Summary
Ce protocole décrit notamment l'extraction de IgY totales du jaune d'oeuf par précipitation de polyéthylène glycol et donne des informations générales sur la technologie IgY.
Abstract
Les poules peuvent être immunisés par la vaccination au moyen d'im (Musculus pectoralis, gauche et droite, le volume d'injection 0,5-1,0 ml) ou par l'intermédiaire de Gene-Gun plasmide-immunisation. Charge sur l'immunogénicité de l'antigène, d'anticorps de haute-titres (jusqu'à 1:100.000 - 1:1,000,000) peuvent être obtenus après seulement une ou 3 - 4 immunisations stimuler. Normalement, une poule pond des oeufs en continu pendant environ 72 semaines, par la suite la capacité diminue de pose. Ce protocole décrit l'extraction des IgY totale de jaune d'œuf par le biais d'une procédure de précipitations (PEG. Polson et al. 1980). La méthode comporte deux étapes importantes. Le premier est l'élimination des lipides et la seconde est la précipitation de l'IgY totale à partir du surnageant de la première étape. Après dialyse contre un tampon (PBS normalement) l'AGI-extrait peut être conservé à -20 ° C pendant plus d'un an. La pureté de l'extrait est d'environ 80%, le total des IgY par oeuf varie de 40-80 mg, dépendant de l'âge de la poule pondeuse. Les augmentations de la teneur totale en IgY avec l'âge de la poule d'environ 40 mg / oeuf jusqu'à 80 mg / oeuf (concernant le PEG précipitations). La capacité de ponte d'une poule par an est d'environ 325 œufs. Cela signifie une récolte totale potentielle de 20 g au total IgY / an basé sur un contenu IgY moyenne de 60 mg d'œuf IgY / total (voir tableau 1).
Protocol
1. Protocole - IgY extraction au moyen de PEG-précipitation
Fig. 1 donne le schéma de la procédure d'IgY-extraction (voir tableau 2). Le protocole a été décrit pour la première à Polson et al. 1980.
Toutes les mesures doivent être effectuées en utilisant des gants en latex.
- La coquille est soigneusement fissuré et le jaune est transférée à une "cuillère jaune" afin d'éliminer autant que l'œuf blanc que possible.
- Le jaune est transféré à un papier filtre et roulé pour enlever les blancs d'œufs, puis la peau jaune est coupé avec une lancette ou un instrument similaire (pipette). Le jaune est versé dans un tube de 50 ml et le volume d'oeuf est enregistré (V1).
- Deux fois le volume de PBS jaune d'œuf est mélangé avec le jaune (ΣV1 + V2), puis de 3,5% de PEG 6000 (en gramme, pulvérisé) du volume total est ajouté et vortexés, suivies de 10 min roulant sur une table de mixage roulant. Cette étape de la procédure d'extraction sépare la suspension en deux phases. Une phase se compose de «solides jaune et corps gras» (citation originale de Polson et al. 1980) et une phase aqueuse contenant des protéines IgY et autres.
- Les tubes sont centrifugés à 4 ° C pendant 20 min (10.000 rpm en fonction de 13 000 xg, Heraeus Multifuge 3SR +, rotor à angle fixe). Le surnageant (V3) est versé à travers un filtre plissé et transféré dans un nouveau tube.
- PEG 6000 de 8,5% en gramme (calculés selon le nouveau volume) sont ajoutés au tube, vortex et roulé sur une table de mixage rouler comme à l'étape 3.
- Répétez l'étape 4 à la différence que le surnageant est éliminé.
- Le culot est soigneusement dissous dans 1 ml de PBS à l'aide d'un bâton de verre et le Vortexer. PBS est ajouté à un volume final de 10 ml (V4). La solution est mélangée avec le PEG 6000 12% (p / v, 1,2 gramme) et traitée comme dans l'étape 3 (vortex, mélangeur de roulement).
- Répétez l'étape 6 et dissoudre l'extrait soigneusement dans 800 ul de PBS (bâton de verre et de vortex). Attendre que les bulles d'air disparaissent, puis transfert (pipette) de l'extrait d'une capsule de dialyse. Rincer le tube avec 400 ul de PBS et ajouter du volume à l'appareil de dialyse (V5). (Pour la préparation d'appareils de dialyse et les membranes voir annexe).
- L'extrait est dialysé pendant la nuit dans une solution saline à 0,1% (1600 ml) et agite doucement à l'aide d'un agitateur magnétique. Le lendemain matin, la saline est remplacé par du PBS et dialysée pendant encore trois heures.
- Par la suite, l'AGI-extrait est tiré de la capsule de dialyse par une pipette et transférées dans des tubes de 2ml. Le volume final est d'environ 2 ml (V6).
- La teneur en protéines (mg / mL) des échantillons est mesurée par photométrie à 280 nm (1:50 diluée avec du PBS) et calculé conformément à la loi de Lambert-Beer avec un coefficient d'extinction de 1,33 pour IgY (voir Fig. 2), figure . 4 montre la qualité de la préparation (pureté et de récupération sont environ 80%).
- Il est conseillé de stocker les échantillons dans des aliquotes à -20 ° C (ne pas congeler les échantillons à -70 ° C).
- La qualité de la préparation finale est analysé par SDS-PAGE simples tel que décrit dans le protocole JoVE http:/www.jove.com/details.php?id=1916
2. Annexe avant d'utiliser le sac de dialyse doit être préparé de la manière suivante selon les recommandations du fabricant:
- 20 sacs de dialyse sont découpés en morceaux de 30 cm et donnée dans un bécher de 2000 ml en verre.
- 1750 ml d'une 5 mM EDTA solution sont ajoutés.
- Un entonnoir en verre est placée au-dessus des sacs pour s'assurer que les sacs sont couverts par la solution d'EDTA. La solution est chauffée et bouillir pendant 5 min (plaque chauffante). La solution est décantée et les sacs sont lavées trois fois avec de l'eau distillée.
- Encore une fois 1750 ml d'EDTA-solution sont ajoutés, bouillir pendant 5 min et lavées trois fois avec de l'eau distillée comme ci-dessus.
- Enfin, les sacs de dialyse sont bouillis pendant 10 min dans de l'eau distillée et conservés à 4 ° C. Sortez les sacs de dialyse à l'aide d'une pince à épiler stérilisée.
3. Les résultats représentatifs
Figure 1. Schéma de principe d'IgY-extraction au moyen de la précipitation de polyéthylène glycol selon la description originale de Polson et al. 1980. Pour afficher une image plus grande cliquez ici.
Figure 2. Développement du total-IgY de jaune d'oeuf de poules immunisées dans la dépendance de l'âge. Compte tenu de la moyenne hebdomadaire du total des IgY / œuf et SD (n = 4 poules pondeuses). De [Pauly et al. 2009]).
Figure 3. Layicapacité de suivi de quatre poules ng immunisées avec des antigènes différents. Les flèches indiquent la date de vaccination (d'après [Pauly et al. 2009]). Pour afficher une image plus grande cliquez ici.
Figure 4. Polyacrylamide-électrophorèse en gel de préparations IgY individuels à partir d'œufs différents dans des conditions réductrices
Voie 1 - marqueur de poids moléculaire, la voie 2 - IgY standard, Lane 3-5 - échantillons différents IgY préparé comme décrit dans le protocole. Ce sont les derniers préparatifs en fonction de l'étape 10 du protocole. HC - chaînes lourdes, LC - chaines lumière,? - Impuretés mineures correspondant à poids moléculaire d'environ 35 kDa (probablement le fragment C-terminal de la vitellogénine II précurseur, [Klimentzou et al, 2006.]).
| Poulet 21 (antigène A) | Poulet 22 (antigène A) | Poulet 19 (B Antigen) | Poulet 23 (C Antigen) | |
| Nombre d'œufs (IgY total) 1, 2 ans la période | 625 (38 g) | 626 (38 g) | 545 (33 g) | 608 (37 g) |
| Nombre d'œufs (IgY total), la première année | 345 (20 g) | 304 (16 g) | 326 (18 g) | 308 (17 g) |
| Nombre d'œufs (IgY total), deuxième année | 280 (18 g) | 322 (21 g) | 219 (15 g) | 300 (20 g) |
| % Du max. nombre d'œufs possible (première année) 2 | 106 | 93 | 100 | 95 |
| % Du max. nombre d'œufs possible (deuxième année) | 86 | 99 | 67 | 92 |
| nombre d'œufs transformés | 565 | 620 | 283 | 401 |
1 Le montant de IgY total est calculé en multipliant le nombre d'oeufs par une valeur moyenne de 60 mg de protéine par oeuf, selon les données de la figure 2.
Les deux max. nombre d'œufs possibles par an est de 325 selon une information de l'éleveur.
Tableau 1. Deux statistiques des années de la capacité de ponte des poules immunisées avec des antigènes différents. Pose des capacités en pour cent du maximum de quatre poules après immunisation avec des antigènes différents ainsi que l'AGI-résultat pendant deux ans (voir aussi Fig. 3), [Pauly et al. 2009]).
| Egg Nr. | Nr. poule. Date de ponte | V1 [ml] jaune | V2 [ml] de PBS | 1. PEG prec. [G] | Vol [ml] après | 2. PEG prec. [G] | Boulette | 3. PEG prec. [G] | Boulette | Vol [ml] | Protéines totales mg / ml | Corrigé des protéines totales mg / ml |
| 2xV1 ΣV1 + V2 | 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 | prec. CENTRIFUGE. filtration et V3 | 8,5% [w / v] V3 | dissous dans du PBS ml V4 | 12% [w / v] V4 | Dissous dans ml de PBS V5 | Après dialyse contre du PBS V6 | A280/ml | A280/ml: 1,33 | |||
| 1 | H293 / 22,10. | 15 | 30 45 | 1,58 | 31 | 2,63 | 10 | 1.2 | 1.2 | 1.7 | 35,0 | 26,3 |
| 2 | H293 / 23,10. | 13 | 26 39 | 1,37 | 25 | 2,12 | 10 | 1.2 | 1.2 | 1.7 | 28,8 | 21,6 |
Tableau 2. Protocole exemples de PEG précipitations
Discussion
Le choix d'une méthode de purification IgY approprié est influencée par l'échelle de la purification (laboratoire ou industrielle), la rentabilité, de la technologie (matériel de laboratoire), et l'impact sur l'environnement (gestion des déchets). Diverses méthodes d'extraction ont été IgY examiné en détail par De Meulenaer & Huyghebaert (2001, pour revue, voir aussi Schade et al. 2005). En général, ces méthodes peuvent être divisés en trois groupes principaux:
- Méthodes de précipitation: l'implication de sulfate d'ammonium ou de sodium, polyéthylène glycol (PEG), l'acide caprylique et caragenean.
- Les méthodes chromatographiques: chromatographie d'affinité, chromatographie échangeuse d'ions, chromatographie d'interaction hydrophobe, la chromatographie d'interaction thiophylic, et de filtration sur gel de chromatographie.
- L'ultrafiltration.
La pureté d'une préparation IgY peut être augmentée par une combinaison de méthodes, par exemple, le PEG précipitations peuvent être combinés avec la chromatographie d'affinité. Dans certains cas, selon l'application finale, un extrait d'eau de IgY est suffisante pour obtenir de bons résultats (Akita & Nakai, 1993). Selon notre expérience, l'AGI-échantillon, nous obtenons par PEG-précipitation a très bien fonctionné dans beaucoup de différents dosages immunologiques. En standardisant la méthode de précipitation PEG-un assistant technique est capable de traiter environ 84 œufs par semaine, ce qui correspond à un montant de IgY totales entre 4 et 7 g par semaine. Un simple calcul: une poule pondeuse est immunisé avec un antigène. Après une vaccination stimuler la poule quelques produit des anticorps spécifiques (Ab) avec un titre de 1:50,000 pendant une période de 30 jours. 30 œufs x 2 ml d'extrait IgY (voir protocole et Fig. 3) correspond à 60 ml IgY total, qui à son tour correspond à une dilution de Ab-3000 l (la capacité d'un seau est de 10 l), ce qui signifie avec 3.000 l de la solution AB 300 seaux peuvent être remplies. Ainsi, en vue d'une telle quantité énorme Ab-il pas un problème pour stocker une Ab-bassin de qualité constante et de spécificité. Cette technique réduit la variabilité de charge / lot contraire observé dans polyspécifique Ab.
Malgré l'aspect quantitatif, IgY Ab ont d'autres avantages par rapport aux IgG des mammifères: Pas d'activation du système du complément chez les mammifères, aucune réactivité croisée avec HAMA (anticorps humain anti-souris), les facteurs rhumatoïdes ou humaine antigènes de groupe sanguin (manque de heteroagglutinins).
Un avantage remarquable de IgY-Ab est la distance phylogénétique dits. Distance phylogénétique est la raison pour laquelle les différences entre les décrit souvent les spécificités Ab des mammifères et des poules, même lorsque l'identique vaccinés. En plus de différences entre les mammifères et le système immunitaire aviaire eux-mêmes, les différences dans le développement phylogénétique de ces deux classes d'animaux contribue aux spécificités différentes Ab. Plusieurs auteurs ont rapporté que les poulets produisent souvent Abs contre phylogénétiquement très conservées des protéines de mammifères ou des peptides plus efficacement que ne le lapin (pour revue, voir Schade et a. 2005). En conséquence, un antigène conservé peut rester "masqués" pour le système de lapin immunitaire, et provoquer ainsi qu'une faiblesse ou un "silence" de réponse. Par ailleurs, si les poulets et les lapins sont immunisés avec le même antigène de mammifères, très souvent les poulets répondre avec un Ab-spécificité qui peut rarement être obtenue chez le lapin. Aussi l'aspect de bien-être animal est important puisque les Ab sont non invasive extrait de jaune d'oeuf. En combinaison avec Gene-Gun (plasmide) vaccination de l'IgY-production est totalement non-invasive (Witkowski et al. 2009).
En conclusion, la production d'Ab dans les poules et les IgY extraction au moyen de PEG-précipitation est très rentable et les résultats dans Ab très spécifique avec des titres stables jusqu'à 1:1,000,000. En raison de la distance phylogénétique entre Aves et Mammalia, de poulet sont capables de produire Ab spécifiques contre les antigènes hautement conservée chez les mammifères, contrairement aux lapins par exemple. La quantité extraordinaire d'Ab obtenus par IgY technologie ouvre la porte aussi à l'aide IgY-Ab dans la médecine humaine et vétérinaire à des fins thérapeutiques / prophylactiques.
Disclosures
Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements stipulés par Landesamt für Gesundheit und Soziales de Berlin (H 0069/03).
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention du ministère fédéral allemand de l'Education et la Recherche (Projet BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und von j'ai dentifizierung bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Nous remercions B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie) pour l'assistance technique excellente.
Materials
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References
- Akita, E. M., Nakai, S. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain. J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).
- De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review. Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).
- Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27, 183-193 (2006).
- Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period. Poultry Science. 88, 281-290 (2009).
- Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens. Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).
- Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology. , Springer. Berlin. (2001).
- Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).
- Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies. J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).
