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Immunology and Infection

IgY的技术:从蛋黄鸡抗体提取聚乙二醇(PEG)降水量

doi: 10.3791/3084 Published: May 1, 2011

Summary

这个协议描述,尤其是从蛋黄IgY的提取由聚乙二醇沉淀的手段,并给出了有关IgY的技术信息。

Abstract

母鸡可以通过IM疫苗接种( 胸肌 ,左,右,注射量为0.5-1.0毫升)的手段,或通过质粒基因枪免疫接种。依赖于抗原的免疫原性,高的抗体滴度(高达1:100000 - 1:1,000,000)可以达到后,只有一个或3 - 4提高免疫接种。通常,一只母鸡下蛋持续约72周,随后铺设能力下降。这个协议描述手段(PEG.波尔森等人 ,1980年)的降水过程,从蛋黄中总IgY的提取。该方法包括两个重要的步骤。第一个是清除血脂,第二个是从第一个步骤上清总IgY的降水。反对的缓冲液(通常PBS)透析后的IgY的提取物可以储存在-20 ° C了一年多。提取的纯度在80%左右,每个鸡蛋的总IgY的不同从40-80毫克,依赖于蛋鸡年龄。总IgY的母鸡的年龄大约为40毫克/蛋高达80毫克/蛋(关于PEG沉淀)含量的增加。铺设了母鸡每年的容量大约为325鸡蛋。这意味着潜在总收成的20克总卵黄/年的平均卵黄含量60毫克的总IgY的/蛋(见表1)的基础上。

Protocol

1。通过PEG沉淀提取协议 - 卵黄

图1给出了一个IgY的提取过程示意图(见表2)。该协议最初是在波尔森 。 1980年。
使用乳胶手套,应执行的所有步骤。

  1. 仔细蛋壳破裂,蛋黄转移到一个“蛋黄勺”,以尽可能多的蛋白尽可能删除。
  2. 蛋黄是转移到滤纸和冷轧删除余下的蛋清,蛋黄皮肤被切断与柳叶刀或类似工具(枪头)。倒入50毫升管蛋黄和蛋量(V1),注册。
  3. 两次蛋黄体积的PBS混合蛋黄(ΣV1+ V2),其后为3.5%PEG 6000总量(克,煤粉)和振荡,其次是在一个滚动的混频器滚动10分钟。这一步分离提取过程分两个阶段进行停牌。一个阶段,包括“蛋黄固体和脂肪类物质”(原报价波尔森等人,1980年)和水样含有卵黄抗体和其他蛋白质的阶段。
  4. 离心管是在4 ° C为20分钟(每分钟10000转13000 XG,贺利氏Multifuge 3SR +固定角度转子)。上清(V3)浇通过折叠滤芯,并转移到一个新的管。
  5. 添加8.5%聚乙二醇6000克(根据新卷)管,振荡并在第3步中的滚动搅拌机推出。
  6. 重复第4步的差异,被丢弃上清。
  7. 仔细颗粒溶解在1 mL PBS玻璃棍和vortexer。 PBS是一个10毫升的最终卷(V4)。解决的办法是混有12%的PEG 6000(W / V,1.2克),并在第3步(旋涡,滚动混频器)治疗。
  8. 重复步骤6和800μLPBS溶解沉淀仔细(玻璃粘和涡)。等待气泡消失,然后转移(​​吸管)洗肾胶囊提取。 400μLPBS冲洗管和添加量的透析设备(V5)。 (见透析设备和膜的制备附录。)
  9. 提取物是夜间透析超过0.1%的盐水(1600毫升),通过磁力搅拌器轻轻搅拌。第二天早晨,用PBS代替生理盐水,再过三个小时的透析。
  10. 此后IgY的提取物是从透析胶囊拉吸管,并转移至2ml管。最终体积约2毫升(V6发动机)。
  11. 光度测量的样品的蛋白质含量(毫克/毫升)是在280 nm(用PBS稀释1:50),根据朗伯 - 比尔定律计算为IgY的消光系数为1.33(见图2),图。 4显示了该制剂的质量(纯度和回收率都在80%左右)。
  12. 这是最好存储在样品分装于-20℃(不冻结的样品在-70 ° C)。
  13. 在朱庇特的协议描述http:/www.jove.com/details.php?id=1916的最后准备工作的质量是由简单的SDS - PAGE分析

2。附录使用前透析袋,必须根据制造商的建议,准备以下列方式:

  1. 20透析袋切割件30厘米,在一个2000毫升的玻璃烧杯。
  2. 1750毫升5毫米EDTA解。
  3. 一个玻璃漏斗放在袋以上,以确保袋是由EDTA溶液。解决的方法是加热煮沸5分钟(热板)。解决的办法是转自袋是用蒸馏水洗涤三次。
  4. 再次1,750毫升EDTA的解决方案,补充说,煮沸5 min,用蒸馏水洗涤三次以上。
  5. 最后,透析袋煮沸蒸馏水10分钟,并保存在4 ° C。消毒镊子取出透析袋。

3。代表性的成果

图1
图1。卵黄提取的示意图,根据聚乙二醇沉淀波尔森等人的原始描述。 1980年, 要查看一个较大的图像,请点击这里

图2
图2的年龄依赖性的免疫母鸡的鸡蛋蛋黄中总IgY的发展。是每周平均总IgY的/蛋和SD(N = 4蛋鸡)。从[Pauly 等人,2009年])。

图3
图3。拉依吴四只蛋鸡,不同的抗原免疫能力监测。箭头指示免疫日期(从[Pauly 等人,2009年])。 查看大图请点击这里。

图4
图4。还原条件下个人IgY的准备工作,从不同的鸡蛋聚丙烯酰胺凝胶电泳
巷1 - 2巷 - IgY的标准,巷3-5 - 不同IgY的样品分子量标记,准备在协议中所述。这些最后的准备,根据该协议的步骤10。慧聪 - 重链,液相色谱 - 光chaines,? -相应的分子量约35 kDa的(可能卵黄二,易制毒化学的C -末端片段,[Klimentzou等,2006])的细微杂质。

  鸡21(抗原A) 鸡22(抗原A) 鸡19(抗原乙) 鸡23(抗原彗星)
产蛋数(总IGY)1,2年期 625(38克) 626(38克) 545(33克) 608(37克)
产蛋数(总IgY的),第一年 345(20克) 304(16克) 326(18克) 308(17日克)
产蛋数(总IgY的),第二年 280(18克) 322(21克) 219(15克) 300(20克)
%最大。可能产蛋数(第一年)2 106 93 100 95
%最大。可能产蛋数(第二年) 86 99 67 92
加工蛋 565 620 283 401

1 IgY的总额是60毫克每鸡蛋的蛋白质,根据图2中的数据的平均值乘以一个鸡蛋的数量计算。

2最大。根据饲养员的信息可能每年产蛋数为325。

表1。两年的统计数据具有不同的抗原免疫鸡的产蛋能力。铺设与不同的抗原,以及在两年IgY的结局后的免疫能力,最多四只蛋鸡%(参见图3), 保利等人,2009年] )。

蛋NR。 母鸡NR。布设日期 V1 [ML]蛋黄 V2 [ML] PBS 1。聚乙二醇PREC。 [G] VOL [ML]后 2。聚乙二醇PREC。 [G] 弹丸 3。聚乙二醇PREC。 [G] 弹丸 VOL [毫升] 总蛋白毫克/毫升 矫正总蛋白毫克/毫升
2xV1ΣV1+ V2 3.5%W / V]ΣV1+ V2 PREC。centrif。和过滤的V3 8,5%[W / V] V3 溶解于毫升PBS V4 12%[W / V] V4 溶于毫升PBS V5 经过透析对PBS V6 A280/ml A280/ml:1.33
1 H293 / 22.10。 15 30 45 1.58 31 2.63 10 1.2 1.2 1.7 35.0 26.3
2 H293 / 23.10。 13 26 39 1.37 25 2.12 10 1.2 1.2 1.7 28.8 21.6

表2 PEG沉淀模范协议

Discussion

选择一个合适的IgY的提纯方法是影响净化(实验室或工业),成本效益,技术(实验室设备),和对环境的影响(废物管理)的规模。德Meulenaer Huyghebaert(2001年,审查也看到SCHADE ,2005)详细审查各种IgY的提取方法。在一般情况下,这些方法可分为三个主要群体:

  1. 沉淀法:涉及铵或硫酸钠,聚乙二醇(PEG),辛酸和caragenean。
  2. 色谱方法:thiophylic相互作用层析,疏水层析,亲和层析,离子交换层析,凝胶过滤色谱。
  3. 超滤

IgY的制备纯度可提高相结合的方法,例如,PEG沉淀可与亲和层析结合。在某些情况下,取决于最终的应用程序,IgY的水提取物足以达到良好的效果(秋田县井1993年)。根据我们的经验,IgY的样本,我们获得PEG沉淀在很多不同的免疫检测工作非常出色。通过规范的PEG沉淀法,一个技术助理是能够处理约84鸡蛋每星期,这相当于4至7克,每周的总卵黄金额。一个简单的计算:一个蛋鸡是一种抗原免疫接种。经过几次提高免疫接种母鸡的生产与1:50,000滴度的特异性抗体(AB)在为期30天。 30鸡蛋× 2毫升卵黄提取物(见协议和图3),相当于总卵黄60毫升,这反过来又对应AB - 3000升的稀释(一斗的容量为10升),这意味着有3000升AB的解决方案,300桶,可填补。因此,在数量如此巨大的AB -的存储稳定的质量和特异性抗体池,它是没有问题的。这种技术减少了充电/很多的可变性,否则在多特异性抗体观察。

尽管数量方面,卵黄抗体与哺乳动物IgG抗体相比有更多的优势:没有激活哺乳动物补体系统,没有交叉反应HAMA(人抗鼠抗体),类风湿因子或人类的血型抗原(heteroagglutinins缺乏)。

卵黄抗体的一个突出的优点是所谓的进化距离。亲缘距离是经常描述的哺乳动物和鸡的抗体特异性之间差异的原因,即使在相同的免疫。除了哺乳动物和禽流感的免疫系统本身之间的差异,在进化发展的差异,这两个动物类AB不同的特殊性。几位作者报道,鸡往往会产生ABS对系统发育上高度保守的哺乳动物蛋白或多肽更有效地比兔(审查SCHADE等A. 2005)。因此,可以保持一个保守的抗原“蒙面”兔的免疫系统,从而导致只有微弱或“沉默”回应。此外,如果鸡兔是哺乳动物具有相​​同的抗原免疫的,往往是鸡与AB -特异性,很少能在兔子取得回应。动物福利方面是重要的,因为是AB从蛋黄中提取的非侵入性。结合基因枪(质粒)免疫IgY的生产是完全非侵入(Witkowski 2009)。

总之,母鸡和PEG沉淀IgY的提取生产的AB是非常符合成本效益和高度特异性的与稳定的滴度AB以1:1,000,000结果。由于鸟类哺乳动物之间的进化距离,鸡能够产生对特定的高度保守的哺乳动物抗原抗体,如兔。 IgY的技术获得数额特别巨大的AB,打开门也使用在人类医学和兽医学卵黄抗体治疗/预防的目的。

Disclosures

动物实验Landesamt毛皮Gesundheit和Soziales柏林(H 0069/03)所规定的准则和法规的规定执行。

Acknowledgments

这项工作是由德国联邦教育与研究部的赠款支持(项目BiGRUDI [ologischeefahrenlagen:R isikobewertung,ü ltraschnelle ð etektion 我dentifizierung冯bioterroristisch relevanten Agenzien,13N9594]) 。我们感谢B. Diemar(Charité Universitätsmedizin柏林,研究所献给Pharmakologie)优秀的技术援助。

Materials

  1. Dialyse Bag Visking, Type 27/32, cut off -14 kD, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
  2. Falcon tubes Blue Max, 50 ml Polypropylene Conical Tube, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes NY, USA
  3. Folded Filter MN 615 ¼, 150 mm, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany Heraeus
  4. Magnetic stirrer, Variomag Mono, H+P Labortechnik AG, Oberschleißheim, Germany
  5. Micro-Dialyse-Capsule 5,0 ml, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
  6. Multifuge 3SR+, Thermo Scientific, Langenselbold, Germany
  7. Photometer UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Germany
  8. Polyethylene Glycol 6000, Rotipuran Ph. Eur., Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
  9. Premixed PBS-Buffer 10x, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany
  10. Roller Mixer SRT2, Stuart, Staffordshire, UK
  11. Vibrofix VF2, Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen i.Br., Germany
  12. Yolk spoon, Fackelmann (houshold effects), Germany

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References

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Cite this Article

Pauly, D., Chacana, P. A., Calzado, E. G., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation. J. Vis. Exp. (51), e3084, doi:10.3791/3084 (2011).More

Pauly, D., Chacana, P. A., Calzado, E. G., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation. J. Vis. Exp. (51), e3084, doi:10.3791/3084 (2011).

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