Summary
Bu protokol, polietilen glikol yağış yoluyla, özellikle yumurta sarısı toplam IGY çıkarma açıklar ve, IGY teknolojisi hakkında genel bilgi verir.
Abstract
Tavuklar (Musculus pektoralis, sol ve sağ, enjeksiyon hacmi 0.5-1.0 ml) im aşılama yoluyla veya plazmid Gen-Gun-bağışıklama yoluyla aşı olabilir. Antijen immünojenite bağlı olarak, yüksek antikor titreleri (1:100,000 - 1:1,000,000) sadece bir veya 3 sonra elde edilebilir - 4 artırmak aşılar. Normalde, bir tavuk, bundan sonra döşeme kapasitesi azalır, yaklaşık 72 hafta boyunca sürekli olarak yumurta bırakır. Bu protokol sayesinde bir yağış prosedürü (PEG. Polson ve ark 1980), yumurta sarısı toplam IGY çıkarma açıklamaktadır . Bu yöntem, iki önemli adımlar içerir. Bunlardan birincisi Lipidlerin kaldırılması ve ikinci bir adım süpernatant toplam IGY yağış. IGY özü bir yıldan fazla bir tamponu (PBS normalde) karşı diyaliz sonra -20 ° C'de saklanabilir. Özü saflık yaklaşık% 80, toplam IGY başına yumurta yumurta tavuğu yaşına bağlı olarak, 40-80 mg arasında değişir. 80 mg / yumurta (PEG yağış ile ilgili) yaklaşık 40 mg / yumurta tavuk yaşı ile toplam IGY içeriği artar. Yılda bir tavuk döşeme kapasitesi yaklaşık 325 yumurta. 60 mg toplam IGY / yumurta (bkz. Tablo 1) ortalama IGY içerik dayalı toplam 20 g IGY / yıl toplam potansiyel bir hasat anlamına gelir.
Protocol
1. Protokol - PEG-yağış yoluyla IGY çıkarma
Şekil 1 IGY-çıkarma prosedürünü bir şema verir (bkz. Tablo 2). Protokol ilk Polson ve ark tarif edilmiştir. 1980.
Tüm adımları lateks eldiven kullanılarak yapılmalıdır.
- Kabuğu dikkatlice çatlak ve yumurta sarısı, mümkün olduğu kadar beyaz yumurta gibi ortadan kaldırmak amacıyla "sarısı kaşık" aktarılır.
- Yumurta sarısı, bir filtre kağıdı aktarılır ve geri kalan yumurta akı kaldırmak için atılırsa, daha sonra yumurta sarısı deri bir neşter veya benzer bir alet (pipet) ile kesilir. Yumurta sarısı, 50 ml'lik bir tüp içine dökülür ve yumurta hacmi (V1) kayıtlıdır.
- Iki kez PBS yumurta sarısı hacmi toplam hacminin sarısı (ΣV1 + V2) ve daha sonra% 3.5 PEG 6000 (gram toz haline getirilmiş) ile karıştırılarak eklenir ve vortekslenmiş, yuvarlanan bir karıştırıcı üzerinde yuvarlanan 10 dakika ile takip ediyor. Ekstraksiyon prosedürü bu adımı iki aşamalı olarak süspansiyon ayırır. Bir faz "yumurta sarısı katıların ve yağlı maddeler" (Polson ark orijinal tırnak 1980) ve IGY ve diğer proteinleri içeren bir sulu faz oluşur.
- Tüpler santrifüj 4 ° C de 20 dakika (10.000 rpm 13.000 xg, Heraeus Multifuge 3SR + sabit açılı rotor göre). Süpernatant (V3) katlanmış bir filtre üzerinden dökülür ve yeni bir tüpe aktarılır.
- % 8.5 gram (yeni birime göre hesaplanan) PEG 6000, tüp vortekslenmiş ve 3. adımı olarak bir haddeleme mikser atılırsa.
- Süpernatantı atılır farkı ile 4. adımı yineleyin.
- Pelet dikkatli bir şekilde, bir cam çubuk ve vortexer yardımıyla 1 ml PBS içinde çözülür. PBS, son hacim 10 ml (V4) eklenir. Çözüm% 12 PEG 6000 (w / v, 1.2 gram) ile karıştırılır ve adım 3 (vorteks, haddeleme mikser) gibi tedavi edilir.
- 6. adımı tekrarlayın ve 800 ul PBS dikkatle pelet (cam çubuk ve vorteks) çözülür. Kaybolur ve daha sonra bir diyaliz kapsül (pipet) özü aktarmak için hava kabarcıkları için bekleyin. Tüp 400 ul PBS ile durulayın ve diyaliz cihazı (V5) sesi eklemek. (Diyaliz cihazları ve membranlar hazırlanması için eke bakınız.)
- Ekstresi,% 0.1 serum fizyolojik (1.600 ml), gece boyunca diyaliz ve manyetik karıştırıcı yardımıyla hafifçe karıştırılır. Ertesi sabah, tuzlu su, PBS tarafından değiştirilir ve başka bir üç saat için diyaliz.
- Daha sonra bir pipetle IGY özü diyaliz kapsül çekti ve 2ml tüpleri transfer. Son hacmi 2 ml (V6) civarındadır.
- Örneklerinin protein içeriği (mg / ml), 280 nm (PBS ile seyreltilmiş 1:50) (bkz. Şekil 2) fotometrik olarak ölçülür ve IGY bir nesli için 1.33 katsayısı ile Lambert-Beer kanununa göre hesaplanır, Şekil . 4 hazırlık kalitesi (saflık ve kurtarma yaklaşık% 80) gösterir.
- ° C (-70 ° C'de numunelerin donma yok) -20 alikotları örnekleri saklamak için tavsiye edilir.
- Son hazırlıklarını kalitesi vallahi protokolü açıklandığı gibi basit SDS-PAGE ile analiz edilir http:/www.jove.com/details.php?id=1916
2. Ek-önce diyaliz çanta üreticisinin tavsiyelerine göre aşağıdaki şekilde hazırlanmalıdır kullanabilirsiniz:
- 20 diyaliz torbalar 30 cm parçalar halinde kesilir ve 2000 ml cam beher verilmiştir.
- 5 mM EDTA çözüm 1.750 ml eklenir.
- Bir cam huni, çanta çanta EDTA çözeltisi ile kaplı olduğundan emin olmak için üstüne yerleştirilir. Çözüm ısıtılır ve 5 dakika (sıcak plaka) kaynatılır. Çözüm dekante ve çanta, üç kez distile su ile yıkanır.
- 1.750 ml EDTA çözüm Bir kez daha eklenir, 5 dakika süreyle kaynatılır ve yukarıdaki gibi distile su ile üç defa yıkanır.
- Son olarak, diyaliz çanta, distile su içinde 10 dakika kaynatılarak ve 4 saklanır ° C Steril cımbız vasıtası ile diyaliz torbaları çıkartın.
3. Temsilcisi sonuçları
Şekil 1 Polson ark orijinal açıklamasına göre polietilen glikol yağış yoluyla IGY çıkarma şematik. 1980 daha büyük bir resim görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2 yaş bağımlılığı aşı tavuk yumurta sarısı toplam IGY Geliştirme. Toplam IGY / yumurta ve SD (n = 4 yumurtacı tavukların) haftalık ortalama verilmiştir. [Pauly 2009]).
Şekil 3. Layidört farklı antijen ile aşılanan tavukların ng kapasite izlenmesi. Oklar aşılama tarihi ([Pauly 2009]) gösterir. burada daha büyük bir resim görüntülemek için tıklayın.
Şekil 4 azaltarak koşulları altında farklı yumurtaları tek tek IGY hazırlıkları Poliakrilamid-Gelelectrophoresis
Lane 1 - Moleküler ağırlık marker, Lane 2 - IGY standardı 3-5 Lane - protokolünde açıklandığı gibi farklı IGY örnekleri hazırladı. Bu protokolün 10. adıma göre son hazırlıklarını. HC - ağır zincirleri, LC - ışık chaines,? - Yaklaşık 35 kDa (muhtemelen vitellogeninin II habercisi C-terminal parçası, [Klimentzou ve ark, 2006]) molekül ağırlığına karşılık gelen küçük kirleri.
| Tavuk 21 (Antijen A) | Tavuk 22 (Antijen A) | Tavuk 19 (Antijen B) | Tavuk 23 (Antijen C) | |
| Yumurta sayısı (toplam IGY) 1, 2 yıllık bir süre | 625 (38 gr) | 626 (38 g) | 545 (33 gr) | 608 (37 g) |
| Yumurta sayısı (toplam IGY), ilk yıl | 345 (20 g) | 304 (16 g) | 326 (18 gr) | 308 (17 gr) |
| Yumurta sayısı (toplam IGY), ikinci yıl | 280 (18 gr) | 322 (21 gr) | 219 (15 gr) | 300 (20 g) |
| % Max. mümkün yumurta sayısı (ilk yıl) 2 | 106 | 93 | 100 | 95 |
| % Max. mümkün yumurta sayısı (ikinci yıl) | 86 | 99 | 67 | 92 |
| işlenmiş yumurta sayısı | 565 | 620 | 283 | 401 |
1 toplam IGY miktarı ortalama değer Şekil 2 verilerine göre yumurta başına 60 mg protein, yumurta sayısı çarpılarak hesaplanır .
2 max. mümkün yumurta sayısı yılda damızlık bir bilgiye göre 325.
Tablo 1. İki yıl farklı antijen ile aşılanan tavukların yumurtlama kapasitesinin istatistikleri. (Şekil ayrıca bkz 3) iki yıl boyunca farklı antijenlerin yanı sıra IGY-sonuç aşıdan sonra en fazla dört tavuk yüzde kapasite Döşeme, [Pauly 2009]) .
| Yumurta Nr. | Tavuk Nr. Tarihi Döşeme | V1 [ml] sarısı | V2 [ml] PBS | 1. PEG Prec. [G] | Cilt [ml] | 2. PEG Prec. [G] | Topak | 3. PEG Prec. [G] | Topak | Cilt [mL] | Total protein mg / ml | Düzeltilmiş toplam protein mg / ml |
| 2xV1 ΣV1 + V2 | % 3,5 w / v] ΣV1 + V2 | Prec. centrif. ve filtrasyon V3 | % 8,5 w / v] V3 | V4 ml PBS içinde çözünmüş | % 12 [w / v] V4 | Ml PBS V5 Çözünmüş | PBS V6 karşı diyalizden sonra | A280/ml | A280/ml: 1.33 | |||
| 1 | H293 / 22.10. | 15 | 30 45 | 1,58 | 31 | 2,63 | 10 | 1,2 | 1,2 | 1,7 | 35,0 | 26,3 |
| 2 | H293 / 23.10. | 13 | 26 39 | 1,37 | 25 | 2,12 | 10 | 1,2 | 1,2 | 1,7 | 28,8 | 21,6 |
Tablo 2 PEG yağış Örnek protokol
Discussion
Uygun bir IGY arıtma yönteminin seçimi (laboratuar veya endüstriyel) arıtma, maliyet etkinliği, teknoloji (laboratuar ekipmanları), çevre (atık yönetimi) üzerindeki etkisi ve ölçek etkilenir. Çeşitli IGY çıkarma yöntemleri De Meulenaer & Huyghebaert (2001, gözden geçirme için de Schade ve ark 2005) tarafından ayrıntılı olarak incelendi. Genel olarak, bu yöntemler üç temel gruba ayrılabilir:
- Yağış yöntemleri içeren amonyum veya sodyum sülfat, polietilenglikol (PEG), kaprilik asit ve caragenean.
- Kromatografik yöntemler: afinite kromatografisi, iyon değiştirme kromatografisi, hidrofobik etkileşim kromatografi, thiophylic etkileşim kromatografisi ve jel filtrasyon kromatografisi.
- Ultrafiltrasyon.
IGY bir hazırlık saflık yöntemlerinin bir kombinasyonu ile artış olabilir; örneğin, PEG yağış afinite kromatografisi ile kombine edilebilir. Bazı durumlarda, nihai uygulama bağlı olarak, IGY su ekstraktı (Akita & Nakai 1993) iyi sonuçlar elde etmek için yeterli olacaktır. Deneyimlerimize göre, PEG-yağış elde IGY örnek çok farklı immünolojik testlerin bir çok iyi çalıştı. PEG çöktürme yöntemi standartlaştırarak bir teknik asistan, 4 ve 7 gr haftada arasında toplam IGY bir miktar karşılık gelen yaklaşık 84 yumurta, haftada süreci mümkün. Basit bir hesaplama: Bir yumurta tavuğu bir antijen ile aşı. Birkaç artırmak aşılar sonra tavuk, 30 günlük bir süre boyunca 1:50,000 bir titreye sahip özel antikorlar (Ab) üretir. 30 yumurta x 2 ml IGY ekstraktı (bkz. protokolü ve Şekil 3) 3.000 l anlamına da 3.000 l Ab-seyreltme (bir kova kapasitesi 10 l) karşılık gelen 60 ml toplam IGY, karşılık gelen Ab çözüm 300 kova dolu olabilir. Yani, böyle büyük Ab-miktar, sürekli kalite ve özgünlüğü bir Ab-havuzu saklamak için hiç sorun değil. Bu teknik, aksi polyspecific Ab gözlenen şarj / çok değişkenlik azaltır.
Hiçbir memeli kompleman sistemi aktivasyonu, HAMA (insan anti-fare antikor), romatoid faktörler ya da insan kan grubu antijenleri (heteroagglutinins eksikliği) ile çapraz reaktivite: miktar yönü rağmen, IGY Ab memeli IgG ile karşılaştırıldığında daha fazla avantajlara sahip olacaksınız.
IGY-Ab olağanüstü bir avantaj olarak adlandırılan bir filogenetik mesafe. Filogenetik mesafe aynı aşı bile, sık sık açıklanan memeliler ve tavukların Ab özgüllükleri arasındaki farklılıkların nedeni budur. Memeli ve kuş bağışıklık sisteminin kendilerini arasındaki farklılıklara ek olarak, bu iki hayvan sınıflarına filogenetik gelişim farklılıkları, farklı Ab özgüllükleri katkıda bulunur. Bazı yazarlar, tavuk genellikle daha verimli tavşan (inceleme için Schade et a. 2005) daha filogenetik son derece korunmuş memeli protein veya peptit karşı Abs üretmek bildirdin. Bunun bir sonucu olarak, korunmuş antijen tavşan bağışıklık sistemi için "maskeli" kalır ve böylece sadece zayıf ya da "sessiz" yanıtı neden. Ayrıca, tavuk ve tavşan aynı memeli antijen ile aşı eğer çok sık tavuk nadiren tavşan elde edilebilir bir Ab-özgüllük ile yanıt. Ab, yumurta sarısı çıkarılan non-invaziv olduğundan hayvan refahı açısından önemlidir. Gen-Gun (plazmid) aşılama ile kombine IGY üretim (Witkowski ve ark 2009) tamamen non-invazif.
Sonuç olarak, tavuk ve PEG-yağış yoluyla IGY çıkarma Ab üretimi çok düşük maliyetli ve istikrarlı titreleri kadar 1:1,000,000 son derece spesifik Ab sonuçlar. Kuşlar ve memeliler arasında filogenetik mesafe nedeniyle, tavuk, örneğin tavşan aksine son derece korunmuş memeli antijenlere karşı spesifik Ab üretmek mümkün. IGY teknolojisi ile elde edilen Ab olağanüstü miktarda terapötik / profilaktik amaçlı insan ve veteriner tıp IGY-Ab kullanmak için de kapıyı açar.
Disclosures
Landesamt kürk Gesundheit und Soziales Berlin (H 0069/03) tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Bu çalışma, Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı tarafından hibe tarafından desteklenmiştir (Proje BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und I dentifizierung von bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]) . Biz mükemmel teknik yardım B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie) teşekkür ederim.
Materials
|
References
- Akita, E. M., Nakai, S. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain. J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).
- De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review. Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).
- Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27, 183-193 (2006).
- Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period. Poultry Science. 88, 281-290 (2009).
- Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens. Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).
- Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology. , Springer. Berlin. (2001).
- Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).
- Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies. J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).
