Summary
Une variété de facteurs de croissance et les protéines interagissent pour induire les cellules à prendre sur le destin des cellules différentes lors du développement. Ici nous démontrons l'utilisation d'un en préparation pour répondre ovo interactions possibles entre les différentes protéines dans le développement en plaçant des perles sur E2.5 embryons de poulet.
Abstract
Le tube neural exprime de nombreuses protéines spécifiques dans les schémas spatio-temporelle pendant le développement. Ces protéines ont été montré pour être critique pour la détermination du destin cellulaire, migration cellulaire, et la formation des circuits neuronaux. L'induction neuronale et la structuration impliquent des protéines morphogénétiques osseuses (BMP), Sonic hedgehog (SHH), facteur de croissance des fibroblastes (FGF), entre autres. En particulier, le profil d'expression de Fgf8 est à proximité de régions BMP4 et SHH exprimer. Ce schéma d'expression est compatible avec les interactions de développement qui facilitent la structuration dans le télencéphale.
Ici, nous offrir une démonstration visuelle d'une méthode dans laquelle une préparation ovo peut être utilisé pour tester les effets des FGF dans la formation du cerveau antérieur. Perles sont revêtues de protéines et placé dans le tube neural de développement à fournir une exposition prolongée. Parce que la procédure utilise de petites perles soigneusement placé, il est peu invasive et permet plusieurs perles pour être placé dans un seul tube neural. Par ailleurs, la méthode permet le développement continu de sorte que les embryons peuvent être analysées à un stade plus mature pour détecter des changements dans l'anatomie et à la structuration neuronale. Ce protocole simple mais utile pour l'imagerie permet en temps réel. Il fournit un moyen de faire spatialement et temporellement des changements limités à des niveaux de protéine endogène.
Protocol
1. Retirer les oeufs de l'incubateur
A E2-2.5 (~ 17 Saint HH), retirez les oeufs et les préparer en conséquence. Ils peuvent être travaillés immédiatement ou retournés à la couveuse pendant quelques heures. Les œufs peuvent être placés à la température ambiante en toute sécurité pendant plus d'une heure. Les œufs peuvent rester en dehors, pour la durée des manipulations. Parfois, ils peuvent prendre une heure ou plus.
Remarque: Plus ils restent longtemps à température ambiante, moins ils sont susceptibles de survivre.
2. Préparation de l'encre de Chine
- Préparer une solution fraîche de l'encre de Chine 4% dans du PBS stérile.
- Remplir une seringue de 3 ml avec la solution.
- Placer une aiguille de calibre 27 ½, pouce sur la seringue.
- En utilisant une paire de pinces hémostatiques, plier l'aiguille à un angle de 90 °.
3. Ouverture des œufs et l'injection d'encre de Chine
- En utilisant une paire de forceps, peler la cassette et ouvrez la fenêtre, en le fixant en utilisant le verso de la bande sur la face arrière de l'œuf.
- Guide de l'aiguille inclinée jusqu'à ce qu'elle se situe juste en dessous de l'embryon. Placer l'aiguille sous le disque flottant assure que l'encre, qui est toxique pour l'embryon, ne viendra pas en contact direct.
- Vous devez seulement d'injecter suffisamment d'encre pour créer un contraste confortable. Cela est généralement inférieur à mL ¼.
4. L'ouverture du tube neural
- Prenez une paire de ciseaux de dissection fine et couper la fine membrane qui se trouve sur le dessus, ou parfois autour de l'embryon.
- Prenez une paire de pince 55 ou une sonde de tungstène et d'ouvrir le tube neural d'arrière en avant. Assurez-vous que l'ouverture est assez grand pour placer un cordon en elle.
Remarque: Selon l'âge, une sonde de fin de tungstène peuvent être utilisés pour faire la même chose.
5. Récupération d'un revêtement en acrylique perles héparine
- En utilisant une paire de pince 55, de trouver une perle intacte dans la solution. Laissez le cordon de s'attacher à la pointe, fermer lentement la pince.
- Retirer le cordon de la solution et l'amener plus sur le sommet de l'œuf.
- Une fois que la bille est hors de sa solution, il ne sera probablement pas se détacher jusqu'à ce qu'il ait été placé dans l'albumine.
6. Placer le cordon de
- Une fois la perle a été placé sur le dessus de la zone cible, l'utilisation d'une sonde de tungstène pour le guider vers le cerveau antérieur ou le fixer dans le cerveau postérieur.
- Ajouter quelques gouttes de PBS à l'aide d'une pipette 10 ul.
7. Fermeture de l'oeuf
- Fermer l'œuf à l'aide du petit morceau de ruban adhésif pour fermer la fenêtre.
- Sceau de l'œuf, selon le protocole apprêter, disponible à http://jove.com/index/Details.stp?ID=306 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selon les protéines que vous souhaitez utiliser, il existe des protocoles différents sur la façon de préparer les perles. Dans ces expériences, nous utilisons l'héparine acryliques perles, mais Affi-Gel perles peuvent également être utilisés. Nous avons trouvé que les billes d'héparine-acryliques sont plus faciles à manipuler dans l'environnement aqueux de l'albumine d'oeuf. Les perles sont trempés dans 5 l de protéines nuit à 4 ° C. Perles de contrôle sont placés dans du PBS stérile jusqu'au moment du placement. L'avantage d'utiliser une préparation in ovo est que l'embryon est toujours vivant et libre de se développer normalement 1. Bien que l'environnement dans lequel est conservé un explant peut être contrôlé pour des variables particulières, l'embryon vivant permet une représentation précise de l'effet d'une protéine sur les modèles développementaux 2-3. Tous les tests que vous pouvez effectuer sur un explant, vous pouvez avec un embryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD Biosciences | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments, Inc. | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
References
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
