Summary
이 프로토콜은 폴리에틸렌 글리콜 석출에 의해 난황에서 총 IgY의 특정 추출에 대해 설명하고 IgY 기술에 대한 일반적인 정보를 제공합니다.
Abstract
암탉은 메신저 예방 접종 (Musculus pectoralis, 왼쪽 및 오른쪽, 사출 볼륨 0.5-1.0 ML)를 통해 또는 유전자 건 플라스미드 - 예방 접종에 의해 예방 접종을하실 수 있습니다. 항원의 immunogenicity에 따라, 높은 항체 - titres은 (최대 1:100,000 - 1:1,000,000) 하나 또는 3 이후 얻을 수 - 4 부스트 예방 접종을. 일반적으로, 암탉은 이후 누워 용량 감소에 대한 72주 끊임없이 알을 낳는. 이 프로토콜은 침전 절차 수단 (PEG. 폴손 외. 1980)로 달걀 노른자에서 총 IgY의 추출을 설명합니다. 방법은 두 가지 중요한 단계를 포함한다. 첫번째는 lipids의 제거이고 두 번째 단계 중 하나 뜨는에서 총 IgY의 강수량입니다. 버퍼 (일반적으로 PBS)에 대한 투석 후 IgY - 추출물은 년 이상 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 추출물의 순도는 80 % 근처이고, 계란 당 총 IgY가 누워있는 암탉의 연령에 따라, 40-80 MG에서 다릅니다. 최대 80 MG / 계란 (PEG 침전에 관한)에 40 MG / 계란에서 암탉의 나이가 총 IgY 콘텐츠 증가합니다. 연간 암탉의 누워있는 용량은 325 계란 주위에있다. 60 MG 총 IgY / 계란 (표 1 참조)의 의미 IgY의 콘텐츠를 기반으로 20g 총 IgY / 올해의 총 잠재 수확을 의미합니다.
Protocol
1. 프로토콜 - PEG - 강수량에 의해 IgY - 추출
그림. 1 IgY - 적출 수술의 구조 다이어그램을 (표 2 참조) 있습니다. 프로토콜이 처음 폴손 외에 설명되어되었습니다. 1980.
모든 단계 라텍스 장갑을 사용하여 수행되어야합니다.
- 달걀 껍질은 신중하게 금이되고 노른자는 가능한 한 많은 흰 계란으로 제거하기 위해 '노른자 스푼 "으로 전송됩니다.
- 난황이 필터 종이로 전송하고 나머지 흰자위를 제거하는 압연입니다 노른자 피부는 첨두 또는 이와 유사한 악기 (피펫 팁)으로자를 수 있습니다. 난황은 50 ML 관에 부어 있으며, 계란 볼륨 (V1) 등록되어 있습니다.
- 두 번 PBS의 계란 노른자 볼륨이 전체 볼륨의 노른자 (ΣV1 + V2), 이후 3.5 %의 PEG 6000 (g에 박살 나자)와 혼합이 추가되고 vortexed 10 분 롤링 믹서에서 굴러옵니다. 추출 절차의 단계는 두 단계의 현탁액을 분리합니다. 한 단계는 "노른자의 고체 및 지방산 물질"(폴손 외의 원래 견적. 1980)과 IgY 및 기타 단백질을 포함하는 물의 단계로 구성되어 있습니다.
- 튜브는 4 centrifuged 아르 ° 20 분 (10,000 RPM 13,000 XG, Heraeus Multifuge 3SR + 고정 앵글 로터에 따라)를위한 C. 뜨는 (V3)이 접혀 필터를 통해 부어 새로운 튜브로 전송됩니다.
- g (새 볼륨에 따라 계산)에 8.5 %의 PEG 6000은 튜브에 추가 vortexed과 스텝 3에서와 같이 회전 믹서에 압연 있습니다.
- 뜨는이 삭제되는 차이와 4 단계를 반복합니다.
- 펠렛은 신중하게 유리 막대와 vortexer에 의해 한 ML PBS에 용해됩니다. PBS 10 ML의 최종 볼륨 (V4)에 추가됩니다. 솔루션은 12 % PEG 6000 (W / V, 1.2 g)과 혼합하여 3 단계 (와동, 압연 믹서)와 같이 취급됩니다.
- 6 단계를 반복하여 800 μl PBS에 신중 펠렛을 (유리 막대와 와동) 디졸브. 사라지고 다음 투석 캡슐을 (피펫) 추출을 전송하기 위해 공기 방울 나올 때까지 기다리는 것이 좋습니다. 400 μl PBS로 튜브를 씻어 투석 장치 (V5)에 볼륨을 추가합니다. (투석 장치와 점막의 준비에 대한 부록을 참조하십시오.)
- 추출물은 0.1 %의 염분 (1,600 ML)에서 밤새도록 dialysed 부드럽게 자기 활동가에 의해 흔들 수 있습니다. 다음 아침, 호수는 PBS로 대체하여 다른 세 시간 동안 dialysed입니다.
- 이후 IgY - 추출물은 피펫으로 투석 캡슐에서 가져온 및 2ml 튜브로 전송됩니다. 최종 볼륨은 2 ML (V6) 주변이다.
- 샘플의 단백질 함량 (MG / ML)을 (그림을 참조하십시오. 2) 280 NM (PBS에 희석 1시 50분)에 photometrically 측정과 IgY에 대한 1.33의 흡광 계수와 램버트 - 비어 법칙에 따라 계산, 그림 . 4 준비의 품질 (순도 및 복구가 80 % 정도된다)를 보여줍니다.
- 그것은 ° C (-70 ° C에서 샘플을 동결하지 않음) -20에서 aliquots에 샘플을 저장하는 것이 좋습니다.
- 최종 준비의 품질로 조브 프로토콜에 설명된 간단한 SDS - PAGE로 분석됩니다 http:/www.jove.com/details.php?id=1916
2. 부록 - 전에 투석 가방이 제조 업체의 권장 사항에 따라 다음과 같은 방법으로 준비를해야합니다 사용 :
- 20 투석 가방은 30cm의 조각으로 절단하고 2000 ML 유리 비커에 부여됩니다.
- 5 MM - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 1750 ML이 추가됩니다.
- 유리 깔때기는 가방은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션이 적용되는 것을 보장하기 위해 가방 위에 배치됩니다. 솔루션은 온수와 5 분 (철판)에 삶은입니다. 솔루션은 decanted되고 가방은 증류수로 세 번 씻어 있습니다.
- 다시 한번 1750 ML - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션은 추가 5 분 삶은 이상과 같은 증류수로 세 번 씻어 있습니다.
- 마지막으로 투석 가방은 증류수에서 10 분 끓인 4에 저장됩니다 ° C. 멸균 핀셋 통해 투석 가방을 가져가라.
3. 대표 결과
그림 1. 폴손 외의 원래 설명에 따라 폴리에틸렌 글리콜 석출에 의해 IgY - 추출의 도식 다이어그램. 1980. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 시대의 의존에서 예방 접종을 암탉의 계란 노른자에서 총 - IgY 개발. 총 IgY / 계란 및 SD (N = 4 누워있는 암탉)의 주간 의미는 주어진. [폴리 외. 2009]에서).
그림 3. Layi다른 항원과 예방 접종을 사 암탉의 NG 용량 모니터링. 화살표는 예방 접종 날짜를 ([폴리 외. 2009]에서)을 나타냅니다. 여기 큰 이미지를 클릭 볼 수 있습니다.
그림 4. 조건을 감소에 따라 다른 계란에서 개별 IgY의 준비 Polyacrylamide - Gelelectrophoresis
레인 1 - 분자량 마커, 레인 2 - IgY 표준, 레인 3-5 - 프로토콜에서 설명한대로 다른 IgY 샘플 준비. 이것은 프로토콜의 10 단계에 따라 최종 준비하고 있습니다. HC - 무거운 체인, LC - 라이트 chaines? - 35 KDA (아마도 vitellogenin II 전구체의 C - 말단 조각, [. Klimentzou 외, 2006]) 주변의 분자량에 해당하는 경미한 불순물.
| 치킨 21 (항원) | 치킨 22 일 (항원) | 치킨 19 일 (항원 B) | 치킨 23 조 (항원 C) | |
| 에그 번호 (총 IgY) 1, 2 년 기간 | 625 (38 G) | 626 (38 G) | 545 (33 G) | 608 (37 G) |
| 에그 번호 (총 IgY), 첫해 | 345 (20 G) | 304 (16g) | 326 (18 G) | 308 (17 G) |
| 에그 번호 (총 IgY), 두번째 년 | 280 (18 G) | 322 (21 G) | 219 (15 G) | 300 (20g) |
| 최대의 %. 가능한 계란 번호 (첫 해에) 2 | 106 | 93 | 100 | 95 |
| 최대의 %. 가능한 계란 번호 (두 번째 년) | 86 | 99 | 67 | 92 |
| 가공 계란의 수를 | 565 | 620 | 283 | 401 |
총 IgY 1 금액은 그림 2의 데이터에 따라 계란 60 MG 단백질의 의미 값으로 달걀의 개수를 곱하여 계산됩니다.
2 최대. 연간 가능한 달걀 번호는 개종의 정보에 따라 325입니다.
표 1. 다른 항원과 예방 접종을 닭이 계란 누워있는 용량을 2 년 통계. (그림도 참조하십시오. 3) 2 년 동안 서로 다른 항원뿐만 아니라 IgY - 결과와 예방 접종 후 네 암탉의 최대 비율의 용량을 누워, [폴리 외. 2009]).
| 에그 넘버. | 헨 넘버. 날짜 누워 | V1 [ML] 난황 | V2 [ML] PBS | 1. PEG prec. [G] | 권 [ML] 후 | 2. PEG prec. [G] | 작은 공 | 3. PEG prec. [G] | 작은 공 | 권 [ML] | 총 단백질 MG / ML | 수정된 총 단백질 MG / ML |
| 2xV1 ΣV1가 + V2 | 3,5 % [W / V] ΣV1 + V2 | prec., centrif. 및 여과 V3 | 8,5 % [W / V] V3 | V4 ML PBS에 용해 | 12% [W / V] V4 | ML PBS V5에 녹아있는 | PBS V6에 대한 투석 후 | A280/ml | A280/ml : 1.33 | |||
| 1 | H293 / 22.10. | 15 | 30 45 | 1.58 | 31 | 2.63 | 10 | 1.2 | 1.2 | 1.7 | 35.0 | 26.3 |
| 2 | H293 / 23.10. | 13 | 26 39 | 1.37 | 25 | 2.12 | 10 | 1.2 | 1.2 | 1.7 | 28.8 | 21.6 |
표 2. PEG 침전의 전형적인 프로토콜
Discussion
적당한 IgY 정화 방법의 선택은 정화 (연구소 또는 산업), 비용 효율성, 기술 (실험실 장비)와 환경 (폐기물 관리)에 영향을 미치는 규모에 의해 영향을받습니다. 다양한 IgY 추출 방법은 데 Meulenaer & Huyghebaert (2001, 검토도 쉐이드 외를 참조하십시오. 2005)에 의해 상세하게 검토했다. 일반적으로 이러한 방법의 세 주요 그룹으로 나눌 수 있습니다 :
- 강수량 방법 : 암모니아 또는 나트륨 황산염, polyethyleneglycol (PEG), caprylic 산성 및 caragenean를 포함.
- 색층 방법 : 친화도 크로마 토그래피, 이온 교환 크로마 토그래피, 소수성 상호 작용 크로마 토그래피, thiophylic 상호 작용 크로마 토그래피 및 겔 - 여과 크로마 토그래피.
- Ultrafiltration.
IgY 준비 순도는 방법의 조합에 의해 증가시킬 수 있으며, 예를 들어, PEG 강수량은 친화도 크로마 토그래피와 함께하실 수 있습니다. 어떤 경우에는 최종 응용 프로그램에 따라 IgY의 물 추출물은 좋은 결과를 (아키타 & 나카이 1993) 달성을 충분합니다. 우리의 경험에 따르면, 우리는 PEG - 석출에 의해 얻을 IgY - 샘플은 다양한 면역 assays 많은 매우 잘했습니다. PEG - 석출 방법을 표준화하여 한 기술 비서가 4 7g 주당 사이에 총 IgY의 금액에 해당하는 약 84 알을 주당을 처리할 수 있습니다. 단순 계산 : 누워있는 암탉은 항원과 예방 접종을합니다. 몇 부스트 예방 접종 후 암탉 30 일 기간 동안 1:50,000의 titre로 특정 항체 (AB)를 생산하고 있습니다. 30 달걀 X 2 ML IgY 추출물 (프로토콜과 그림. 3 참조) 3,000리터와 의미 차례로 3,000리터의 AB - 희석 (통의 용량이 10리터입니다)에 해당하는 60 ML 총 IgY, 해당 AB 솔루션 300 버킷이 채워져 수 있습니다. 그래서, 같은 거대한 AB - 수량의보기에 그것은 지속적인 품질과 특이성의 AB - 수영장 저장 아무런 문제가 없습니다. 이 기술은 별도 polyspecific AB에서 관찰 충전 / 많은 변화를 줄여줍니다.
포유류의 보완 시스템의 아니오 활성화, 하마 (인간의 안티 마우스 항체), 류마티스 요인이나 인간의 피를 그룹 항원 (heteroagglutinins 부족)와 노 교차 반응성 : 수량의 측면의에도 불구하고, IgY AB는 포유류의 IgG에 비해 더 장점이있다.
IgY - AB의 뛰어난 장점은 소위 phylogenetic 거리입니다. Phylogenetic 거리가 동일하게 예방 접종을 때에도, 포유류와 닭의 순이 specificities 사이에 자주 설명한 차이에 대한 이유입니다. 포유 동물과 조류 자신의 면역 시스템 사이의 차이 이외에,이 두 동물 수업 phylogenetic 개발의 차이는 서로 다른 순이 specificities에 기여하고 있습니다. 몇몇 저자는 닭은 종종 더 효율적으로 토끼 (검토 쉐이드 동부 표준시 A. 2005 참조)보다 phylogenetically 고도 보존 포유 동물 단백질이나 펩티드에 대한 애비를 만들어보고있다. 그 결과, 보존 항원은 토끼 면역 체계에 "가면을 쓴"남아 있으므로에서만 약한 또는 "자동"응답을 일으킬 수 있습니다. 병아리와 토끼가 같은 포유류의 항원과 예방 접종을하는 경우뿐만 아니라, 매우 자주 닭이 거의 토끼에서 얻을 수 없습니다 AB - 특이성과 반응한다. AB는 난황에서 추출한 비 invasively 있기 때문에 또한 동물 복지의 측면이 중요합니다. 조합의 유전자 군 (플라스미드) 예방 접종과 IgY 생산은 (Witkowski 외. 2009) 완전히 비침습입니다.
결론적으로, 암탉과 PEG - 석출에 의해 IgY - 추출에서 AB의 생산은 매우 비용 효과적인 최대 1:1,000,000으로 안정 titres와 매우 구체적인 AB 결과. 에이브스와 포유류 사이 phylogenetic 거리로 인해, 닭고기 예 토끼와는 대조적으로 매우 보존 포유류의 항원에 대한 구체적인 AB 생산 수 있습니다. IgY 기술 얻은 AB의 특별한 금액은 치료 / 예방 목적으로 인간 및 동물용 의약품의 IgY - AB를 사용에도 문을 엽니다.
Disclosures
동물 실험 Landesamt 모피 아퍼 놀이 Soziales 베를린 (H 0069/03)에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
이 작품은 교육과 연구의 독일 연방 교육부에서 교부금에 의해 지원되었다 (프로젝트 BiGRUDI [동성 ologische G efahrenlagen : R isikobewertung, U ltraschnelle D etektion 깨물어 I dentifizierung 폰 bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). 우리는 우수 기술 지원 B. Diemar을 (샤히떼 - Universitätsmedizin 베를린, 인스티투트 FÜR Pharmakologie) 감사합니다.
Materials
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References
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