Summary
Dieses Protokoll beschreibt insbesondere die Extraktion der Gesamt-IgY aus Eigelb mittels Polyethylenglykol Niederschlag und gibt allgemeine Informationen über IgY-Technologie.
Abstract
Hens kann durch im Impfung (Musculus pectoralis, links und rechts, Injektionsvolumen 0,5-1,0 ml) oder mit Hilfe von Gene-Gun-Plasmid-Immunisierung immunisiert werden. Abhängig von der Immunogenität des Antigens, hohe Antikörper-Titer (bis 1:100.000 - 1:1.000.000) kann nach nur einem oder 3 erreicht werden - 4 steigern Impfungen. Normalerweise legt eine Henne Eier kontinuierlich für etwa 72 Wochen, danach wird die Legeleistung sinkt. Dieses Protokoll beschreibt die Extraktion von insgesamt IgY aus Eigelb durch ein Niederschlag Verfahren (PEG. Polson et al. 1980). Das Verfahren beinhaltet zwei wichtige Schritte. Die erste ist die Entfernung von Lipiden und das zweite ist die Fällung von insgesamt IgY aus dem Überstand von step one. Nach der Dialyse gegen einen Puffer (in der Regel PBS) der IgY-Extrakt kann bei -20 ° C für mehr als ein Jahr gelagert werden. Die Reinheit des Extraktes beträgt rund 80%, variiert die Summe IgY pro Ei 40 bis 80 mg, abhängig vom Alter der Legehennen. Der gesamte Inhalt IgY steigt mit dem Alter der Henne von rund 40 mg / Ei bis zu 80 mg / Ei (über PEG-Fällung). Die Legeleistung einer Henne pro Jahr rund 325 Eier. Das bedeutet insgesamt möglichen Ernte von 20 g insgesamt IgY / Jahr bezogen auf eine mittlere IgY-Gehalt von 60 mg insgesamt IgY / Ei (siehe Tabelle 1).
Protocol
1. Protokoll - IgY-Extraktion mittels PEG-Fällung
Abb.. 1 zeigt eine schematische Darstellung des IgY-Extraktionsverfahren (siehe Tabelle 2). Das Protokoll wurde erstmals im Polson et al. 1980.
Alle Schritte sollten unter Verwendung von Latex-Handschuhe werden.
- Die Eierschale ist sorgfältig geknackt und das Eigelb ist es, eine "Eidotter Löffel" übertragen, um so viel Eiweiß wie möglich zu entfernen.
- Das Eigelb auf ein Filterpapier übertragen und gerollt, um restliche Eiklar zu entfernen, dann das Eigelb Haut mit einer Lanzette oder ein ähnliches Instrument (Pipettenspitze) geschnitten. Das Eigelb wird in eine 50 ml Tube gegossen und das Ei Volumen registriert ist (V1).
- Zweimal das Eigelb Volumen von PBS ist mit dem Eigelb (ΣV1 + V2), danach 3,5% PEG 6000 (in Gramm, pulverisiert) des Gesamtvolumens gemischt zugegeben und gevortext, gefolgt von 10 min ins Rollen auf einer rollenden Mischer. Dieser Schritt der Extraktion trennt die Suspension in zwei Phasen. Eine Phase besteht aus "Eigelb Feststoffe und fetthaltigen Substanzen" (original Zitat von Polson et al. 1980) und eine wässrige Phase, die IgY und andere Proteine.
- Die Röhrchen werden bei 4 ° C zentrifugiert für 20 min (10.000 rpm nach zu 13.000 xg, Heraeus Multifuge 3SR +, Festwinkelrotor). Der Überstand (V3) wird durch ein Faltenfilter gegossen und in einen neuen Schlauch.
- 8,5% PEG 6000 in Gramm (berechnet nach dem neuen Volume) sind in das Röhrchen gegeben, gevortext und rollte auf einem rollenden Mischer wie in Schritt 3.
- Wiederholen Sie Schritt 4 mit dem Unterschied, dass der Überstand verworfen wird.
- Das Pellet wird vorsichtig in 1 ml PBS durch ein Glas-Stick und dem Vortexer aufgelöst. PBS ist ein Endvolumen von 10 ml (V4) aufgenommen. Die Lösung wird mit 12% PEG 6000 (w / v, 1,2 Gramm) gemischt und wie in Schritt 3 (Wirbel, Walzen-Mischer).
- Wiederholen Sie Schritt 6 und lösen das Pellet vorsichtig in 800 ul PBS (Glas-Stick und Vortex). Warten Sie, bis die Luftblasen verschwinden und dann übertragen (Pipette) der Extrakt einer Dialyse Kapsel. Spülen Sie den Schlauch mit 400 ul PBS und fügen Sie die Lautstärke auf den Dialyse-Gerät (V5). (Zur Herstellung von Dialyse-Geräte und Membranen siehe Anhang.)
- Der Extrakt wird über Nacht in 0,1% iger Kochsalzlösung (1.600 ml) dialysiert und vorsichtig durch einen Magnetrührer gerührt. Am nächsten Morgen ist die Kochsalzlösung durch PBS ersetzt und dialysiert für weitere drei Stunden.
- Danach wird der IgY-Extrakt wird aus der Dialyse Kapsel mit einer Pipette gezogen und auf 2 ml Röhrchen. Das Endvolumen beträgt ca. 2 ml (V6).
- Der Proteingehalt (mg / ml) der Proben wird photometrisch bei 280 nm (1:50 verdünnt mit PBS) gemessen und berechnet nach dem Lambert-Beer-Gesetz mit einem Extinktionskoeffizienten von 1,33 für IgY (siehe Abb.. 2), Abb. . 4 zeigt die Qualität der Vorbereitung (Reinheit und Erholung sind rund 80%).
- Es ist ratsam, die Proben in Aliquots bei -20 ° C (nicht einfrieren die Proben bei -70 ° C).
- Die Qualität der letzten Vorbereitungen wird durch einfache SDS-PAGE analysiert, wie in JoVE Protokoll beschrieben http:/www.jove.com/details.php?id=1916
2. Appendix-vor Gebrauch der Dialyseschlauch in folgender Weise muss nach den Empfehlungen des Herstellers vorbereitet werden:
- 20 Dialyseplätze Taschen sind in Stücke von 30 cm geschnitten und da in einem 2000 ml Becherglas.
- 1.750 ml einer 5 mM EDTA-Lösung versetzt.
- Ein Glastrichter über dem Beutel gelegt, um sicherzustellen, dass die Beutel von der EDTA-Lösung bedeckt sind. Die Lösung wird erhitzt und für 5 min gekocht (Heizplatte). Die Lösung wird dekantiert und die Taschen sind dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen.
- Noch einmal 1.750 ml EDTA-Lösung versetzt, für 5 min gekocht und dreimal mit destilliertem Wasser wie oben.
- Schließlich wird die Dialyse-Taschen sind für 10 min in destilliertem Wasser gekocht und bei 4 ° C. Nehmen Sie die Dialysebeutel durch sterilisierte Pinzette.
3. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Schematische Darstellung der IgY-Extraktion mittels Polyethylenglykol Niederschläge nach der ursprünglichen Beschreibung der Polson et al. 1980. Um eine größere Ansicht klicken Sie hier.
Abbildung 2. Entwicklung der Gesamt-IgY im Eidotter immunisierter Hühner in Abhängigkeit vom Alter. Da ist der wöchentliche Mittelwert der insgesamt IgY / Ei-und SD (n = 4 Legehennen). Von [Pauly et al. 2009]).
Abbildung 3. Laying Kapazität Überwachung von vier Hennen mit verschiedenen Antigenen immunisiert. Die Pfeile zeigen die Immunisierung Datum (aus [Pauly et al. 2009]). Um ein größeres Bild hier klicken Ansicht.
Abbildung 4. Polyacrylamid-Gelelektrophorese einzelner IgY-Präparationen aus verschiedenen Eiern unter reduzierenden Bedingungen
Lane 1 - Molekulargewichtsmarker, Spur 2 - IgY-Standard, Lane 3-5 - verschiedene IgY Proben hergestellt, wie im Protokoll beschrieben. Dies sind die letzten Vorbereitungen nach 10 des Protokolls Schritt. HC - schwere Ketten, LC - Licht chaines,? - Geringfügige Verunreinigungen entsprechend Molekulargewicht ca. 35 kDa (wahrscheinlich die C-terminale Fragment von Vitellogenin II-Vorstufe [Klimentzou et al, 2006.]).
| Huhn 21 (Antigen A) | Huhn 22 (Antigen A) | Huhn 19 (Antigen B) | Huhn 23 (Antigen C) | |
| Egg (Gesamtzahl IgY) 1, 2-Jahres-Zeitraum | 625 (38 g) | 626 (38 g) | 545 (33 g) | 608 (37 g) |
| Egg (Gesamtzahl IgY), im ersten Jahr | 345 (20 g) | 304 (16 g) | 326 (18 g) | 308 (17 g) |
| Egg (Gesamtzahl IgY), zweites Jahr | 280 (18 g) | 322 (21 g) | 219 (15 g) | 300 (20 g) |
| % Der max. möglichen Keim-Nummer (erstes Jahr) 2 | 106 | 93 | 100 | 95 |
| % Der max. möglichen Keim-Nummer (zweites Jahr) | 86 | 99 | 67 | 92 |
| Anzahl der verarbeiteten Eier | 565 | 620 | 283 | 401 |
1 Die Höhe der insgesamt IgY wird durch Multiplikation der Zahl der Eier durch einen mittleren Wert von 60 mg Protein pro Ei nach den Angaben in Abbildung 2 berechnet.
2 Die max. möglichen Keim-Anzahl pro Jahr liegt bei 325 nach einer Information des Züchters.
Tabelle 1. Zwei Jahre Statistik der Eiablage Kapazität von Hühnern, die mit verschiedenen Antigenen immunisiert. Legen Kapazität in Prozent der maximal vier Hennen nach Immunisierung mit verschiedenen Antigenen sowie die IgY-Ergebnis innerhalb von zwei Jahren (siehe auch Abb.. 3), [Pauly et al. 2009]).
| Egg Nr. | Hen Nr. Legedatum | V1 [ml] Eigelb | V2 [ml] PBS | 1. PEG prec. [G] | Vol [ml] nach | 2. PEG prec. [G] | Pellet | 3. PEG prec. [G] | Pellet | Vol [ml] | Insgesamt Protein mg / ml | Korrigierte gesamten Proteins mg / ml |
| 2xV1 ΣV1 + V2 | 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 | prec., centrif. und Filtration V3 | 8,5% [w / v] V3 | gelöst in ml PBS V4 | 12% [w / v] V4 | Gelöst in ml PBS V5 | Nach der Dialyse gegen PBS V6 | A280/ml | A280/ml: 1,33 | |||
| 1 | H293 / 22.10. | 15 | 30 45 | 1,58 | 31 | 2,63 | 10 | 1,2 | 1,2 | 1,7 | 35,0 | 26,3 |
| 2 | H293 / 23.10. | 13 | 26 39 | 1,37 | 25 | 2,12 | 10 | 1,2 | 1,2 | 1,7 | 28,8 | 21,6 |
Tabelle 2. Beispielhafte Protokoll der PEG-Fällung
Discussion
Die Wahl eines geeigneten IgY Reinigungsverfahren ist nach Skala der Reinigung (Labor oder Industrie), Wirtschaftlichkeit, Technik (Laborausstattung) und Auswirkungen auf die Umwelt (Abfallwirtschaft) beeinflusst. Verschiedene IgY Extraktionsmethoden wurden im Detail durch De Meulenaer & Huyghebaert (2001, zur Überprüfung siehe auch Schade et al. 2005) überprüft. Im Allgemeinen können diese Methoden in drei Hauptgruppen eingeteilt werden:
- Niederschlag Methoden: mit Ammonium-oder Natriumsulfat, Polyethylenglykol (PEG), Caprylsäure und caragenean.
- Chromatographische Methoden: Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Interaktions-Chromatographie, thiophylic Interaktionschromatographie und Gelfiltration gereinigt.
- Ultrafiltration.
Die Reinheit eines IgY Vorbereitung kann durch eine Kombination von Methoden erhöht werden, z. B. PEG-Fällung mit Affinitätschromatographie kombiniert werden. In einigen Fällen, abhängig von der endgültigen Anwendung wird ein wässriger Extrakt der IgY ausreichend, um gute Ergebnisse (Akita & Nakai 1993) zu erreichen. Nach unserer Erfahrung, arbeiteten die IgY-Probe, die wir durch PEG-Fällung erhalten sehr gut in vielen verschiedenen immunologischen Tests. Durch die Standardisierung der PEG-Fällungsverfahren eine technische Assistentin in der Lage, ungefähr 84 Eier pro Woche, was zu einem Betrag von insgesamt IgY zwischen 4 und 7 g pro Woche entspricht Prozess. Eine einfache Rechnung: Eine Legehenne ist mit einem Antigen immunisiert. Nach ein paar steigern Impfungen die Henne produziert spezifische Antikörper (Ab) mit einem Titer von 1:50.000 in einem Zeitraum von 30 Tagen. 30 Eier x 2 ml IgY-Extrakt (siehe Protokoll und Bild. 3) entspricht 60 ml insgesamt IgY, was wiederum entspricht einer Ab-Verdünnung von 3.000 l (die Kapazität einer Schaufel 10 l), die mit 3.000 l bedeutet von Ab Lösung 300 Eimer gefüllt werden kann. Also, im Hinblick auf so große Ab-Menge ist es kein Problem, eine Ab-Pool von konstanter Qualität und Spezifität zu speichern. Diese Technik reduziert die Lade / viel Variabilität sonst in polyspezifischen Ab beobachtet.
Trotz der Aspekt der Quantität haben IgY Ab weitere Vorteile im Vergleich zu Säugetieren IgG: Keine Aktivierung von Säugetier-Komplement-System, keine Kreuzreaktivität mit HAMA (human anti-Maus-Antikörper), Rheumafaktoren oder menschlichen Blutgruppen-Antigene (fehlende heteroagglutinins).
Ein herausragender Vorteil der IgY-Ab ist die sogenannte phylogenetische Distanz. Phylogenetische Distanz ist der Grund für die häufig beschriebenen Unterschiede zwischen den Ab Besonderheiten von Säugetieren und Geflügel, auch wenn identisch immunisiert. Neben den Unterschieden zwischen den Säugetieren und die Vogelgrippe Immunsystem selbst trägt Unterschiede in stammesgeschichtlichen Entwicklung in diesen beiden Tierklassen auf die verschiedenen Ab Besonderheiten. Mehrere Autoren haben berichtet, dass Hühner produzieren häufig Abs gegen phylogenetisch hochkonservierte Säugetieren gewonnenen Proteinen oder Peptiden effizienter als die Kaninchen (für eine Übersicht siehe Schade et a. 2005). Als Folge davon kann eine konservierte Antigen bleiben "maskiert", um das Kaninchen Immunsystem und verursachen so nur einen schwachen oder eine "stille" Antwort. Außerdem, wenn Hühner und Kaninchen mit der gleichen Säugetieren Antigen immunisiert, sehr oft die Hühner mit einem Ab-Spezifität, die nur selten bei Kaninchen erzielt werden können reagieren. Auch der Aspekt des Tierschutzes ist wichtig, da die Ab non-invasiv werden extrahiert aus Eigelb. In Kombination mit Gene-Gun (Plasmid) Immunisierung der IgY-Produktion ist komplett nicht-invasive (Witkowski et al. 2009).
Im Ergebnis ist die Herstellung von Ab in Hennen und die IgY-Extraktion mittels PEG-Fällung sehr kostengünstig und führt zu sehr spezifischen Ab mit stabilen Titer von bis zu 1:1.000.000. Aufgrund der phylogenetischen Abstand zwischen Aves und Mammalia sind Hühner in der Lage, spezifische Ak gegen hochkonservierte Säugetieren Antigene im Gegensatz zu zB Kaninchen zu produzieren. Die außergewöhnliche Höhe der Ab durch IgY-Technologie erhalten die Tür öffnet auch für den Einsatz von IgY-Ab in Human-und Veterinärmedizin zu therapeutischen / prophylaktischen Zwecken.
Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her, indem Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin (H 0069/03) eingestellt durchgeführt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem deutschen Bundesministerium für Bildung und Forschung gefördert (Projekt BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und ich dentifizierung von bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Wir danken B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie) für hervorragende technische Unterstützung.
Materials
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References
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- Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period. Poultry Science. 88, 281-290 (2009).
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