Summary
Una variedad de factores de crecimiento y proteínas interactúan para inducir a las células para asumir los destinos diferentes de células durante el desarrollo. Aquí se demuestra el uso de una preparación para hacer frente a ovo las posibles interacciones entre diferentes proteínas en el desarrollo mediante la colocación de las cuentas de E2.5 embriones de pollo.
Abstract
El tubo neural se expresa muchas proteínas específicas en los patrones espacio-temporales durante el desarrollo. Estas proteínas se han demostrado ser fundamental para la determinación del destino celular, la migración celular y la formación de circuitos neuronales. Inducción neuronal y los patrones implican la proteína morfogenética ósea (BMP), Sonic hedgehog (SHH), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), entre otros. En particular, el patrón de expresión de Fgf8 se encuentra muy cerca de las regiones que expresan BMP4 y SHH. Este patrón de expresión es consistente con las interacciones que facilitan el desarrollo de patrones en el telencéfalo.
A continuación presentamos una demostración visual de un método en el que una preparación ovo puede ser utilizado para probar los efectos de la FCF en la formación del cerebro anterior. Cuentas están recubiertas con proteínas y se coloca en el tubo neural en desarrollo para proporcionar una exposición sostenida. Debido a que el procedimiento se utiliza cuentas pequeñas, cuidadosamente colocados, que es mínimamente invasiva y permite varias cuentas para ser colocado dentro de un único tubo neural. Además, el método permite el desarrollo continuado de modo que los embriones pueden ser analizados en una etapa más madura para detectar cambios en la anatomía y en los patrones neuronales. Este protocolo simple pero útil permite obtener imágenes en tiempo real. Proporciona un medio para hacer los cambios espaciales y temporales se limita a los niveles de proteína endógena.
Protocol
1. Eliminar los huevos de la incubadora
En E2-2.5 (17 ~ San HH), quitar los huevos y preparar en consecuencia. Se puede trabajar de forma inmediata o devueltos a la incubadora durante un par de horas. Los huevos se pueden colocar de forma segura a temperatura ambiente por más de una hora. Los huevos pueden permanecer fuera de la duración de las manipulaciones. A veces, estos pueden tomar una hora o más.
Nota: Cuanto más tiempo permanezcan a temperatura ambiente, es menos probable que puedan sobrevivir.
2. Preparación de la tinta china
- Prepare una solución fresca de un 4% de tinta India en PBS estéril.
- Llene una jeringa de 3 ml con la solución.
- Coloque una de calibre 27, una aguja de ½ pulgada en la jeringa.
- Con un par de pinzas hemostáticas, doblar la aguja a un ángulo de 90 °.
3. La apertura de los huevos y la inyección de tinta china
- Con un par de pinzas, despegue la cinta y abrir la ventana, asegurándola con el reverso de la cinta en la parte posterior del huevo.
- Guía de la aguja en ángulo hasta que se encuentra justo debajo del embrión. Colocar la aguja en el disco flotante asegura que la tinta, que es tóxico para el embrión, no entran en contacto directo.
- Usted necesita sólo la inyección de tinta suficiente para crear un contraste confortable. Esto es típicamente menos de ¼ ml.
4. La apertura del tubo neural
- Tome un par de tijeras de disección fina y cortar la delgada membrana que se encuentra en la parte superior, oa veces todo el embrión.
- Tome un par de pinzas de 55 o una sonda de tungsteno y abrir el tubo neural de posterior a anterior. Asegúrese de que la apertura es lo suficientemente grande como para colocar una gota en el mismo.
Nota: Dependiendo de la edad, una sonda de tungsteno bien se puede utilizar para hacer la misma cosa.
5. Recuperación de un recubrimiento de heparina de cuentas de acrílico
- Con un par de pinzas de 55, encontrar una intacta cuenta en la solución. Deja que el cordón se adhiere a la punta, poco a poco cerrar la pinza.
- Retire el cordón de la solución y ponerla en la parte superior del huevo.
- Una vez que la cuenta está fuera de su solución, que probablemente no saldrá hasta que haya sido colocado en la albúmina.
6. La colocación de la bola
- Una vez que el talón se ha colocado en la parte superior de la zona de destino, utilice una sonda de tungsteno para guiarla hacia el cerebro anterior o arreglarlo en la parte posterior del cerebro.
- Añadir unas gotas de PBS utilizando una pipeta de l 10.
7. Cierre del huevo
- Cerrar el huevo con la fina pieza de cinta adhesiva para cerrar la ventana.
- Sello del huevo de acuerdo con el protocolo preparando, disponible en http://jove.com/index/Details.stp?ID=306 .
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Discussion
En función de la proteína que desea utilizar, hay diferentes protocolos sobre cómo preparar las cuentas. En estos experimentos, el uso de heparina-acrílico cuentas, pero afi-gel cuentas también se pueden utilizar. Hemos encontrado que las cuentas de la heparina de acrílico son más fáciles de manipular en el medio acuoso de la albúmina de huevo. Cuentas se sumergen en 5 l de proteínas durante la noche a 4 ° C. Cuentas de control se colocan en PBS estéril hasta el momento de la colocación. La ventaja de utilizar una preparación in ovo es que el embrión está vivo y libre para desarrollarse con normalidad 1. Aunque el ambiente en el cual se mantiene un explante puede ser controlado por variables particulares, el embrión vivo permite una representación exacta del efecto de una proteína en los patrones de desarrollo 3.2. Todos los ensayos que se pueden realizar en un explante, puede con un embrión.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD Biosciences | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments, Inc. | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
References
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
