Summary
Этот протокол описывает, в частности, добыча от общего числа IgY из яичного желтка с помощью полиэтилена осадков гликоль и дает общую информацию о IgY технологии.
Abstract
Куры могут пройти иммунизацию с помощью им вакцинации (мышцы грудной, влево и вправо, объемом впрыска 0,5-1,0 мл) или с помощью генно-Gun-плазмиды иммунизации. В зависимости от иммуногенность антигена, высокие титры антител (до 1:100000 - 1:1000000) может быть достигнуто только после одного или 3 - 4 прививки импульс. Как правило, курица откладывает яйца непрерывно в течение около 72 недель, после укладки уменьшается мощность. Этот протокол описывает добычу от общего числа IgY из яичного желтка с помощью осаждения процедуры (PEG. Полсон и соавт. 1980). Метод включает в себя два важных шагов. Первое удаление липидов и второй осадков от общего числа IgY из супернатанта шагу. После диализа против буфера (как правило, PBS) IgY-экстракт может храниться при температуре -20 ° С в течение более года. Чистотой экстракта составляет около 80%, общая IgY на яйцо составляет от 40-80 мг, в зависимости от возраста несушки. Общая IgY содержание увеличивается с возрастом курица из примерно 40 мг / яйцо до 80 мг / яйцо (в отношении PEG осадков). Яйценоскость на курицу в год составляет около 325 яиц. Это означает, что общий потенциал урожая от 20 г общего IgY / год на основе среднего содержания IgY 60 мг общего IgY / яйцо (см. Таблицу 1).
Protocol
1. Протокол - IgY-экстракция с помощью ПЭГ-осадков
Рис. 1 приводится схема IgY-экстракции (см. таблицу 2). Протокол был впервые описан в Полсон и соавт. 1980 год.
Все шаги должны быть выполнены с использованием латексных перчаток.
- Яичной скорлупы тщательно трещины и желток переносится на "желток ложкой", чтобы удалить как можно больше яичного белка, насколько возможно.
- Желток переносится на фильтровальную бумагу и проката, чтобы удалить остатки яичного белка, то кожа желток режется с ланцетом или аналогичного инструмента (пипетки). Желток выливают в 50 мл трубки и яйца объем зарегистрированных (V1).
- Два раза объем яичный желток ФСБ смешивают с желтком (ΣV1 + V2), после этого 3,5% ПЭГ 6000 (в граммах, измельченный) от общего объема добавляется и перемешивают, а затем на 10 минут катался по прокатке смесителя. Это шаг отделяет процедуры извлечения суспензии в два этапа. Одна фаза состоит из "твердых желток и жировые вещества" (в оригинале котировки Полсон и соавт. 1980) и водянистые фазы, содержащей IgY и других белков.
- Трубы центрифугировали при 4 ° С в течение 20 мин (10 000 оборотов в минуту по 13 000 мкг, Heraeus Multifuge 3SR +, фиксированный угол ротора). Супернатант (V3) заливается через складчатый фильтр и переведен в новую трубу.
- 8,5% ПЭГ 6000 в граммах (рассчитанный в соответствии с новым объема) будут добавлены в трубке, встряхивали и проката на постоянной смесителя, как в шаге 3.
- Повторите шаг 4 с той разницей, что супернатант отбрасывается.
- Осадок тщательно растворяют в 1 мл PBS с помощью палки стекла и vortexer. PBS будет добавлен в конечном объеме 10 мл (V4). Раствор смешивают с 12% ПЭГ 6000 (м / о, 1,2 г) и обрабатывают, как в шаге 3 (вихрь, прокат смесителя).
- Повторите шаг 6 и растворить гранулы тщательно в 800 мкл PBS (стеклянной палочкой и вихревые). Подождите, пока пузырьки воздуха исчезают, а затем передать (пипетки) экстракт диализа капсулы. Промойте трубку с 400 мкл PBS и добавить объем диализа устройство (версии 5). (Для приготовления диализных устройств и мембран см. приложение).
- Экстракт диализу в течение ночи в 0,1% физиологического раствора (1600 мл) и осторожно перемешивают с помощью магнитной мешалки. Следующим утром, солевые заменяется PBS и диализ в течение еще трех часов.
- После этого IgY-экстракт вытащил из диализа капсулу пипетки и переданы в 2 мл труб. Конечный объем составляет около 2 мл (V6).
- Содержание белка (мг / мл) образцов измеряется фотометрически при 280 нм (1:50 разбавляют PBS) и рассчитывается в соответствии с Ламберта-Бера с коэффициента экстинкции 1,33 для IgY (см. рис. 2), рис . 4 показывает качество подготовки (чистота и восстановление около 80%).
- Желательно хранить образцы в аликвоты при -20 ° C (не замораживать образцы при -70 ° С).
- Качество последние приготовления анализируется простой SDS-PAGE, как описано в протоколе Юпитера http:/www.jove.com/details.php?id=1916
2. Приложение-перед использованием диализа пакет должен быть подготовлен в следующем образом в соответствии с рекомендациями производителя:
- 20 пакетиков диализа разрезают на куски по 30 см и приводится в 2000 Стакан стеклянный мл.
- 1750 мл 5 мМ ЭДТА-раствору добавляют.
- Стеклянная воронка находится над мешки для того, чтобы сумки покрыты раствора ЭДТА. Раствор нагревают и кипятят в течение 5 мин (плитка). Раствор сливают и сумки промывают три раза дистиллированной водой.
- Еще раз 1750 мл ЭДТА-раствору добавляют, кипятят 5 мин и промывают три раза дистиллированной водой как указано выше.
- Наконец диализа мешки кипятят 10 мин в дистиллированной воде и хранили при 4 ° C. Выньте диализа мешки с помощью пинцета стерилизовать.
3. Представитель результаты
Рисунок 1. Принципиальная схема IgY-экстракция с помощью полиэтиленгликоля осадков в соответствии с первоначальным описанием Полсон и соавт. 1980 год. Для просмотра больших изображений, нажмите здесь.
Рисунок 2. Разработка полного IgY в яичном желтке иммунизированных кур в зависимости от возраста. Учитывая это еженедельное среднее общее IgY / яйцо и SD (п = 4 кур-несушек). Из [Паули и соавт. 2009]).
Рисунок 3. Layiнг потенциала в области мониторинга четырех кур, иммунизированных различными антигенами. Стрелки указывают дату иммунизации (из [Паули и соавт. 2009]). Для просмотра больших изображений, нажмите здесь.
Рисунок 4. Полиакриламидном-Gelelectrophoresis индивидуальной подготовки IgY из разных яиц в восстановительных условиях
Полоса 1 - маркер молекулярного веса, переулок 2 - IgY стандарта, Lane 3-5 - различные образцы IgY приготовленного, как описано в протоколе. Эти последние приготовления в соответствии с шагом 10 из протокола. HC - тяжелые цепи, LC - светло chaines,? - Незначительные примеси соответствующие молекулярным весом около 35 кДа (вероятно, С-концевой фрагмент предшественника вителлогенина II, [Klimentzou и др., 2006.]).
| Куриные 21 (антиген) | Куриные 22 (антиген) | Куриные 19 (антиген В) | Куриные 23 (антиген С) | |
| Яйцо числа (всего IgY) 1, 2-летний период | 625 (38 г) | 626 (38 г) | 545 (33 г) | 608 (37 г) |
| Яйцо числа (всего МГГ), первый год | 345 (20 г) | 304 (16 г) | 326 (18 г) | 308 (17 г) |
| Яйцо числа (всего МГГ), второй год | 280 (18 г) | 322 (21 г) | 219 (15 г) | 300 (20 г) |
| % От макс. возможное число яйцо (первый год) 2 | 106 | 93 | 100 | 95 |
| % От макс. возможное число яиц (второй год) | 86 | 99 | 67 | 92 |
| количество обработанных яиц | 565 | 620 | 283 | 401 |
1 Общая сумма IgY рассчитывается путем умножения количества яиц средним значением 60 мг белка в яйце в соответствии с данными на рисунке 2.
2 макс. возможное число яйца в год составляет 325 в соответствии с информацией селекционера.
Таблица 1. Два года статистика яйцо яйценоскость кур, иммунизированных различными антигенами. Укладка мощности в процентах не более четырех кур после иммунизации различными антигенами, а также IgY-исхода в течение двух лет (см. также рис. 3), [Паули и соавт. 2009]).
| Яйцо Nr. | Курица Nr. Укладка дате | V1 [мл] желток | V2 [мл] PBS | 1. PEG предшествующий. [Г] | Том [мл] после | 2. PEG предшествующий. [Г] | Гранула | 3. PEG предшествующий. [Г] | Гранула | Том [мл] | Общий белок мг / мл | Исправлено общего белка мг / мл |
| 2xV1 ΣV1 + V2 | 3,5% [м / о] ΣV1 + V2 | предшествующий., centrif. и фильтрации V3 | 8,5% [м / о] V3 | растворяется в мл PBS V4 | 12% [/ об] V4 | Растворенный в мл PBS V5 | После диализа против PBS V6 | A280/ml | A280/ml: 1.33 | |||
| 1 | H293 / 22.10. | 15 | 30 45 | 1,58 | 31 | 2,63 | 10 | 1,2 | 1,2 | 1,7 | 35,0 | 26,3 |
| 2 | H293 / 23.10. | 13 | 26 39 | 1,37 | 25 | 2,12 | 10 | 1,2 | 1,2 | 1,7 | 28,8 | 21,6 |
Таблица 2. Образцовый протокол PEG осадков
Discussion
Выбор подходящего метода очистки IgY зависит от масштаба очистки (лабораторных или промышленных), эффективность затрат, технологии (лабораторное оборудование), и воздействие на окружающую среду (управление отходами). Различные методы добычи IgY были подробно рассмотрен Де Meulenaer & Huyghebaert (2001, для обзора см. также Шаде и соавт. 2005). В целом, эти методы могут быть разделены на три основные группы:
- Осадки методами: с участием аммония или сульфата натрия, полиэтиленгликоль (ПЭГ), каприловой кислоты и caragenean.
- Хроматографические методы: аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии взаимодействия, thiophylic хроматографии взаимодействия, и гель-фильтрации хроматографии.
- Ультрафильтрации.
Чистота IgY препарата может быть увеличена на комбинации методов, например, ПЭГ осадков могут быть объединены с аффинной хроматографии. В некоторых случаях, в зависимости от конечного применения, водный экстракт IgY достаточно для достижения хороших результатов (Акита и Накаи 1993). По нашему опыту, IgY-образец получаем с помощью ПЭГ-осадков работал очень хорошо в много различных иммунологических анализов. За счет стандартизации PEG-метода осаждения один технический помощник способен обрабатывать около 84 яиц в неделю, что соответствует сумме от общего числа IgY от 4 до 7 г в неделю. Простой расчет: несушки является иммунизированных антигеном. Через несколько прививки повышения курицы производит специфические антитела (АТ) с титр 1:50000 в течение периода в 30 дней. 30 яиц х 2 мл IgY экстракт (см. протокол и рис. 3) соответствует 60 мл общего IgY, который, в свою очередь, соответствует Ab-разведении 3000 л (мощностью ведро 10 л), это означает, что с 3000 л решения Ab 300 ведра могут быть заполнены. Таким образом, с учетом такого огромного количества Ab-это не проблема для хранения Аб-пул постоянное качество и специфику. Этот метод уменьшает заряд / много изменчивости в противном случае наблюдается в polyspecific Ab.
Несмотря на аспекте количества, IgY Ab еще больше преимуществ по сравнению с IgG млекопитающих: Нет активации системы комплемента млекопитающих, нет перекрестной реактивности с HAMA (человеческих анти мышиного антитела), ревматоидный фактор или человеческие группы крови антигенов (отсутствие heteroagglutinins).
Выдающимися преимуществами IgY-Ab является так называемый филогенетический расстояния. Филогенетические расстояние причина часто описывают различия между особенностями Ab млекопитающих и куры, даже тогда, когда одинаково прививки. В дополнение к различиям между млекопитающих и птичьего иммунной системы сами, различия в филогенетического развития в этих двух классов животного вносит свой вклад в различные особенности Ab. Некоторые авторы сообщают, что куры часто производят Abs против филогенетически хорошо сохранились и млекопитающих, белки или пептиды более эффективно, чем кролики (см. обзор Шаде и др. a. 2005). Как следствие, сохраняется антиген может оставаться "в масках", чтобы кролик иммунной системы, и тем самым вызывают только слабые или "тихая" ответ. Кроме того, если кур и кроликов, иммунизированных млекопитающих же антиген, очень часто куры ответить Ab-специфичность, что редко могут быть достигнуты в кроликов. Также аспект животных очень важно, поскольку Ab являются неинвазивным извлечены из яичного желтка. В сочетании с Джином-Gun (плазмиды) иммунизации IgY производства полностью неинвазивным (Витковский и соавт. 2009).
В заключение производства Ab у кур и IgY-экстракция с помощью ПЭГ-осадки очень рентабельным и приводит к весьма специфический Ab со стабильной титры до 1:1000000. В связи с филогенетической расстояние между Aves и Mammalia, курица в состоянии производить конкретные Ab против хорошо сохранились и млекопитающих антигенов, в отличие от, например, кроликов. Огромный объем Ab получен IgY-технология открывает двери и для использования IgY-Ab в человеческой и ветеринарной медицине для терапевтических / профилактических целях.
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Landesamt меха Gesundheit унд Soziales Берлине (H 0069/03).
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом немецкого Федерального министерства образования и исследований (проект BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, и ltraschnelle D etektion унд я dentifizierung фон bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Мы благодарим В. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Берлине, Institut für Pharmakologie) за отличную техническую помощь.
Materials
|
References
- Akita, E. M., Nakai, S. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain. J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).
- De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review. Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).
- Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27, 183-193 (2006).
- Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period. Poultry Science. 88, 281-290 (2009).
- Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens. Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).
- Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology. , Springer. Berlin. (2001).
- Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).
- Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies. J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).
