Summary
Dit protocol beschrijft in het bijzonder de winning van het totaal IgY uit eidooier door middel van polyethyleenglycol neerslag en geeft algemene informatie over IgY technologie.
Abstract
Hennen mogen worden geïmmuniseerd door middel van im vaccinatie (Musculus pectoralis, links en rechts, injectievolume 0,5-1,0 ml) of door middel van Gene-Gun plasmide-immunisatie. Afhankelijk van de immunogeniciteit van het antigeen, hoge antilichaam-titers (tot 1:100.000 - 1:1.000.000) kan worden bereikt na slechts een of 3-4 boost vaccinaties. Normaal gesproken, een kip legt eieren continu voor ongeveer 72 weken, daarna de aanleg capaciteit afneemt. Dit protocol beschrijft de winning van het totaal IgY uit eidooier door middel van een neerslag procedure (PEG. Polson et al.. 1980). De methode bestaat uit twee belangrijke stappen. De eerste is de verwijdering van lipiden en de tweede is de neerslag van het totaal IgY uit het supernatans van stap een. Na dialyse tegen een buffer (normaal PBS) de IgY-extract kan worden opgeslagen bij -20 ° C voor meer dan een jaar. De zuiverheid van het extract is ongeveer 80%, de totale IgY per ei varieert 40 tot 80 mg, afhankelijk van de leeftijd van de leghen. Het totale IgY content neemt toe met de leeftijd van de duivin van circa 40 mg / ei tot 80 mg / ei (met betrekking tot PEG neerslag). De aanleg capaciteit van een hen per jaar is ongeveer 325 eieren. Dat betekent een totale potentiële oogst van 20 g totaal IgY / jaar op basis van een gemiddelde IgY-gehalte van 60 mg totaal IgY / ei (zie tabel 1).
Protocol
1. Protocol - IgY-extractie met behulp van PEG-precipitatie
Fig. 1 geeft een schematisch diagram van de IgY-extractie procedure (zie tabel 2). Het protocol werd voor het eerst beschreven in Polson et al.. 1980.
Alle stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van latex handschoenen.
- De eierschaal is zorgvuldig gebarsten en de dooier is overgebracht naar een "dooier lepel" om te verwijderen zo veel eiwit als mogelijk.
- De dooier is overgebracht naar een filtreerpapier en rolde om de resterende eiwit te verwijderen, dan is de dooier huid wordt gesneden met een lancet of een soortgelijk instrument (pipetpunt). De dooier is gegoten in een 50 ml buis en het ei volume is geregistreerd (V1).
- Tweemaal de eidooier volume van de PBS wordt gemengd met de dooier (ΣV1 + V2), daarna 3,5% PEG 6000 (in gram, fijngemaakt) van het totale volume wordt toegevoegd en gevortexed, gevolgd door 10 min rollen over een voortschrijdende mixer. Die stap van de extractie procedure scheidt de suspensie in twee fasen. Een fase bestaat uit "dooier vaste stoffen en vetachtige stoffen '(oorspronkelijke offerte van Polson et al.. 1980) en een waterige fase die IgY en andere eiwitten.
- De buizen worden gecentrifugeerd bij 4 ° C gedurende 20 min (10.000 rpm volgens de 13.000 xg, Heraeus Multifuge 3SR +, vaste hoek rotor). Het supernatant (V3) is gegoten door een vouwfilter en overgebracht naar een nieuwe buis.
- 8,5% PEG 6000 in gram (berekend volgens de nieuwe volume) worden toegevoegd aan de buis, gevortexed en rolde over een voortschrijdende mixer zoals in stap 3.
- Herhaal stap 4 met het verschil dat het supernatans verwijderd.
- De pellet wordt zorgvuldig opgelost in 1 ml PBS door middel van een glazen stick en de vortexer. PBS wordt toegevoegd aan een eindvolume van 10 ml (V4). De oplossing wordt gemengd met 12% PEG 6000 (w / v, 1,2 gram) en behandeld als in stap 3 (vortex, rollen mixer).
- Herhaal stap 6 en los de pellet zorgvuldig in 800 ui PBS (glas-stick en vortex). Wacht tot de luchtbellen te laten verdwijnen en vervolgens (pipet) over te dragen van het extract aan een dialyse capsule. Spoel de buis met 400 ul PBS en voeg het volume aan de dialyse-apparaat (V5). (Voor de bereiding van de dialyse-apparaten en membranen zie bijlage.)
- Het extract wordt gedialyseerd 's nachts in 0,1% zoutoplossing (1600 ml) en voorzichtig geroerd door middel van een magnetische roerder. De volgende ochtend is het zout vervangen door PBS gedialyseerd en nog eens drie uur.
- Daarna wordt de IgY-extract wordt getrokken uit de dialyse capsule met een pipet en overgebracht naar 2ml buizen. Het uiteindelijke volume is ongeveer 2 ml (V6).
- Het eiwit gehalte (mg / ml) van de monsters wordt fotometrisch gemeten bij 280 nm (1:50 verdund met PBS) en berekend op basis van de Lambert-Beer wet met een extinctiecoëfficiënt van 1,33 voor IgY (zie Fig. 2), Fig . 4 toont de kwaliteit van het preparaat (zuiverheid en herstel zijn ongeveer 80%).
- Het is raadzaam om de monsters te slaan in porties bij -20 ° C (niet de monsters te bevriezen bij -70 ° C).
- De kwaliteit van de laatste voorbereidingen wordt geanalyseerd door eenvoudige SDS-PAGE, zoals beschreven in Jupiter protocol http:/www.jove.com/details.php?id=1916
2. Appendix-voor gebruik van de dialyse zak moet worden voorbereid op de volgende manier volgens de aanbevelingen van de fabrikant:
- 20 dialyse zakken worden gesneden in stukken van 30 cm en gegeven in een 2000 ml bekerglas.
- 1750 ml van een 5 mM EDTA-oplossing worden toegevoegd.
- Een glazen trechter wordt geplaatst boven de zakken om ervoor te zorgen dat de zakken worden gedekt door de EDTA-oplossing. De oplossing wordt verwarmd en gekookt voor de 5 min (hete plaat). De oplossing is gedecanteerd en de zakken zijn drie keer gewassen met gedestilleerd water.
- Nogmaals 1750 ml EDTA-oplossing worden toegevoegd, gekookt voor 5 min en drie keer gewassen met gedestilleerd water, zoals hierboven.
- Tenslotte is de dialyse zakken worden gekookt gedurende 10 minuten in gedestilleerd water en opgeslagen bij 4 ° C. Haal de dialyse zakken door middel van gesteriliseerde pincet.
3. Representatieve resultaten
Figuur 1. Schematische weergave van IgY-extractie met behulp van polyethyleenglycol neerslag volgens de oorspronkelijke beschrijving van Polson et al.. 1980. Om een grotere afbeelding te bekijken klik hier.
Figuur 2. Ontwikkeling van het totaal-IgY in eigeel van geïmmuniseerde kippen in afhankelijkheid van leeftijd. Gegeven is het wekelijks gemiddelde van het totaal IgY / ei-en SD (n = 4 legkippen). Van [Pauly et al.. 2009]).
Figuur 3. Laying capaciteit monitoring van vier kippen geïmmuniseerd met verschillende antigenen. De pijlen geven immunisatie datum (van [Pauly et al.. 2009]). Om een groter beeld klik hier te bekijken.
Figuur 4. Polyacrylamide-gelelektroforese van de individuele IgY de voorbereidingen van de verschillende eieren onder reducerende omstandigheden
Lane 1 - Moleculair gewicht marker, Lane 2 - IgY-standaard, Lane 3-5 - verschillende IgY monsters bereid zoals beschreven in het protocol. Dit zijn de laatste voorbereidingen op basis van 10 van het protocol stap. HC - zware ketens, LC - lichte kettingen,? - Kleine onzuiverheden die overeenkomt met moleculair gewicht rond de 35 kDa (waarschijnlijk de C-terminale fragment van vitellogenine II precursor, [Klimentzou et al., 2006.]).
| Kip 21 (Antigen A) | Kip 22 (Antigen A) | Kip 19 (Antigen B) | Kip 23 (Antigen C) | |
| Ei nummer (totaal IgY) 1, 2-jaar periode van | 625 (38 g) | 626 (38 g) | 545 (33 g) | 608 (37 g) |
| Ei nummer (totaal IgY), eerste jaar | 345 (20 g) | 304 (16 g) | 326 (18 g) | 308 (17 g) |
| Ei nummer (totaal IgY), tweede jaar | 280 (18 g) | 322 (21 g) | 219 (15 g) | 300 (20 g) |
| % Van Max. mogelijk ei nummer (eerste jaar) 2 | 106 | 93 | 100 | 95 |
| % Van Max. mogelijk ei nummer (tweede jaar) | 86 | 99 | 67 | 92 |
| aantal verwerkte eieren | 565 | 620 | 283 | 401 |
1 Het bedrag van de totale IgY wordt berekend door vermenigvuldiging van het aantal eieren met een gemiddelde waarde van 60 mg eiwit per ei volgens de gegevens van figuur 2.
2 De max.. mogelijk ei aantal per jaar is 325 volgens een informatie van de fokker.
Tabel 1. Twee jaar statistieken van eieren leggen capaciteit van kippen geïmmuniseerd met verschillende antigenen. Leggen capaciteit in procent van het maximum van vier kippen na immunisatie met verschillende antigenen evenals de IgY-resultaat gedurende twee jaar (zie ook Fig. 3), [Pauly et al.. 2009]).
| Ei Nr. | Hen Nr. Legdatum | V1 [ml] dooier | V2 [ml] PBS | 1. PEG prec. [G] | Vol [ml] na | 2. PEG prec. [G] | Pellet | 3. PEG prec. [G] | Pellet | Vol [ml] | Totaal eiwit mg / ml | Gecorrigeerd totaal eiwit mg / ml |
| 2xV1 ΣV1 + V2 | 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 | prec., centrif. en filtratie V3 | 8,5% [w / v] V3 | opgelost in ml PBS V4 | 12% [w / v] V4 | Opgelost in ml PBS V5 | Na dialyse tegen PBS V6 | A280/ml | A280/ml: 1,33 | |||
| 1 | H293 / 22,10. | 15 | 30 45 | 1.58 | 31 | 2.63 | 10 | 1.2 | 1.2 | 1.7 | 35,0 | 26,3 |
| 2 | H293 / 23,10. | 13 | 26 39 | 1.37 | 25 | 2.12 | 10 | 1.2 | 1.2 | 1.7 | 28,8 | 21,6 |
Tabel 2. Voorbeeldig protocol van PEG neerslag
Discussion
De keuze van een geschikte IgY zuiveringsmethode wordt beïnvloed door de omvang van de zuivering (laboratorium of industriële), kosteneffectiviteit, technologie (laboratoriumuitrusting), en de impact op het milieu (afvalbeheer). Verschillende IgY extractiemethoden werden beoordeeld in detail door De Meulenaer & Huyghebaert (2001, voor nazicht zie ook Schade et al.. 2005). In het algemeen kunnen deze methoden worden verdeeld in drie hoofdgroepen:
- Neerslag methoden: het betrekken van ammonium-of natriumsulfaat, polyethyleenglycol (PEG), caprylzuur en caragenean.
- Chromatografische methoden: affiniteitschromatografie, ionenuitwisselingschromatografie, hydrofobe interactie chromatografie, thiophylic interactie chromatografie, en gel-filtratie chromatografie.
- Ultrafiltratie.
De zuiverheid van een IgY preparaat kan worden verhoogd door een combinatie van methoden, bijvoorbeeld PEG precipitatie kan worden gecombineerd met affiniteitschromatografie. In sommige gevallen, afhankelijk van de uiteindelijke toepassing, een water-extract van IgY is voldoende om goede resultaten (Akita & Nakai 1993) te bereiken. Volgens onze ervaring, de IgY-sample we verkrijgen door PEG-precipitatie werkte heel goed in een heleboel verschillende immunologische assays. Door het standaardiseren van de PEG-precipitatie methode een technisch assistent is in staat om ongeveer 84 eieren per week, wat overeenkomt met een bedrag van in totaal IgY tussen de 4 en 7 g per week verwerken. Een eenvoudige berekening: Een leghen is geïmmuniseerd met een antigeen. Na een paar boost vaccinaties de kip produceert specifieke antilichamen (Ab) met een titer van 1:50.000 gedurende een periode van 30 dagen. 30 eieren x 2 ml IgY extract (zie protocol en Fig. 3) komt overeen met 60 ml totaal IgY, die op zijn beurt overeen met een Ab-verdunning van 3.000 l (de capaciteit van een emmer is 10 l), dat betekent met 3.000 l van Ab-oplossing 300 emmers gevuld kan worden. Dus, in het licht van zulke enorme Ab-kwantiteit is het geen probleem om een Ab-pool van constante kwaliteit en specificiteit op te slaan. Deze techniek vermindert de lading / veel variatie anders waargenomen in polyspecifieke Ab.
Ondanks het aspect van de kwantiteit, IgY Ab verdere voordelen ten opzichte van zoogdieren IgG: Geen activatie van zoogdieren complement systeem, geen cross-reactiviteit met HAMA (humane anti-muis antilichaam), reumatoïde factoren of menselijk bloedgroepantigenen (gebrek aan heteroagglutinins).
Een uitstekende voordeel van IgY-Ab is de zogenaamde fylogenetische afstand. Fylogenetische afstand is de reden voor de vaak beschreven verschillen tussen de Ab specifieke kenmerken van zoogdieren en kippen, zelfs als identiek geïmmuniseerd. In aanvulling op de verschillen tussen de zoogdieren en de vogels immuunsysteem zich, verschillen in de fylogenetische ontwikkeling in deze twee klassen van dieren draagt bij aan de verschillende Ab specificiteiten. Verschillende auteurs hebben gemeld dat kippen vaak Abs produceren tegen fylogenetisch zeer goed geconserveerd zoogdier-eiwitten of peptiden efficiënter doen dan konijnen (voor review zie Schade et a. 2005). Als gevolg daarvan kan een antigeen geconserveerd blijven "gemaskeerd" om het konijn immuunsysteem, en dus leiden tot slechts een zwak of een "stille" reactie. Bovendien, als kippen en konijnen zijn geïmmuniseerd met dezelfde zoogdieren antigeen, heel vaak de kippen reageren met een Ab-specificiteit die zelden kan worden bereikt bij konijnen. Ook het aspect van dierenwelzijn is belangrijk omdat de Ab zijn niet-invasief uit eidooier. In combinatie met Gene-Gun (plasmide) immunisatie van de IgY-productie is volledig niet-invasief (Witkowski et al.. 2009).
Kortom, de productie van Ab in kippen en de IgY-extractie met behulp van PEG-precipitatie is zeer kosten-effectief en resulteert in een zeer specifieke Ab met een stabiele titers tot 1:1.000.000. Als gevolg van de fylogenetische afstand tussen de Aves en Mammalia, kip zijn in staat om specifieke Ab tegen sterk geconserveerd bij zoogdieren antigenen te produceren in tegenstelling tot bijvoorbeeld konijnen. De buitengewone hoeveelheid Ab verkregen door IgY-technologie opent de deur ook voor het gebruik van IgY-Ab in mens-en diergeneeskunde voor therapeutische / profylactische doeleinden.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlijn (H 0069/03) in te stellen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (Project BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und ik dentifizierung von bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Wij danken B. Diemar (Charite-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie) voor een uitstekende technische ondersteuning.
Materials
|
References
- Akita, E. M., Nakai, S. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain. J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).
- De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review. Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).
- Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27, 183-193 (2006).
- Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period. Poultry Science. 88, 281-290 (2009).
- Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens. Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).
- Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology. , Springer. Berlin. (2001).
- Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).
- Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies. J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).
