Summary
En mängd olika tillväxtfaktorer och proteiner samverkar för att få celler att ta på annan cell öden under utveckling. Här har vi demonstrera användningen av ett i ovo förberedelse för att hantera eventuella interaktioner mellan olika proteiner i utvecklingen genom att placera pärlor på E2.5 kycklingembryon.
Abstract
Neuralröret uttrycker många proteiner i specifika Spatiotemporal mönster under utveckling. Dessa proteiner har visat sig vara avgörande för cellernas öde beslutsamhet, cell migration, och bildandet av neurala kretsar. Neuronal induktion och mönstring innebär protein benmorfogenetiskt (BMP), Sonic Hedgehog (SHH), fibroblast tillväxtfaktor (FGF), bland annat. I synnerhet är uttrycket mönster av Fgf8 i nära anslutning till områden uttrycka BMP4 och SHH. Detta uttryck mönster stämmer överens med utvecklande samspel som underlättar mönster i telencephalon.
Här erbjuder vi en visuell demonstration av en metod där en ovo preparatet kan användas för att testa effekterna av Fgfs i bildandet av framhjärnan. Pärlor är belagda med protein och placeras i utvecklingsländerna neuralrörsdefekter att ge långvarig exponering. Eftersom förfarandet använder små, omsorgsfullt placerade kulor, det är minimalt invasiva och tillåter flera pärlor ska placeras i en enda neuralrörsdefekter. Dessutom tillåter metoden för fortsatt utveckling så att embryon kan analyseras på ett mer moget stadium upptäcka förändringar i anatomi och neurala mönster. Denna enkla men användbara protokollet möjliggör för realtids bildbehandling. Det ger en möjlighet att göra rumsligt och timligt begränsade ändringar endogena protein nivåer.
Protocol
1. Ta bort ägg från inkubatorn
I E2-2.5 (~ St 17 HH), ta bort äggen och förbereda dem därefter. De kan arbetat omedelbart eller tillbaka till inkubator för ett par timmar. Äggen kan placeras i rumstemperatur på ett säkert sätt i över en timme. Ägg kan stanna ute för länge manipulationer. Ibland kan dessa kan ta en timme eller mer.
Notera: Ju längre de sitter i rumstemperatur, desto mindre sannolikt är det att överleva.
2. Beredning av tusch
- Bered en färsk lösning på 4% tusch i sterila PBS.
- Fyll en 3 ml sprutan med lösningen.
- Placera en 27 gauge, ½ tum nålen på sprutan.
- Använda ett par peanger, böja nålen till en 90 ° vinkel.
3. Öppna ägg och injicering av tusch
- Med hjälp av en pincett, skala upp bandet och öppna fönstret, säkra den med hjälp av baksidan av tejpen på baksidan av ägget.
- Guide i de vinklade nålen tills den ligger precis under embryot. Placera nålen i den flytande disken försäkrar att bläcket, som är giftigt för embryot, inte kommer i direkt kontakt.
- Du behöver bara injicera tillräckligt med bläck för att skapa en behaglig kontrast. Detta är vanligtvis mindre än ¼ ml.
4. Öppning av neuralröret
- Ta ett par fina dissektion sax och skär tunt membran som ligger på topp, eller ibland runt, embryot.
- Ta ett par 55 pincett eller en volfram sond och öppna neuralrörsdefekter från bakre till främre. Se till att öppningen är tillräckligt stor för att placera en kula i den.
Obs: Beroende på ålder kan en tunn volfram sond användas för att göra samma sak.
5. Hämta en belagd heparin-akryl pärla
- Använda ett par 55 pincett, hitta en intakt pärla i lösningen. Låt pärla fästa sig på toppen, långsamt stänga pincett.
- Ta bort pärla från lösningen och få den över på toppen av ägget.
- När pärlan är ur sin lösning, kommer det sannolikt inte lossna förrän den har placerats i albumin.
6. Placering av pärla
- När pärlan har placerats på toppen av målområdet, använd en tungsten sond för att styra den mot framhjärnan eller fixa det i hindbrain.
- Tillsätt några droppar av PBS med hjälp av en 10 mikroliter pipett.
7. Utgående ägget
- Stäng ägget med hjälp av tunna bit tejp för att stänga fönstret.
- Täta ägget enligt prepping protokollet, som finns på http://jove.com/index/Details.stp?ID=306 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beroende på det protein du vill använda, det finns olika protokoll på hur man förbereder pärlor. I dessa försök använder vi heparin-akrylpärlor, men Affi-gel pärlor kan också användas. Vi har funnit att den heparin-akrylpärlor är lättare att manipulera i vattenfasen miljö äggalbumin. Pärlor är dränkta i 5 l protein över natten vid 4 ° C. Kontroll pärlor placeras i sterila PBS fram till tiden för placeringen. Fördelen med att använda en i ovo förberedelse är att embryot fortfarande lever och gratis att utvecklas normalt 1. Även om den miljö i vilken en Explantation hålls kan styras för vissa variabler, gör den levande embryot till en korrekt bild av effekten av ett protein på utvecklande mönster 2-3. Alla analyser som du kan utföra på en Explantation kan du med ett embryo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD Biosciences | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments, Inc. | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
References
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
