Summary
Detta protokoll beskriver i synnerhet utvinning av totala IgY från äggula med hjälp av polyetylenglykol nederbörd och ger allmän information om IgY teknik.
Abstract
Höns kan immuniserade med hjälp av im vaccination (Musculus pectoralis, vänster och höger, injektionsvolym 0,5-1,0 ml) eller med hjälp av Gene-Gun plasmid-immunisering. Beroende på immunogenicitet av antigenet, hög antikropps-titer (upp till 1:100,000 - 1:1,000,000) kan nås efter bara en eller från 3 till 4 uppsving vaccinationer. Normalt lägger ett hönsägg kontinuerligt under ca 72 veckor, därefter om kapaciteten minskar. Detta protokoll beskriver utvinning av totala IgY från äggula med hjälp av en nederbörd förfarande (PEG. Polson et al. 1980). Metoden innebär att två viktiga steg. Den första är att avlägsna lipider och den andra är utfällning av totala IgY från supernatanten i steg ett. Efter dialys mot en buffert (normalt PBS) i IgY-extrakt kan förvaras vid -20 ° C i mer än ett år. Renhet extraktet är runt 80%, varierar den totala IgY per ägg från 40-80 mg, beroende på ålder värphöns. Den totala IgY halten ökar med åldern på hönan från cirka 40 mg / ägg upp till 80 mg / ägg (om PEG nederbörd). Den om kapacitet på en höna per år är ca 325 ägg. Det innebär en total potentiell skörd på 20 g totala IgY / år baserat på en genomsnittlig IgY innehåll av 60 mg totalt IgY / ägg (se tabell 1).
Protocol
1. Protokoll - IgY-extraktion med hjälp av PEG-fällning
Fig.. 1 ger en schematisk bild av IgY-extraktion förfarande (se tabell 2). Protokollet beskrevs första gången i Polson et al. 1980.
Alla steg ska utföras med latexhandskar.
- Den äggskal är noggrant sprucken och äggulan överförs till en "äggula sked" för att ta bort så mycket äggvita som möjligt.
- Äggulan överförs till ett filtrerpapper och rullade för att ta bort återstående äggvita, sedan äggulan huden skärs med en lansett eller liknande instrument (pipettspetsen). Äggulan hälls i en 50 ml rör och ägget volym är registrerat (V1).
- Dubbelt så äggulan volym PBS blandas med äggula (ΣV1 + V2), därefter 3,5% PEG 6000 (i gram, pulveriserade) av den totala volymen har lagts till och vortexed, följt av 10 min rulla på rullande mixer. Det steg i extraktionsförfarande separerar suspensionen i två faser. En fas består av "gula fasta ämnen och fettämnen" (ursprungliga noteringen för Polson et al. 1980) och en vattnig fas med IgY och andra proteiner.
- Rören centrifugeras vid 4 ° C i 20 minuter (10.000 rpm enligt 13.000 xg, Heraeus Multifuge 3SR +, fast vinkel rotor). Supernatanten (V3) hälls genom ett veckfilter och överföras till ett nytt rör.
- 8,5% PEG 6000 i gram (beräknat enligt den nya volymen) läggs till i röret, vortexed och rullade på rullande mixer som i steg 3.
- Upprepa steg 4 med den skillnaden att supernatanten tas bort.
- Pelleten löses försiktigt i 1 ml PBS med hjälp av ett glas käppen och vortexer. PBS läggs till en slutlig volym på 10 ml (V4). Lösningen blandas med 12% PEG 6000 (w / v, 1,2 gram) och behandlas som i steg 3 (virvel, rullande mixer).
- Upprepa steg 6 och lös pelleten försiktigt i 800 l PBS (glas käpp och skaka). Vänta på att luftbubblor försvinner och sedan överföra (pipett) extraktet till en dialys kapsel. Skölj röret med 400 l PBS och tillsätt volymen till dialys enheten (V5). (För beredning av dialys enheter och membran se bilaga.)
- Extraktet dialyserade över natten i 0,1% saltlösning (1600 ml) och försiktigt rörs med hjälp av en magnetomrörare. Nästa morgon är den saltlösning ersättas med PBS och dialys i ytterligare tre timmar.
- Därefter IgY-extrakt dras från dialys kapseln med en pipett och överföras till 2 ml rör. Den slutliga volymen är ca 2 ml (V6).
- Proteinhalten (mg / ml) av proverna mäts med en fotometer vid 280 nm (1:50 efter utspädning med PBS) och beräknas enligt Lambert-Beers lag med en extinktionskoefficienten för 1,33 för IgY (se bild. 2), Fig . 4 visar kvaliteten av preparatet (renhet och återhämtning är cirka 80%).
- Det är lämpligt att lagra prover i alikvoter vid -20 ° C (inte frysa proverna vid -70 ° C).
- Kvaliteten på de sista förberedelserna analyseras med enkla SDS-PAGE enligt JUPITER-protokollet http:/www.jove.com/details.php?id=1916
2. Bilaga-före användning av dialys påsen måste vara beredd på följande sätt enligt tillverkarens rekommendationer:
- 20 dialys väskor är skurna i bitar på 30 cm och ges i en 2000 ml-glasbägare.
- 1750 ml av en 5 mM EDTA-lösning tillsätts.
- En glastratt ovanför väskor för att säkerställa att väskor omfattas av EDTA-lösningen. Lösningen värms upp och kokas i 5 min (värmeplatta). Lösningen dekanteras och väskor tvättas tre gånger med destillerat vatten.
- Än en gång 1750 ml EDTA-lösning tillsätts, kokas i 5 min och tvättas tre gånger med destillerat vatten som ovan.
- Slutligen dialys väskor kokas i 10 min i destillerat vatten och förvaras vid 4 ° C. Ta ut dialys påsar med hjälp av steriliserad pincett.
3. Representativa resultat
Figur 1. Skiss av IgY-extraktion med hjälp av polyetylenglykol nederbörd enligt den ursprungliga beskrivningen av Polson et al. 1980. att visa en större bild klicka här.
Figur 2. Utveckling av total-IgY i äggula immuniserade höns i beroende av ålder. Med tanke på den veckovisa medelvärdet av totala IgY / ägg och SD (n = 4 värphöns). Från [Pauly et al. 2009]).
Figur 3. Laying kapacitet övervakning av fyra höns som vaccinerats med olika antigener. Pilarna visar immunisering datum (från [Pauly et al. 2009]). vill se en större bild klicka här.
Figur 4. Polyacrylamide-Gelelectrophoresis enskilda IgY preparat från olika ägg under reducerande betingelser
Körfält 1 - molekylviktsmarkör, Lane 2 - IgY-standard, Lane 3-5 - olika IgY prov som har beretts enligt anvisningarna i protokollet. Detta är sista förberedelserna enligt steg 10 i protokollet. HC - tunga kedjor, LC - ljus chaines,? - Mindre föroreningar motsvarande molekylvikt runt 35 kDa (förmodligen den C-terminala fragment av vitellogenin II föregångare, [Klimentzou et al, 2006.]).
| Kyckling 21 (Antigen A) | Kyckling 22 (Antigen A) | Kyckling 19 (Antigen B) | Kyckling 23 (Antigen C) | |
| Ägg nummer (totalt IgY) 1, 2-årsperiod | 625 (38 g) | 626 (38 g) | 545 (33 g) | 608 (37 g) |
| Ägg nummer (totalt IgY), första året | 345 (20 g) | 304 (16 g) | 326 (18 g) | 308 (17 g) |
| Ägg nummer (totalt IgY), andra året | 280 (18 g) | 322 (21 g) | 219 (15 g) | 300 (20 g) |
| % Av max. möjligt ägg nummer (första året) 2 | 106 | 93 | 100 | 95 |
| % Av max. möjligt ägg nummer (andra året) | 86 | 99 | 67 | 92 |
| Antalet bearbetade ägg | 565 | 620 | 283 | 401 |
1 Den totala mängden IgY beräknas genom att multiplicera antalet ägg med ett medelvärde på 60 mg protein per ägg enligt uppgifter i figur 2.
2 max. möjligt ägg nummer per år är 325 enligt en information om uppfödare.
Tabell 1. Två år statistik över äggläggning kapacitet kycklingar immuniserade med olika antigener. Förläggning kapacitet i procent av maximalt fyra hönor efter immunisering med olika antigener samt IgY-utfallet under två år (se även fig. 3). [Pauly et al. 2009]).
| Egg Nr. | Hen Nr. Värpdagen | V1 [ml] äggula | V2 [ml] PBS | 1. PEG PREC. [G] | Vol [ml] efter | 2. PEG PREC. [G] | Pellet | 3. PEG PREC. [G] | Pellet | Vol [ml] | Totalt protein mg / ml | Korrigerad totalt protein mg / ml |
| 2xV1 ΣV1 + V2 | 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 | PREC., centrifugeringseffekt. och filtrering V3 | 8,5% [w / v] V3 | upplöst i ml PBS V4 | 12% [w / v] V4 | Upplöst i ml PBS V5 | Efter dialys mot PBS V6 | A280/ml | A280/ml: 1,33 | |||
| 1 | H293 / 22,10. | 15 | 30 45 | 1,58 | 31 | 2,63 | 10 | 1,2 | 1,2 | 1,7 | 35,0 | 26,3 |
| 2 | H293 / 23,10. | 13 | 26 39 | 1,37 | 25 | 2,12 | 10 | 1,2 | 1,2 | 1,7 | 28,8 | 21,6 |
Tabell 2. Exemplarisk protokollet av PEG nederbörd
Discussion
Valet av en lämplig IgY reningsmetod påverkas av omfattningen av rening (laboratorium eller industri), kostnadseffektivitet, teknik (laboratorieutrustning) och miljöpåverkan (avfallshantering). Olika IgY extraktionsmetoder granskades i detalj av De Meulenaer & Huyghebaert (2001, för granskning se även Schade et al. 2005). I allmänhet kan dessa metoder delas in i tre huvudsakliga grupper:
- Nederbörd metoder: med ammonium eller natriumsulfat, polyetylenglykol (PEG), kaprylsyra och caragenean.
- Kromatografiska metoder: affinitetskromatografi, jonbyteskromatografi, hydrofob interaktion kromatografi, thiophylic interaktion kromatografi, och gel-filtrering kromatografi.
- Ultrafiltrering.
Renheten av en IgY preparatet kan ökas genom en kombination av metoder, till exempel, kan PEG nederbörd kombineras med affinitetskromatografi. I vissa fall, beroende på den slutliga ansökan, är en vatten-extrakt av IgY tillräcklig för att uppnå goda resultat (Akita & Nakai 1993). Enligt vår erfarenhet arbetade IgY-provet vi får med PEG-fällning mycket bra i en massa olika immunologiska analyser. Genom att standardisera PEG-fällning metoden en teknisk assistent kan bearbeta ca 84 ägg per vecka, vilket motsvarar ett belopp på totalt IgY mellan 4 och 7 g per vecka. En enkel beräkning: En värphöna är immuniserade med ett antigen. Efter några uppsving vaccinationer hönan producerar specifika antikroppar (Ab) med en titer 1:50,000 under en period av 30 dagar. 30 ägg x 2 ml IgY extrakt (se protokoll och fig. 3). Motsvarar 60 ml totalt IgY, vilket i sin tur motsvarar en Ab utspädning av 3000 l (kapacitet en hink är 10 l), det betyder med 3000 l för Ab lösning 300 hinkar kan fyllas. Så, med tanke på så stora Ab-mängden är det inga problem att lagra en Ab-pool av jämn kvalitet och specificitet. Denna teknik minskar laddning / massa variabilitet annat observerats i polyspecifikt Ab.
Trots den aspekten av kvantitet, IgY Ab har ytterligare fördelar jämfört med däggdjur IgG: Ingen aktivering av däggdjur komplementsystemet, ingen korsreaktivitet med HAMA (human anti mus antikropp), reumatoid faktorer eller blod antigener grupp (brist på heteroagglutinins).
En enastående fördel med IgY-Ab är den så kallade fylogenetiska avstånd. Fylogenetiska avstånd är orsaken till den ofta beskrivs skillnaderna mellan Ab särdrag däggdjur och höns, även när identiskt vaccineras. Förutom skillnader mellan däggdjur och fåglar immunförsvaret själva bidrar skillnader i fylogenetiska utvecklingen i dessa två djur klasser för att de olika Ab särdrag. Flera författare har rapporterat att kycklingarna ofta producerar Abs mot fylogenetiskt starkt konservativa däggdjursproteiner eller peptider mer effektivt än vad kaniner (för granskning se Schade et a. 2005). Som en konsekvens kan en bevarad antigen vara "maskerad" till kaninen immunförsvaret, och därmed orsaka bara en svag eller en "tyst" svar. Dessutom, om höns och kaniner immuniserade med samma däggdjur antigen, ofta kycklingarna svarar med en Ab-specificitet som sällan kan uppnås på kaniner. Även aspekten av djurskydd är viktigt eftersom Ab är icke-invasivt utvinns från äggula. I kombination med Gene-Gun (plasmid) immunisering av IgY-produktion är helt icke-invasiv (Witkowski et al. 2009).
Sammanfattningsvis är produktionen av Ab höns och IgY-extraktion med hjälp av PEG-fällning mycket kostnadseffektiv och resulterar i mycket specifika Ab med stabil titrar upp till 1:1,000,000. På grund av det fylogenetiska avstånd mellan Aves och Mammalia, kyckling kan tillverka specifika AB mot starkt konservativa däggdjur antigener i motsats till t ex kaniner. Den extra mängd Ab erhålls genom IgY-tekniken öppnar dörren också för att använda IgY-Ab i human-och veterinärmedicin i terapeutiskt / profylaktiskt syfte.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin (H 0069/03).
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (Project BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und jag dentifizierung von bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Vi tackar B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie) för utmärkt tekniskt bistånd.
Materials
|
References
- Akita, E. M., Nakai, S. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain. J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).
- De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review. Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).
- Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27, 183-193 (2006).
- Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period. Poultry Science. 88, 281-290 (2009).
- Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens. Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).
- Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology. , Springer. Berlin. (2001).
- Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).
- Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies. J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).
