiscreen skörd platta (Millipore), lägg scintillationsvätska och läsa beräkningar per minut (CPM) / brunn med hjälp av Top Count NXT (Packard, CT). Använd pärlor / cellen förhållandet när CPM är över 5000, men mindre än 15000 för att undvika överstimulering av Tregs, som kan förlora förebyggande funktion. Vanligtvis stimulerar förhållandet 3 pärlor / cell både responders och Treg celler i alla ämnesområden grupper testat hittills 1-4.
2. PBMC isolering från helblod från friska donatorer eller från mänsklig leukopacks eller buffycoat (BC) vanligtvis tas från friska frivilliga och tillgängliga gratis från lokala centra blodtransfusion (Figur 1)
- Späd BC (~ 50ml) 1:06 med PBS (lägg 250ml). Nu finns det 300ml totala volymen. Långsamt lager 25ml utspädd BC ovanpå 15ml Ficoll-Paque PLUS tillsätts 50 ml Falcon rör, utan att störa lager. Centrifugera vid 800xg (1400 i en Sorvall centrifug med svängande hink rotor SH-3000) under 30 minuter vid 4 ° C, med bromsar avstängd.
- Försiktigt samla PBMC lagret (mellanliggande fas) och överföra den till en ny 50 ml Falcon rör. Tvätta PBMC genom att fylla rören upp till 50 ml med DPBS. Samla 2 cellen pellets i ett rör. Centrifugera vid 400xg i 10 min vid 4 ° C. Upprepa tvätt två gånger, varje gång kombinerar 2-cell pellets till ett enda rör. Kombinera alla celler pellets i en enda 50ml tub.
- Räkna PBMC med Trypan Blå utanförskap test. Gör en 1:10 utspädning i Trypan Blå genom att lägga 20μl av PBMC till 180μl av Trypan blånad. Blanda väl och ta 20μl att räkna i hemacytometer omedelbart. Räkna antalet av alla ofärgade och endast blå färgade celler som finns i två kvadratiska block som vardera innehåller 16 mindre rutor. Ta medelvärdet av både siffror och multiplicera med 10. Dividera detta antal med 100 för att få det antal PBMC / ml. Procent av livsdugliga celler räkna som [1 - (antal blå celler / totala antalet celler) x100]. Fortsätta om lönsamheten är ≥ 95%.
3. MACS före slags CD4 T-celler
- Innan du fortsätter, överföring 1 ml PBMC till en ny tub, lägga 4ml av media för att förbereda celler för bestrålning med 5000rad-dessa kommer att vara antigen-presenterande celler (APC).
- Centrifugera resten av cellerna på 250xg i PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffert för 10min vid 4 ° C. Häll bort supernatanten och suspendera cellerna i 4 ml av PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffert.
- Tillsätt 200μl av MACS anti-CD4 mikrokulor och inkubera vid 4 ° C i 20 minuter.
- Tvätta genom att tillsätta 40 ml av PBS/2mM EDTA/0.5% BSA-buffert och centrifugera vid 250xg för 10min vid 4 ° C. Häll bort supernatanten och återsuspendera i 8ml av rengjorda, rumstemperatur PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffert.
- Filter-separera cellsuspension med Pre-separering filter innan du lägger dem på en LS kolumn.
- Dela cellsuspension och 4ml lager vardera under kalibrerad LS kolumn (med 3ml i deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffert). LS kolumnen är fast i MidiMACS separator. Innan cellsuspension tar slut, antingen repris flowthrough eller lägga 3ml av deggassed rumstemperatur PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffert och låt den buffert gå igenom. Tillsätt mer buffert tills det kommer ut klart.
- Pipettera 5 ml deggassed buffert på LS kolumnen bort LS kolumn på MidiMACS separatorn och placera i en ny steril 15ml provröret låta ~ 1,0 ml rinna igenom. Sätt kolven i den kolumnen och tryck långsamt in resten avvolym ut.
- Gör samma sak med både LS kolonner och kombinera de två CD4 + fraktioner. Lägg till upp till 50 ml PBS och räkna celler. Förväntad avkastning är upp till 5x10 8 celler. Centrifugera vid 400xg i 10 minuter och återsuspendera cellerna väl i 2ml PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffert.
4. Lysrör Aktiverat cellsortering (FACS) isolering (Figur 2)
- Gör en cocktail av antikroppar till CD markörer till följande markörer cellytan (Skydda mot ljus): 20 ìl av anti-humant CD8-FITC (klon RPA-T8), 20 ìl av anti-humant CD14-FITC (klon M5E2; LPS-receptorn), 20 ìl av anti-humant CD32-FITC (klon FLI8.26; FcγR-typ II) och 6 l av anti-humant CD116-FITC (klon M5D12; GM-CSFRα kedja) och alternativt lägga 40μl anti -mänskliga CD4-APCCy7 (klon RPA-T4).
- Ta 5μl ur 2ml cellsuspensionen och fläcken med 2μl av färg cocktail, det är ett rör för att bestämma tröskeln (fluorokrom Minus One-FMO) 5.
- Tillsätt 50 ìl av anti-humant CD25-PE (klon M-A251, IL-2Rα) till fläcken cocktail och lägg till cocktail cellsuspension och inkubera vid 4 ° C 30 minuter. Tvätta cellerna i PBS-buffert, centrifugera vid 400xg i 10 minuter och resuspendera celler till en cell koncentration av 10 7 / ml.
- Förbered ofärgade celler och celler eller pärlor färgas med enstaka fluorokrom att använda som ersättning kontroll för cell sortering på FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ).
- Förvärva celler i FMO röret vilket gör det möjligt för användaren att sätta gränsen för sortering av CD25 + T-celler (Figur 2a). Ställ en grind runt FITC-negativa celler för att utesluta FITC-positiva celler som består av monocyter, makrofager och alla andra CD4 +-icke-T-celler (Figur 2b).
- I en separat tomt, rita portarna för CD25-, CD25low och CD25high T-celler-Tregs (top 1% av celler som uttrycker det största antalet CD25) (Figur 2c). Cell delmängder visar vanligtvis hög renhet (figur 2d, 2e och 2f).
- Centrifugera samling rör med cellerna vid 400xg i 10 minuter och hålla dem på is tills plätering.
5. Sätt upp cellodling i 96-brunnar (system bifogas som tabell 1) i 200μl/well
- Alikvotera 50μl av CD3-belagd pärlor (1 mikrogram / ml) beräknades till 3 pärlor / responder cell i en brunn, suspenderade i fullständig media med 10% poolade humana AB-serum i U-botten plattor med 96 brunnar. (Till exempel, för att göra 2ml media med CD3-belagda, ta 7.5μl från lager av CD3-belagda pärlor-slutlig koncentration 4x10 8 / ml och späd med 2 ml av media, varje 50μl kommer att innehålla 75 tusen beads-3beads/cell).
- Späd bestrålade APC till 5x10 5 / ml cellkoncentrationen och tillsätt 50μl (innehåller 2,5 x 10 4 celler) i varje brunn med tidigare lagt stimulering, inklusive brunnar märkta som "Tregs enda", "APC bara" och "medierna bara" i tabell 1.
- Tillsätt 2,5 x 10 4 / brunn CD4CD25-eller CD4CD25low T-celler i tre exemplar efter design i tabell 1.
- Lägg Tregs att samarbeta kulturer (rad B, tabell 1) i förhållandet 01:10 (2500 Treg celler) och i brunnarna är märkta som "Tregs bara" och inkubera plattan vid 37 ° C i CO 2 inkubator med 5% CO 2 i mättad fuktighet under 72 timmar.
- Puls brunnar med 1μCi [3 H] tymidin och fortsätta inkubation vid 37 ° C för nästa 16 timmar.
6. Skörd och räkna
- Harvest celler MultiScreen skörd tallrik med Packard filtermate skördare eller alternativt system.
- Lägg scintillationsvätska (Microscint 20), täck skörd tallrik med genomskinligt plastlock för att förbereda det sista steget.
- Läs beräkningar per minut (CPM) / brunn med hjälp av Top Count NXT (Packard, CT) eller alternativt system.
7. Datorer procent av förtryck
- Eftersom cellerna odlades i tre exemplar, är i genomsnitt beräknas för varje tillstånd. Om variationskoefficienten är> 30%, är den avvikande elimineras och endast kopior från två brunnar genomsnitt. Procent av dämpning erhålls genom att beräkna [(sc) / s] x 100%, där s = cpm i singel kultur och c = cpm i samarbete kulturen.
- Som naiva (CD25-) och in vivo aktiverad (CD25low) effektor T celler är klädd som responder T-celler, är skillnaden i förmåga Tregs att undertrycka alla dessa delmängder fångas upp och användas som en potentiell funktionell prognostisk indikator bygger på förutsättningen att aktiverade celler är svårare att undertrycka.
8. Representativa resultat:
Stor variation i använda metoder och resultat som härrör från in vitro mänskliga dämpning analys föranledde oss att utföra en omfattande studie av förhållanden som påverkar analysens 1. Vi har utvecklat ett test som testar inte bara Treg funktion, utan också deras renhet, med tanke på den låga kvoten mellan Tregs: Teffs (1:10), som vi fastställt tidigare 6. Dessutom Tregs skiljer thEIR förmåga att framgångsrikt undertrycka naiva och in vivo-aktiverade T-celler även hos friska försökspersoner, som visas i figur 3 och i våra tidigare studier 2,4, som blir mer framträdande om immunförsvaret balans äventyras, som hos personer i riskzonen för att utveckla T1D . Analysen fungerade mycket bra i studie där vi jämförde suppressiv funktion av naturliga (nTregs), inducerbara (iTregs) och in vitro expanderade nTregs, tillåter oss att jämföra deras funktion mellan friska kontroll, nyinsjuknade (RO) T1D och långvariga (LS ) T1D ämnen. Vi drog slutsatsen att RO T1D försökspersoner hade bättre förmåga att skapa funktionella både iTregs och utökade nTregs jämfört med LS T1D och friska kontrollpersoner 7. Därför kan detta test användas som ett utmärkt verktyg för erkännande av både en tidig och sen tillstånd immun obalans.
Scheme 1 Schematisk presentation av de olika stegen i in vitro-suppression test
Figur 1. Stegen i in vitro-hämning analys presenteras med fotografier
Figur 2. Gating strategi FACS cell isolering. a) CD25 + tröskeln justeras enligt fluorokrom Minus One (FMO), b) celler var gated som FITC-negativa, c) FITC-negativa celler var längre gated och samlas som CD + CD25-, CD + CD25low och CD + CD25high ( Tregs) visas med procenttal, d) FACS sorterat Tregs efter sortering) e FACS sorterat CD + CD25low efter sortering och f) FACS sorteras CD4 + CD25-T-celler efter sortering
Figur 3. Representativa resultat av friska försökspersoner a) och representant resultat räknas per minut (CPM) på friska försökspersoner presenteras som enstaka kulturer för alla celler inblandade delmängder (naiva-CD25-, in vivo-aktiverade-CD25low, antigen-presenterande celler, APC regulatoriska T-celler-Treg) samt co-kulturer av responder T-celler (CD25-eller CD25low) och Tregs. b) Andel av undertryckande av varje CD25-och CD25low responder T-celler av autolog Tregs presenteras för friska kontrollpersoner (n = 4). Dämpning beräknades som [(sc) / s] x 100%, där s = cpm i singel kultur och c = cpm i samarbete kulturen. Även liten skillnad i kapacitet Tregs att undertrycka responder T-celler märktes, det var inte signifikant (parade t-test p = 0,08). C) Presenteras är CPM i riskzonen ämnen för varje enskild kultur, inklusive CD25-och CD25low som responder T-celler samt APC och Tregs, och co-kulturer där varje responder T-cell delmängd är ympats med Tregs (CD25-/Tregs och CD25low/Tregs). d) Andel av undertryckande av varje CD25-och CD25low responder T-celler av autolog Tregs presenteras för risk försökspersoner (n = 4). Skillnaden i kapacitet Tregs att undertrycka CD25-versus CD25low responder T-celler var signifikant (parad t-test p = 0,04).
Tabell 1. Schematisk uppsättning av in vitro-suppression test
| 1-3 | 4-6 | 7-9 | 10-12 | |
| En | CD4CD25- | CD4CD25low | medierna bara | medierna bara |
| B | CD4CD25-/ Tregs | CD4CD25low / Tregs | Tregs bara | APC bara |
| C | ||||
| D | ||||
| E | ||||
| F | ||||
| G | ||||
| H |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som den enda unika funktion för Tregs bör repressiva funktion testas tillförlitligt och jämnt mellan ämnen i olika faser av sjukdomsutvecklingen inom samma och mellan olika studier. Vi erbjuder information om undertryckande test som utvecklats i vårt laboratorium som vårt bidrag till standardiseringen av denna analys. I vår omfattande optimering studie har vi fastställt att T-cell stimulering med anti-humana CD3-belagda kulor (UCHT1 klon, i koncentrationen av 1μg/ml (i motsats till kommersiellt tillgängliga 5μg/ml) i kombination med PBMC som APC ger naturlig stimulans som kan aktivera bra både responder T-celler och Tregs i testade ämnen 1. Valet av anti-human CD3 antikroppen är av stor betydelse, som i våra händer bara Ancell antikropp gav de förväntade resultaten. Samtidig stimulering med anti-humant CD3 och anti- mänskliga CD28 var inte tillräcklig för att upptäcka skillnader mellan ämnesgrupper (resultat visas inte), medan PBMC erbjöd en komplett palett av co-stimulerande signaler, ökar chansen för signaltransduktion och effektiv stimulans.
Detta protokoll kan användas med både leukopacks och patient blod. Den enda skillnaden är den mängd blod som måste lastas på toppen av Ficoll-Paque PLUS PBMC isolerat förfarande. Medier som används i denna analys innehåller 10% poolade humana AB-serum, som vi fast beslutna att bli ett bra komplement till analysen. Men innan de används, har serum som ska testas för förmågan att aktivera PBMC på egen hand (sådd PBMC i sixplicate och lägga komplett RPMI media med det gamla serum, utan serum och med ett nytt serum. Efter 72 timmar puls på agar, inkubera ytterligare 16 timmar vid 37 ° C, skörd celler och få kopior avläsningar). Ökad cpm av PBMC odlade med nya serum är inte bra resultat och föreslår ett behov av ett serum med nya partinummer.
Vi har fastställt att MACS sorteringen sker manuellt med en ny LS kolumn för varje prov ger betydligt bättre avkastning på CD4 + T-celler jämfört med Automax. Dessutom var Treg renhet bestämt sig för att vara> 95%, som bedöms av CD25 uttrycket (figur 2d), brist på in vitro-spridning (figur 3a), hög förebyggande potential hos friska försökspersoner i förhållandet 1:10 mellan Treg: svarade ( Figur 3ab) och högst Foxp3 uttryck bland isolerade T-cell delmängder (data visas inte). Den förorenande cellerna elimineras som FITC dumpa under FACS sortering förfarande i nästa steg (figur 2b). FACS färgning av CD4 markering är inte nödvändig och detta cellpopulation kan ses genom FSC i ett tomt när det kombineras med anti-humant CD25, men det kunde göras. Tregs sorteras som topp 1% av celler som uttrycker det högsta antalet CD25 inom alla ämnesområden grupper. Att tillämpa denna rigoröst förfarande för alla ämnen, oberoende av sjukdomens status möjligt för oss att bara använda ett förhållande mellan Tregs och responder T-celler (1:10) i alla testade ämnet grupper. Dessutom på samma villkor fungerar så bra att en skillnad i Treg suppressiv potentiella sågs mellan naiva och in vivo-aktiverade T-celler som används som svarat, som bygger på skillnaderna mellan dem, skulle kunna förvänta 1. Vi har också fastställt att efter FACS sortering celler måste spunnet ner innan de inrättas i förtryck analys.
Spridning mättes med tritiated tymidin. Alternativt kan cellproliferation mätas med hjälp av 5-bromo-2'-deoxiuridin, en pyrimidin analog, som ingår i nyligen syntetiserade DNA istället för tymidin. Upptäckt av BrdU bygger på dissociation av europium, en jon binds till antikroppar erkänna BrdU (anti-BrdU-EU) som i förfarandet av signal upptäckt får dissocierade släppa fluorescens som kan mätas i en fluorometer 8. Enligt tillverkaren (DELFIA) denna analys är jämförbar känslighet [3 H] tymidin. Spårning celltillväxt kan också göras med till exempel derivat av tetrazolium salt i MTT eller XTT analyser tillgängliga från ATCC, där förhållandet mellan mobilnummer och producerade signalen måste fastställas först, så spektrofotometrisk kvantifiering av förändringar i graden av cellens spridning och livskraft. Ytterligare ett alternativ är användning av DHL cellviabiliteten och spridning analys, baserad på fluorimetric kvantifiering av levande cell nummer och livskraft. Andra möjliga val är att färga responder T-celler bara med CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) och övervaka att minska på fläcken med varje nästa division under odling tid. Men beroende på stimulering används i analysen, kan längre inkubationstid på mer än 48 timmar orsak skiljas toppar CFSE-positiva celler. Således har alla de analyser några fördelar och nackdelar och måste optimeras för att uppnå önskat resultat.
CPM för att testa anti-humant CD3-belagda är alltid utförs påfriska PBMC och de bör vara över 5000 men inte över 15 tusen för att pärlor att användas i denna typ av en analys. Vi sätter oftast upp olika pärlor / cell förhållande vid provning av varje sats av pärlor vi gör, och i de flesta fall har vi de mest konsekventa CPM med 3 pärlor / cell med 25.000 celler / brunn. Vi upprepar brukar beläggningen om CPM under batch tester är under 3000, tills vi når 5,000-15,000 CPM / bra. Sålunda har beläggningsprocessen kontrollerats på flera nivåer och vi anser att den är pålitlig. Därför, när CPM av vissa grupper av ämnen (som auto-antikropps-positiva patienter i riskzonen för att utveckla T1D) genomgående är lägre jämfört med friska försökspersoner, har vi en anledning att dra slutsatsen att signaltransduktion process kan äventyras. , Även om många studier har använt naiva celler som responders i dämpning analyser publicerats hittills 9-12, en del, till exempel, har använt antingen CD4 som svarat på mycket olika analysförhållanden 13 eller PBMC som svarat, i närvaro av PBMC som APC och ställa upp dem i singel och co-kultur med tillsats Tregs 14 eller monocyter 15 som suppressorer. Trots att CPM kommer att genereras i alla test varianter och slutsatser om spridningen kommer att ske, tror vi att ha renare enhetlig cell delmängd som svarat ger mer konkreta resultat och har potential att dra ytterligare slutsatser om både Tregs och responders. Som vår dämpning analys som presenteras här innehåller två separata ren cell undergrupper som svarade på behandlingen (CD4 + CD25-och CD4 + CD25low), är det möjligt att få värdefull information om immun homeostas när resultaten från friska individer jämförs med påverkas eller individer som riskerar att utveckla en sjukdom till följd av störning i immun homeostas (som T1D). Som framgår av växande antal studier, in vivo-aktiverade T-celler (CD4 + CD25low) visar nedsatt känslighet för förebyggande effekten av Tregs 16-19. Den exakta förklaringen till detta beteende kräver mer utredning. Utöver detta har vi och andra visat att Tregs hos personer med T1D har ett funktionellt fel 2,9,10, vilket även gäller för auto-antikropp-positiva patienter, som riskerar att utveckla T1D, som vi har visat i Figur 6 i vår senaste rapport 1. En av möjligheterna är att alla CD4 T-celler i de berörda ämnen och i riskzonen för att utveckla T1D har ett gemensamt fel i signaltransduktion hindra dem att svara på stimulering lämpligt sätt och som påverkar deras effektor funktion. Som resultat av hämmad signaltransduktion, skulle responder T-celler genererar lägre cpm (figur 3c) och Tregs skulle inte undertrycka effektivt. Detta eller andra möjligheter återstår att utforskas ytterligare. På grund av den stora roll Tregs spela i hälsa och sjukdom har många laboratorier mäts Treg funktion anpassa analysen till deras behov och förmågor. Därför kunde många faktorer i analysen varierar (responder / Treg isolering, typ och antal responders, natur och styrkan i stimulans, typ och antal av APC, förhållandet mellan responder / Tregs, tid i kultur, samt metod för att övervaka spridning ), som påverkar Treg-funktionen. Detta arbete har därför ett mål att starta processen för standardisering av analysen som gör det lättare och direkt jämförelse av olika studier att bedöma Treg-funktionen.
Om förslaget antas kommer protokollet möjliggör för jämförelse av Treg funktion mellan olika laboratorier för patienter drabbade med T1D och andra autoimmuna sjukdomar. Detta protokoll har bred tillämpning och kan användas för en utvärdering av Treg funktion av något ämne, oavsett sjukdom, men dess prognostiska värde gäller endast sjukdomar som är resultatet av störning i immunförsvaret homeostas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Max McGee nationellt forskningscentrum för unga Diabetesat Medical College of Wisconsin och barns Forskningsinstitut Wisconsin. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Biosciences | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Biosciences | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Biosciences | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Biosciences | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Biosciences | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Biosciences | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Home made | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Home made | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Home made | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Home made | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | PerkinElmer, Inc. | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | EMD Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | PerkinElmer, Inc. | 6013621 |
References
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
- Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
- Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
- Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
- Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
- Major, J. L., Meade, T. J. B. ioresponsive Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
- Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
- Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
- Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
- Yoo, B., Pagel, An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
- Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
- Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
- Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
- Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
- Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).
