Summary
Tregs bağışıklık sisteminin güçlü bastırıcılar. Bunları tanımlamak için benzersiz yüzey belirteçleri bir eksikliği vardır, dolayısıyla, Tregs tanımları öncelikle fonksiyonel. Burada bir optimize tarif
Abstract
Düzenleyici T hücreleri (Tregs), self-antijenleri immün tolerans kritik arabulucular. Buna ek olarak, önemli bir enfeksiyon sonrası immün yanıt düzenleyicileri. Tregs benzersiz yüzey işaretleyici tanımlamak için çabalarına rağmen, sadece benzersiz özellik efektör T hücrelerinin çoğalması ve işlevi bastırmak için yeteneğidir. In vitro tayinlerde, sadece insan Treg fonksiyon değerlendirilmesinde kullanılabileceğini açık olmakla birlikte, otoimmün hastalıkları (Tip 1 Diyabet-T1D gibi) ihtiyacı olan kişilerde sağlıklı hücre ve hücreler izole kesitsel çalışmalardan elde edilen sonuçlar değerlendirilirken, bu sorunlu olur karşılaştırılabilir. Cevapçı oranları ve insan, antijen sunan hücrelerin sayısı ve türü (APC), in vitro bastırma tayinlerde: Cevapçı T hücreleri, stimülasyon doğası ve gücü, Treg sayısı ve türü laboratuvarlar arasında büyük bir değişkenlik yoktur. Bu değişkenliği Treg fonksiyonu zor ölçüm çalışmalar arasında karşılaştırma yapar. Treg alan sağlıklı kişilerde ve otoimmün hastalıklar ile çalışacak bir standart bastırma tahlil gerekiyor. Biz, pankreas β-hücrelerinin otoimmün yıkımı temel konularla karşılaştırıldığında sağlıklı gönüllüler izole edilen T hücrelerinin uyarılması çok az test içi değişkenlik gösterir in vitro bastırma tayininde geliştirdik . Bu parça ana hedefi, farklı konu grupları arasında karşılaştırma sağlayan in vitro insan bastırma tayininde bir tanımlamak için. Ayrıca, bu testte, küçük bir fonksiyon nTreg kaybı tasvir ve gelecekte daha da kaybı, önleyici immünomodülatör tedavi 1 yararlanabilir böylece tespit konularda tahmin etmek potansiyele sahiptir. Aşağıda, bu yordamı yer alan adımları ayrıntılı bir açıklama sağlar. Treg fonksiyonu ölçmek için kullanılan in vitro bastırma tayininde standardizasyon katkıda bulunmayı umuyoruz. Buna ek olarak, bağışıklık dengesizliği erken bir devlet ve T1D için potansiyel bir fonksiyonel biyomarker tanımak için bir araç olarak bu testte sunuyoruz.
Protocol
1. Bir bastırma tahlil kurmadan önce, daha sonra hücre uyarılması ve bir ihtiyacı için anti-insan CD3 (klon UCHT1, nihai konsantrasyonu 1μg/ml) kat tosylactivated boncuk boncuk verimli insan kullanarak in vitro proliferasyonu tayininde kurma kaplı olup olmadığını kontrol edin T hücreleri
- Orijinal şişe, manyetik standı yer M-450 tosylactivated boncuk 1ml alın ve tüm boncuklar tüp tarafına yapıştırılır kadar tutun. Tüp manyetik stand hala tamponu çıkarın. 37, ajitasyon tekrar süspansiyon boncuk buffer1 1 ml ve anti-insan CD3 40μl eklemek °; manyetik stand tüp ve buffer1 1 ml ekleyin, tekrar tüp manyetik standında yer ve tüp manyetik standında ise buffer1 kaldırmak C'de 15 dakika boyunca,% 0.1 w / v BSA ekleyin ve önümüzdeki 16 saat boyunca ajitasyon devam ediyor.
- 5 dakika boyunca tampon kaldırmak ve buffer2 1 ml boncuklar tekrar süspansiyon; boncuk ° C ve bir kez, 5 dakika buffer3 içinde 2-8 ° C yukarıda açıklandığı gibi manyetik standı kullanarak 2-8, iki kez buffer2 boncuk yıkayın 4x10 8 / ml son konsantrasyon ve kullanıma hazır.
- Kısım 50.000 ve 25.000 PBMC / 96 plaka triplicates ve CD3 kaplı boncuklar değişken sayısı (4x10 8 boncuk / ml, CD3 1μg/ml, örneğin 1, 2, 3, 4, 5 boncuk / hücre eklemek ) hücre başına boncuk optimal sayısını belirlemek için. 72 saat sonra kültür, 1μCi [3 H] timidin ekleyin ve 37 kuluçka ° C önümüzdeki 16 saat boyunca devam ediyor. Çoklu hasat plaka (Millipore) Hasat hücreleri, parıldamanın sıvı ve Kont NXT (Packard, CT) kullanılarak / dakika başına sayıları (CPM) okuyun. BGBM'leri 5000 yukarıda boncuk / hücre oranı ancak daha az 15000 baskılayıcı fonksiyonunu kaybedebilir Tregs, aşırı uyarılma önlemek için kullanın. Genellikle 3 boncuk / hücre oranı, şu ana kadar 1-4 test edilen tüm konu gruplarında cevaplayıcı ve Treg hücreleri uyarır .
2. Sağlıklı donörlerin veya insan leukopacks veya genellikle yerel Kan Transfüzyon Merkezleri sorumlu sağlıklı gönüllü ve alınan buffy coat (BC) (Şekil 1) tam kan hücre izolasyonu
- M.Ö. (~ 50 ml) 01:06 PBS ile (add 250ml) seyreltilir. Şimdi 300ml toplam hacmi vardır. Yavaşça seyreltilmiş M.Ö. 25ml 15ml Ficoll-Paque üst katmanı PLUS katmanları bozmadan, 50ml Falcon tüpler ekledi. 30 dakika 4 ° C, frenler için 800xg Santrifüj (sallanan kova rotor SH-3000 ile Sorvall santrifüj 1400) kapalı.
- Hücre katmanı (ara faz) dikkatli bir şekilde toplamak ve yeni bir 50ml Falcon tüpler aktarmak. PBMC DPBS ile 50ml tüpleri doldurarak yıkayın. Bir tüp içine 2 hücre pelletleri toplayın. 4 10 dakika 400xg santrifüjleyin ° C Her seferinde tek bir tüp içine 2 hücre pelletleri birleştirerek, iki kez adım yıkama tekrarlayın. Tek bir tüpe 50ml tüm hücre pelletleri birleştirin.
- Tripan Mavi dışlama testi kullanılarak hücre güvenin. 180μl Tripan Mavi leke PBMC, 20μl ekleyerek Tripan Blue 1:10 seyreltme olun. İyice karıştırın ve hemen hemasitometre saymak 20μl almak. Iki kare blok, her biri 16 küçük kare içeren bulunan tüm lekesiz ve sadece mavi boyanan hücrelerin sayıları sayma. Iki numara ortalama 10 ile çarpın. Hücre / ml 'lik bir numara almak için bu sayı 100 ile bölün. Canlı hücreler Yüzde olarak hesaplamak [1 - (mavi hücre sayısı / toplam hücre sayısı) x100]. Yaşayabilirliği ≥% 95 ise devam edin.
3. CD4-T hücreleri MACS ön sıralamak
- Devam etmeden önce, yeni bir tüp içine PBMC 1 ml transfer 5000rad bu ışınlanması için hücreleri hazırlamak için medya 4ml eklemek antijen-sunan hücreler (APC) olacaktır.
- PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon 250xg hücreleri geri kalanı Santrifüj 10 dakika süreyle 4 ° C PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon 4ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri dökün.
- MACS anti-CD4 mikro 200μl ekleyin ve 4 ° C'de 20 dakika için.
- 250xg PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon ve santrifüj 40ml ekleyerek yıkayınız 10 dakika süreyle 4 ° C Gazlar, oda sıcaklığında PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon, 8 ml supernatant ve tekrar süspansiyon dökün.
- LS sütun üzerinde yüklemeden önce Ön ayırma filtreleri kullanarak Filtre ayrı hücre süspansiyonu.
- Split hücre süspansiyonu ve katman 4ml üzeri kalibre her LS kolon (deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon 3ml). LS sütun MidiMACS ayırıcı sabittir. Hücre süspansiyonu, yeniden çalıştırmak flowthrough ya biterse veya PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon deggassed oda sıcaklığında 3ml eklemek ve tampon aracılığıyla çalışmasına izin önce. Daha fazla tampon temizlemek gelene kadar ekleyin.
- LS sütun üzerine Pipet 5ml deggassed tampon aracılığıyla ~ 1.0ml çalıştırmanızı sağlayarak yeni bir steril 15ml toplama tüpünün içine LS Sütun MidiMACS ayırıcı ve yerden kaldırmak. Sütuna piston koyun ve yavaş yavaş geri kalanı itinhacminin.
- Her iki LS sütunları ile aynı yapın ve iki CD4 + kesirler birleştirmek. 50ml PBS ve sayısı hücrelere ekleyin. Beklenen verim 5x10 8 hücrelere kadar. 2ml PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon 10 dakika ve tekrar süspansiyon hücreleri 400xg santrifüjleyin.
4. Floresan Aktif Hücre Ayırma (FACS) izolasyonu (Şekil 2)
- Aşağıdaki hücre yüzey belirteçleri (ışıktan korumak) CD işaretçileri antikorların bir kokteyl olun: 20 ul anti-insan CD8-FITC (klon RPA-T8), anti-insan CD14-FITC (klon M5E2 20 ul; LPS reseptör), 20 anti-insan CD32-FITC (klon FLI8.26 ul; FcγR tip II) ve anti-insan CD116-FITC (klon M5D12 6 ul GM CSFRα zinciri) ve alternatif olarak, 40μl karşıtı ekleyin insan CD4-APCCy7 (klon RPA-T4).
- 2ml hücre süspansiyonu 5μl alın ve leke kokteyl 2μl ile leke, bu eşik (Florokrom Eksi Bir FMO) 5 belirlemek için bir tüp.
- Leke kokteyl ve 4 ° C 30 dakika hücre süspansiyonu ve inkübe kokteyl, anti-insan CD25-PE (IL-2Rα klon M-A251) 50 ul ekleyin. 10 dakika 10 7 / ml bir hücre konsantrasyonu ve tekrar süspansiyon hücreleri için 400xg PBS, santrifüj hücre yıkayın.
- Boyanmamış hücre ve hücreler veya hücre FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ) sıralama için tazminat kontrolü olarak kullanmak için tek florokrom ile boyandı boncuk hazırlayın.
- FMO tüp hücreleri Edinme kullanıcı CD25 + T hücreleri (Şekil 2a) sıralama için eşik ayarlamak için izin verecektir. FITC-pozitif hücreler, monositler, makrofajlar ve diğer tüm CD4 + T hücreleri (Şekil 2b) oluşan dışlamak için bir kapı FITC-negatif hücrelerin etrafındaki ayarlayın.
- Ayrı bir arsa, CD25, CD25low ve CD25high T hücreleri-Tregs (üst, en yüksek sayıda CD25 eksprese eden hücrelerin% 1) (Şekil 2c) için geçitler çizerek. Hücre alt grupları genellikle yüksek saflıkta (Şekil 2d, 2e ve 2f) göstermektedir.
- 10 dakika için 400xg hücre toplama tüpleri Santrifüj ve kaplama kadar buz üzerinde saklayın.
5. 200μl/well 96-plaka (düzeni Tablo 1 olarak eklenmiştir) hücre kültürü ayarlayın
- CD3 kaplı boncuklar kısım 50μl (1 mcg / ml) 3 boncuk / U-alt% 10 toplanmış insan AB serum ile eksiksiz bir medya yeniden süspanse iyi cevaplayıcı hücre, 96-kuyucuğu olarak hesaplanmıştır. (Örneğin, CD3 kaplı 2ml medya, CD3 kaplı stok boncuk final konsantrasyonu 4x10 8 / ml 7.5μl almak ve medya 2ml sulandırmak; her 50μl 75.000 beads-3beads/cell içerecektir).
- 5x10 5 / ml hücre konsantrasyonunu ışınlanmış APC seyreltilir ve "sadece Tregs" olarak etiketlenen kuyular, Tablo "sadece APC" ve "medya sadece" dahil olmak üzere, önceden eklenmiş stimülasyon, her kuyuya 50μl eklemek (2.5 x 10 4 hücreler içeren) 1.
- Tablo 1'de tasarım aşağıdaki triplicates 2.5 x 10 4 / iyi CD4CD25 veya CD4CD25low T hücreleri ekleyin.
- Oranı 1:10 (2,500 Treg hücreleri) co-kültürler (satır B, Tablo 1) ve "sadece Tregs" olarak etiketlenen kuyulara Tregs ekle ve% 5 CO 2 ile CO 2 inkübatör plaka 37 ° C'de inkübe , 72 saat boyunca nem doymuş.
- Darbe 1μCi [3 H] timidin ile kuyu ve inkübasyon 37 ° C Sonraki 16 saat boyunca devam ediyor.
6. Hasat ve sayım
- Packard filtermate döver ya da alternatif bir sistem kullanarak çoklu hasat plaka üzerinde Hasat hücreleri.
- Sintilasyon sıvı (Microscint 20), son adım için hazırlık, şeffaf plastik bir kapak ile plaka hasat kapsar.
- Dakika başına sayıları (CPM) Okuma / Kont NXT (Packard, BT) veya alternatif bir sistem kullanıyor.
7. Bastırma Bilgisayar yüzdesi
- Hücreleri triplicates kültüre edildi olarak, ortalama her durum için hesaplanır. Varyasyon katsayısı>% 30 ise, uç ortalama iki kuyu yok ve sadece kopyaya. Bastırma Yüzde hesaplama ile elde edilir [(sc) / s] x% 100 = kopyaya tek kültür ve c = ko-kültür cpm.
- Naif (CD25-) ve in vivo aktif (CD25low) efektör T hücreleri cevaplayıcı T hücreleri olarak kaplama, bu alt gruplarının her bastırmak için Tregs yeteneğini fark öncül dayalı bir potansiyel fonksiyonel prognostik göstergesi olarak yakalanan ve kullanılan olduğu gibi bu aktif hücrelerin bastırmak için zordur.
8. Temsilcisi Sonuçlar:
Büyük değişkenlik yöntemleri kullanılmış ve in vitro insan bastırma tahlil edilen sonuçlar bize tahlil 1 etkileyen koşulların kapsamlı bir çalışma gerçekleştirmek için istenir. Daha önce 6 belirlenir Teffs (1:10): Biz Tregs arasında düşük oranı göz önünde bulundurularak, Treg fonksiyonu sadece test tahlil, aynı zamanda saflık geliştirdik. Buna ek olarak, Tregs th farklıbağışıklık dengesini tehlikeye T1D geliştirmek için risk altındaki kişilerde olduğu gibi başarıyla, naif ve Şekil 3 ve daha belirgin hale gelir, önceki çalışmalarda 2,4, gösterildiği gibi sağlıklı kişilerde bile vivo aktive T hücreleri, bastırmak için EIR yeteneği . Tahlil bize sağlıklı kontrol arasındaki fonksiyon karşılaştırmak için izin verir, biz doğal (nTregs), indüklenebilir (iTregs) ve in vitro genişletilmiş nTregs baskılayıcı fonksiyon karşılaştırıldığında çalışmada çok iyi çalıştı, yeni başlangıçlı (RO) T1D ve uzun süreli ( LS ) T1D konular. Biz RO T1D konularda fonksiyonel iTregs ve genişletilmiş nTregs üretme LS T1D ve sağlıklı bireyde 7 ile karşılaştırıldığında daha iyi bir kapasiteye sahip olduğu sonucuna varmıştır. Böylece, bu testte bağışıklık dengesizliği erken ve geç devlet hem de tanıma mükemmel bir araç olarak kullanılabilir.
Programı 1 şematik sunumu in vitro bastırma tayininde yer alan adımları
Şekil 1 fotoğraflarla birlikte sunulan in vitro bastırma tayininde Adımları
Şekil 2 FACS hücre izolasyonu Ayırıcı stratejisi. FITC-negatif hücrelerin (daha kapı vardı ve CD + CD25, CD + CD25low ve CD + CD25high olarak toplanan bir) CD25 + eşik) hücreler, c FITC-negatif olarak kapılı idi) Florokrom Eksi Bir (FMO), b göre ayarlanabilir oldu Tregs) yüzdeleri, d ile gösterilir) e sıralama sonra CD + CD25low sıralaması, sıralama sonra Tregs sıralaması FACS) FACS, ve f) sıralama sonra sıralaması CD4 + CD25-T hücrelerinin FACS
Şekil 3 sağlıklı bireylerden Temsilcisi sonuçları a) ilgili tüm hücre alt grupları için tek kültür olarak sunulan sağlıklı birey (naif-CD25-, in vivo aktif-CD25low, antijen sunan hücreler APC dakikada sayar Temsilcisi (CPM) ve Her CD25 ve otolog Tregs CD25low cevaplayıcı T hücrelerinin sağlıklı kontrol olgusu sunulmuştur (n bastırma düzenleyici T hücreleri-Treg) yanı sıra cevaplayıcı T hücrelerinin ortak kültürler (CD25-veya CD25low) ve Tregs b) Yüzde = 4). Bastırılması [(sc) / s] olarak hesaplanmıştır x% 100 = kopyaya kadar tek bir kültür ve c = kopyaya ko-kültür. Cevapçı T hücrelerini bastırmak için Tregs kapasitesi hafif fark fark olmasına rağmen,. C (t-testi p = 0.08 eşleştirilmiş)) Sunan cevaplayıcı olarak CD25 ve CD25low de dahil olmak üzere, tek tek her kültür için risk konular kopyaya kadar önemli değildi T hücrelerinin yanı sıra her cevaplayıcı T hücre alt otolog her CD25 ve CD25low cevaplayıcı T hücrelerinin baskılanması Tregs (CD25-/Tregs ve CD25low/Tregs) d) Yüzde numaralı seribaşı APC ve Tregs ve ortak kültürler Tregs riskli grup (n = 4) sunulmuştur. CD25-versus CD25low cevaplayıcı T hücreleri bastırmak için Tregs kapasitesi arasındaki fark anlamlıydı (eşleştirilmiş t-testi p = 0.04).
Tablo 1. Şematik in vitro bastırma tayininde kurdu
| 1-3 | 4-6 | 7-9 | 10-12 | |
| A | CD4CD25- | CD4CD25low | sadece medya | sadece medya |
| B | CD4CD25-/ Tregs | CD4CD25low / Tregs | Sadece Tregs | APC sadece |
| C | ||||
| D | ||||
| E | ||||
| F | ||||
| G | ||||
| H |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tregs tek benzersiz özellik olarak, baskılayıcı fonksiyonu aynı içinde ve farklı çalışmalar arasında hastalık gelişiminin farklı aşamalarını güvenilir ve düzgün konular arasında test edilmelidir. Biz bu testinin standardizasyonu için katkı olarak laboratuvarda geliştirilen bastırma tahlil detayları sunar. Geniş optimizasyon çalışması, insan anti-CD3 kaplı boncuklar (APC olarak hücre ile birlikte 1μg/ml konsantrasyonu UCHT1 klon (piyasada mevcut 5μg/ml karşı) ile T hücre stimülasyonu doğal uyarılması olduğunu tespit etti Sadece Ancell antikor beklenen sonuçlar verdi elimizde test konular 1 cevaplayıcı T hücreleri ve Tregs hem de aktive etme yeteneğine sahiptir. anti-insan CD3 antikor seçimi büyük önem taşımaktadır. insan anti-CD3 ve anti-aynı anda uyarılması insan CD28, hücre sinyal iletimi ve verimli stimülasyon şansını artırarak, ortak uyarıcı sinyaller komple bir palet teklif ederken konu grupları arasındaki farklar (sonuçlar gösterilmemiştir) tespit etmek için yeterli değildi.
Bu protokol ile leukopacks ve hasta kan kullanılabilir. Aradaki tek fark, hücre izolasyon prosedürü Ficoll Paque PLUS üstüne yüklenen gereken kan miktarı. Bu testte kullanılan medya, tahlil için büyük bir ek olarak belirlendi% 10 toplanmış insan AB serum, içerir. Bununla birlikte, kullanılmaya başlanmadan önce, serum sixplicate kendi (tohum PBMC PBMC etkinleştirmek ve yeni bir serum ile hiçbir serum ve ile eski serum ile tam RPMI ortam eklemek yeteneği için test edilmesi 72 saat nabız sonra plaka, 37 ° C, hasat hücreleri az 16 saat inkübe) kopyaya okumaları elde. Yeni serum ile kültür PBMC Artan kopyaya kadar iyi bir sonuç değildir ve yeni lot numarası ile bir serum için bir ihtiyaç olduğunu açıkça göstermektedir.
Biz, her numune için yeni bir LS sütun el ile yapılan sıralama MACS CD4 Automax kıyasla önemli ölçüde daha iyi verim + T hücreleri verdiğini tespit ettik. (Yanıtlayan: Buna ek olarak, Treg saflık CD25 ekspresyonu (Şekil 2d), in vitro proliferasyon (Şekil 3a), Treg arasında bir oranı 1:10 sağlıklı kişilerde yüksek baskılayıcı potansiyeli eksikliği tarafından değerlendirilecek,>% 95 olarak tespit edildi Şekil 3Ab) ve izole T hücre alt grupları (veriler gösterilmemiştir) arasında en yüksek Foxp3 ifade. Sonraki adım (Şekil 2b) prosedürü sıralama FACS sırasında FITC dökümü olarak kirlenmesine neden olan hücreler ortadan kalkar. CD4 işaretleyici boyama FACS gerekli değildir ve anti-insan CD25 ile kombine edildiğinde bu hücre popülasyonunun bir komplo FSC görülebileceği, ancak yapılabilir. Tregs tabi tüm gruplarda en yüksek sayıda CD25 eksprese eden hücrelerin en üst% 1 olarak sıralanır. Hastalık durumunun bağımsız olarak tüm konularda bu sıkı bir prosedür uygulamak bize test tüm konu gruplarında Tregs ve cevapçı T hücreleri (1:10) arasında sadece tek bir oran kullanmak için etkin. Ayrıca, aynı koşullar baskılayıcı potansiyeli Treg bir fark naif ve aralarındaki farkları dayalı yanıt olarak kullanılan in vivo aktive T hücreleri, 1 beklenebilir arasında görülen o kadar iyi çalışır. Ayrıca FACS sonra sıralama hücreleri bastırma tayininde önce eğrilecektir olduğunu tespit ettik.
Silahların Yayılmasını Önleme tritiated timidin kullanılarak ölçüldü. Alternatif olarak, hücre çoğalması, yeni sentezlenen DNA yerine timidin dahil 5-bromo-2'-dezoksiuridin, bir pirimidin analog kullanılarak ölçülebilir. BrdU Algılama Öropiyum disosiyasyon, flüorometre 8 ölçülebilir ayrışmış serbest floresan sinyal tespiti prosedürü alır BrdU (anti-BrdU-Eu) tanıyan antikorlar bağlı iyon dayanmaktadır. Üreticiye göre bu testte (DELFIA) [3 H] timidin ile karşılaştırılabilir duyarlılığı. Takip hücre çoğalması da kullanarak yapılan olabilir, örneğin, MTT veya üretilen hücre sayısı ve sinyal arasındaki ilişki ilk kez kurulacak ATCC, XTT deneyleri tetrazolium tuz türevleri, hücre oranı değişiklikleri spektrofotometrik kantifikasyon izin proliferasyonu ve canlılığı. Yine başka bir alternatif canlı hücre sayıları ve canlılığı fluorimetric kantifikasyon dayalı, DHL hücre canlılığı ve proliferasyonu tayininde kullanımı. Diğer potansiyel seçim sadece KAKE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) cevaplayıcı T hücreleri boyama ve kültür süre içinde her bir sonraki bölümü ile leke azaltılması izlemek için. Ancak, tayininde kullanılan stimülasyon bağlı olarak, 48 saatten daha uzun bir kuluçka KAKE-pozitif hücrelerin ayırt edilemez doruklarına neden olabilir. Böylece, her testlerin bazı avantajları ve dezavantajları vardır ve istenen sonuçları elde etmek için optimize edilmiş olması gerekir.
BGBM'leri insan anti-CD3 kaplı test etmek için her zaman yapılırsağlıklı hücre ve onlar için bu tür bir test kullanılmak üzere boncuk 5.000 üstünde değil, 15.000 üstünde olmalıdır. Biz genellikle yaptığımız her parti boncuk test ederken farklı boncuklar / hücre oranı seti, ve çoğu durumda biz 3 boncuk / hücre / kuyu 25.000 hücreleri ile en tutarlı bir kopyaya sahip. Toplu test sırasında BGBM'leri 3.000 altında olması durumunda, 5,000-15,000 cpm / iyi ulaşıncaya kadar, genellikle kaplama tekrarlayın. Bu nedenle, kaplama işlemi birkaç düzeyde kontrol ve güvenilir düşünün olmuştur. Bu nedenle, belli bir grup denek BGBM'leri (T1D geliştirmek için risk oto-antikor-pozitif hasta gibi) sürekli sağlıklı kişilere göre daha düşük olduğu zaman, biz bu sinyal iletim süreci tehlikeye olabilir sonuçlandırmak için bir nedeniniz var. , Pek çok çalışmada, şimdiye kadar 9-12 yayınlanan bastırılması deneyleri yanıt olarak naif hücreleri kullanılır olmasına rağmen, bazı, örneğin, APC gibi hücre varlığı, yanıt olarak çok farklı test koşullarında 13 veya hücre yanıt olarak CD4 ya kullanılır . eklendi Tregs 14 veya bastırıcılarının olarak monositler 15 ile tek ve ortak kültür onları kurmak. BGBM'leri yayılması yapılacaktır hakkında tüm tahlil varyasyonlar ve sonuçlar üretilir olacak olsa da, biz saf tek tip hücre alt yanıt daha spesifik sonuçlar verir ve hem Tregs ve yanıt hakkında ek sonuçlara varmak için bir potansiyele sahip olduğunu düşünüyorum. Burada sunulan bastırma tahlil yanıt (CD4 + CD25 ve CD4 + CD25low) olarak iki ayrı saf hücre alt grupları olarak, sağlıklı bireylerden elde edilen sonuçlar, risk etkilenen ya da konulara göre zaman bağışıklık homeostazı hakkında değerli bilgiler elde etmenin mümkün olduğunu pertürbasyon bağışıklık homeostazı (T1D gibi) sonucu ortaya çıkan bir hastalık gelişir. In vivo aktive T hücreleri çalışmalar giderek artan sayıda, gösterildiği gibi (CD4 + CD25low) engelli Tregs 16-19 baskılayıcı etkisi duyarlılık göstermektedir . Bu davranış için tam bir açıklama, daha fazla soruşturma gerektirir. Buna ek olarak, biz ve diğerleri T1D olan kişilerde Tregs gösterdiği gibi, T1D geliştirmek için risk, oto-antikor-pozitif hasta için de geçerlidir fonksiyonel bir kusur 2,9,10, göstermiştir ki Şekil (6) son raporunda 1. Olasılıklardan biri tüm CD4 sinyal iletimi ortak bir defekt onları yeterince stimülasyon cevap önlenmesi ve kendi effektör fonksiyonu etkileyen T1D konular etkilenen ve geliştirmek için risk altındaki hücreler, T. Olması, sinyal iletimi sonucunda, cevaplayıcı T hücreleri düşük cpm (Şekil 3c gösterilen) ve Tregs verimli bir şekilde bastırmak olmaz üretecek. Bu ya da diğer olasılıkları daha fazla keşfedilmeyi beklemektedir. Sağlık ve hastalık büyük rol Tregs oyun sayesinde, birçok laboratuvarda tahlil kendi ihtiyaçlarınıza ve yeteneklerinize göre ayarlayarak Treg fonksiyonu ölçülen var. Böylece, birçok faktör tayininde (cevaplayıcı / Treg izolasyon, türü ve APC, cevaplayıcı / Tregs, kültür zaman, yanı sıra izleme çoğalması yöntemi arasındaki oran uyarılması, türü ve sayısı yanıt, doğa ve gücü sayısı değişebilir ), Treg fonksiyonu etkilemektedir. Bu çalışma, bu nedenle, Treg fonksiyonu değerlendiren farklı çalışmalar daha kolay ve doğrudan bir karşılaştırma izin testinin standardizasyon süreci başlatmak için bir hedefi vardır.
Kabul edilirse, bu protokol Treg fonksiyon T1D ve diğer otoimmün hastalıklar etkilenen denekler için farklı laboratuarlar arasında karşılaştırma için izin verecektir. Bu protokol prognostik değeri, sadece bağışıklık homeostazı pertürbasyon sonucu olduğunu hastalıkları ile ilgilidir rağmen, geniş bir uygulama vardır ve herhangi bir konuda Treg fonksiyonu, hastalık olursa olsun bir değerlendirme için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Wisconsin ve Çocuk Araştırma Enstitüsü Wisconsin Juvenil Diabetesat Medical College Max McGee, Ulusal Araştırma Merkezi tarafından desteklenmiştir. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, ya da yazının hazırlanmasında rol oynamıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Biosciences | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Biosciences | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Biosciences | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Biosciences | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Biosciences | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Biosciences | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Home made | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Home made | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Home made | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Home made | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | PerkinElmer, Inc. | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | EMD Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | PerkinElmer, Inc. | 6013621 |
References
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
- Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
- Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
- Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
- Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
- Major, J. L., Meade, T. J. B. ioresponsive Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
- Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
- Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
- Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
- Yoo, B., Pagel, An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
- Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
- Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
- Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
- Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
- Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).
