Summary
وضعنا القائم على الكولاجين
Abstract
سرطان الثدي هو السبب الرئيسي للوفيات في العالم الغربي. ومن الثابت أن انتشار سرطان الثدي ، أولا محليا وبشكل أقصى في وقت لاحق ، هو عامل رئيسي في تشخيص المريض. نظم تجريبية لسرطان الثدي تعتمد على خطوط الخلايا تستمد عادة من الأورام الأولية أو الانصباب الجنبي. عقبتين رئيسيتين تعيق هذا البحث : (ط) ليست ممثلة معروفة بعض أنواع فرعية من سرطان الثدي (تشخيص الأورام لا سيما الفقراء اللمعية B) ضمن مجموعات الخط الحالي ، (ب) لا تأثير للورم المكروية عادة ما تؤخذ في الحسبان.
نظهر تقنية لثقافة العينات الأولية من سرطان الثدي من جميع الأنواع الفرعية. ويتحقق ذلك باستخدام نظام ثلاثي الأبعاد الثقافة (3D) والتي هي جزء لا يتجزأ من القطع الصغيرة من الأورام في الفئران الكولاجين لينة أنا الوسائد. في غضون 2-3 أسابيع ، وانتشار الخلايا السرطانية في الكولاجين وشكل مختلف هياكل مماثلة لتلك التي لوحظت في tumours1 الإنسان. الخلايا الشحمية قابلة للحياة ، كانت الخلايا الطلائية والخلايا الليفية داخل النواة الأصلية واضحة على الأنسجة. وقد أظهرت الخلايا الظهارية الخبيثة مع التشكل شبيه بالصدفة الغازية في الكولاجين المحيطة بها. وكان واضحا تعدد الأشكال النووية داخل هذه الخلايا ، جنبا إلى جنب مع شخصيات وهيئات الإنقسامية أفكارك.
لقد استخدمنا البصرية التصوير المقطعي الإسقاط (المحتلة) ، وهي تكنولوجيا التصوير 3D ، من أجل تحديد مدى انتشار الورم في الثقافة. ونحن قد استخدمت الأراضي الفلسطينية المحتلة لقياس حجم الجزء الأكبر من الثقافة الورم ، معلمة تقاس بشكل روتيني أثناء العلاج الجدد مساعد لمرضى سرطان الثدي لتقييم الاستجابة للعلاج المخدرات.
هنا نقدم فرصة لأورام الثدي ثقافة الإنسان دون تحيز النوع الفرعي وقياس انتشار هذه فيفو السابقين. ويمكن استخدام هذا الأسلوب في المستقبل لتحديد حساسية المخدرات في الورم الاصلي. وهذا قد تقدم نموذجا أكثر التنبؤية من خطوط الخلايا المستخدمة حاليا.
Protocol
1. استخراج الكولاجين من ذيول الفئران
- ذيول الفئران مكان المجمدة الطازجة في الايثانول 70 ٪.
- الجلد المغطي Deglove مع الأوتار تعريض مشرط.
- الشريط الأوتار بعيدا عن الذيل ومكان في الإيثانول 70 ٪ لتعقيم.
- وزن الأوتار التي تم جمعها ونقلها إلى حمض الخليك (1G وتر لحمض الخليك 250ml 0.5M). مزيج ل48hr في 4 درجات مئوية.
- الطرد المركزي مزيج حمض وتر / ز 10000 في الخل ل30min وتجاهل بيليه.
- إضافة حجم مساو من 10 ٪ (W / V) كلوريد الصوديوم لطاف والسماح للخليط إلى الوقوف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- جمع الكولاجين الغنية ، غير قابلة للذوبان الطبقة السفلية وينبذ ل30min أخرى في 10000 ز
- Resuspend الكولاجين المواد الغنية في حمض الخليك 0.25M في 4 درجات مئوية وdialyse ضد 1:1000 حمض الخليك في 4 درجة مئوية لمدة 3 أيام ، وتغيير العازلة غسيل الكلى مرتين يوميا.
- تعقيم كذلك حل الكولاجين بواسطة الطرد المركزي (20،000 ل2hr ز) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- تمييع الكولاجين على النحو المطلوب ، مع إضافة حامض الخليك العقيمة 1:1000 إلى تركيز المخزون من 1mg/ml.
2. 3D الفحص الخلق
نشرت يستند مقايسة 3D على خلية مقايسة الخط ، سابقا 2.
- ويتم حصاد الأساسية خزعات متعددة من المرضى بالتراضي في وقت استئصال الجراحي العلاجية لسرطان الثدي الغازية.
- بالعين ، تقسيم النوى باستخدام مشرط إلى شظايا 1MM 3. تقليم والتخلص من الدهون متميزة ظاهريا.
- غمر أجزاء كاملة في وسائل الإعلام MEGM. يمكن تخزينها في الأنسجة في هذه الولاية لمدة تصل إلى 1hr.
- لإنشاء الكولاجين هلام ، في مزيج الكولاجين الفئران الجليد 1mg/ml الذيل ، 1:1000 حامض الخليك تصفيتها ، DMEM/F12 10x وهيدروكسيد الصوديوم 0.22M في نسبة 3:5:1:1 لإنشاء تركيز الكولاجين النهائية 0.3 ملغ / مل.
- حقن الكولاجين 1.2ml من الخليط في الآبار الفردية 24 لوحة في مكان جيد وحاضنة عند 37 درجة مئوية ل10min الشروع في التبلور.
- بعد 10min ، إزالة 24 لوحة جيدا من الحاضنة. مكان القطع الورم إلى الكولاجين التبلور ، ودفع لهم في بلطف إلى مركز الجل باستخدام تلميح 10μl ماصة. عودة 24 لوحة بالإضافة إلى حاضنة لل1hr.
- للأورام + ER ، الملحق مع وسائل الإعلام كاملة MEGM oestradiol - β إلى تركيز M. 3.2x10 -10 مرة واحدة في المقايسات جل وتبلور ل1hr ، وإدخال بعناية 1.2ml من وسائل الإعلام في كل تستكمل جيدا. وستقام المباراة النهائية β - oestradiol تركيز داخل مقايسة equilibriate إلى M 1.6x10 -10 أن ألخص مستويات هرمون الاستروجين الفسيولوجية موجودة في نسيج الثدي 3.
- تشغيل غيض ماصة 10μl حول الحافة الداخلية من كل جانب ، والإفراج عن كل circumferentially هلام ، وبالتالي السماح بتعويم كل هلام بحرية داخل وسائل الإعلام. عودة 24 لوحة جيدا للحاضنة.
- استكمال تبادل وسائل الإعلام مرتين أسبوعيا حتى انتهاء التجربة. إنهاء التجربة وسائل الاعلام عن طريق إزالة وإضافة تثبيتي الفورمالين.
3. يلطخ الضد من الفحص المقطعي استعدادا لإسقاط ضوئي
اعتمدنا طريقة تنطبق كلها على عينة 4 تلطيخ.
- غسل العينات ثابتة في الفورمالين ل30min برنامج تلفزيوني. يذوى المواد الهلامية متدرج في الميثانول مخففة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.05 ٪ توين 20 (0.05 ٪ PBST) : 33 ٪ ، 66 ٪ و 100 ٪ لل≥ 15min في كل خطوة.
- يحضن النسيج في MeOH الطازجة : DMSO : 30 ٪ H 2 O 2 في نسبة 02:01:03 (15 ٪ V / V H 2 O 2) في درجة حرارة الغرفة ل24hr إخماد تألق ذاتي.
- غسل العينات مرتين ل30min في الميثانول. تجميد العينات إلى -80 درجة مئوية يتم تقديم خمس مرات على الأقل في كل مرة 1hr والعودة إلى درجة حرارة الغرفة (RT) لضمان أن المستضدات في أعمق أجزاء من الأنسجة للوصول.
- ترطيب الأنسجة العودة إلى PBST 0.05 ٪ مع الميثانول ومادة التخفيف (33 ٪ و 66 ٪ و 100 ٪ لل15min في كل خطوة).
- كتلة النسيج في عرقلة الحل (10 ٪ في مصل PBST 0.05 ٪) ل24hr.
- احتضان النسيج مع الأجسام المضادة الأولية لتحديد محتوى الظهارية ، وذلك باستخدام أرنب المضادة للcytokeratin بتركيز 1:500 مخففة في 1.5ml من عرقلة الحل DMSO تحتوي على 5 ٪ ل48hr.
- غسل العينات أربع مرات مع PBST 0.05 ٪ عن كل 30min.
- احتضان النسيج مع الفلورسنت الضد الثانوية (1:100 الماعز المضادة للأرنب Alexa555) ، مخففة في عرقلة الحل 1.5ml DMSO تحتوي على 5 ٪ ل48hr.
- غسل العينات مرة أخرى مع 0.05 ٪ لأربع مرات PBST 30min لكل منهما.
4. الإسقاط الضوئية التصوير المقطعي
الإسقاط الضوئية التصوير المقطعي هو أسلوب المجهري التي سبق وضعها لانتاج صور عالية الدقة 3D من العينات البيولوجية الفلورسنت بسماكة تصل إلى 15 ملليمتر 5.
- جبل لياليويمكن الحصول في هلام 1 ٪ انخفاض ذوبان agarose نقطة ويذوى في الميثانول 100 ٪ لل24hr. مسح العينة في حل BABB (1:2 البنزيل الكحول ، البنزيل بنزوات) ل48hr والمسح الضوئي باستخدام ماسحة 3001M الأراضي الفلسطينية المحتلة (Bioptonics).
- ويتم التقاط كل من الهدف وتألق ذاتي باستخدام مجموعة Cy3 تصفية (منبه 545nm/30 نانومتر ، باعث 610/75 نانومتر) وGFP1 تصفية مجموعة (منبه 425nm/40 نانومتر ، باعث LP475 نانومتر) على التوالي.
5. التعمير والكمي 3D
- ويمكن بناؤها على مجموعة من الاسقاطات التي حصل عليها الزاوي الأراضي الفلسطينية المحتلة NRecon باستخدام البرمجيات (SkyScan) لإنشاء سلسلة من شرائح المقطع العرضي من خلال فحص الغزو. هذا البرنامج متاح للتحميل مجانا في http://www.skyscan.be/products/downloads.htm .
- تحليل البيانات باستخدام برنامج إعادة Volocity (PerkinElmer). مظاهرة البرمجيات الحرة متاحة للتحميل في http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/ .
- تعيين كثافة فوكسل عتبة الحد الأدنى للحد من التدخل مضان الخلفية في القناة المستهدفة من أجل تقدير حجم الظهارية التي تلطيخ cytokeratin. حددنا هذه العتبة تجريبيا في الاتحاد الافريقي 9000 باستخدام قائمة المعلمات المتوفرة في تطبيق القياس ، ونحن كميا حجم ظهارة في الاستمرارية مع جوهر الأصلي (ترسيمها في القناة autofluorescent) ، وهذا سمح لنا لتحديد حجم ثمرة الظهارية بين مختلف ورم عينات.
6. ممثل النتائج :
خلال تطوير فحص ما مجموعه 52 خزعة سرطان الثدي استخدمت عينات مع طائفة واسعة من الأنسجة. هذه <10 ٪ (5 / 52) فشلت في تقديم واحدة على الأقل مقايسة غزو قابلة للحياة. وكان فشل تجربة إما بسبب العدوى البكتيرية فوق أو عدم كفاية المواد خزعة الورم. ولذلك لا يقتصر تطبيق مقايسة لسلالة معينة من سرطان الثدي.
المقايسات نموذجي (الشكل 1) بعد 20 يوما ثابتة في الثقافة الكولاجين والملون لاحقا cytokeratin. برنامج Volocity قادرة على التعرف على حد سواء بالجملة الظهارية المستمر مع الجماعات الأصلية والأساسية متجردا من غزو الخلايا وتحديد حجم كل على حدة.
المقايسات الغزو الرقم 1. التالي للتثبيت وتقدير. وفحص العينات التي تم الحصول عليها من يدعم العديد من أنواع فرعية من سرطان الثدي : أ) ER + ب) HER2 + ج) ER.
Discussion
الكولاجين هي الآن على أساس المقايسات لدراسة سلوك خطوط الخلايا السرطانية تستخدم على نطاق واسع 6،7،8. ومع ذلك ، فإن هذه المقايسات لم تنعكس في التعقيد الكامل للورم وبيئتها. في هذه الدراسة ، وتبين لنا أنه يمكن استخدام مواد سرطان الثدي البشرية بطريقة مماثلة ، خارج الحي. علاوة على ذلك ، الأراضي الفلسطينية المحتلة هو أداة مفيدة لتوصيف التوسع 3D من سرطان الثدي. وجدنا أن القيد الرئيسي لهذا الأسلوب هو توافر المواد الورم (خزعة واحدة أساسية هي كافية لمدة 4-6 المقايسات). عامل آخر هو أن يحد من الغزو الهيكلية تحدث فقط في حوالي 40 ٪ من المقايسات. للتغلب على هذا ، ونضيف إلى أي علاج بشكل منتظم حول المطلوب اليوم من 7 إلى جميع المقايسات مع النمو مرئية.
ويمكن توسيع نطاق استخدام في الأراضي الفلسطينية المحتلة في المستقبل أيضا للكشف عن تغيرات بالجملة ، خارج الجسم ، والناجمة عن العلاج بالعقاقير. وهذا يمكن أن يسهل بدوره أكثر فردية علاج السرطان ، ومستقلة عن النماذج الحيوانية. ونحن حاليا بصدد استكشاف مدى استجابة الأورام + ER لفيفو السابقين تاموكسيفين.
Disclosures
SEW ويعملون بواسطة تكنولوجيا JF MRC ، الذي هو تسويق Bioptonics الماسحات الأراضي الفلسطينية المحتلة. مؤلفين آخرين تعلن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر لورنا رينشو (ادنبرة وحدة الثدي) لمساعدتها في الحصول على قيمة العينات السريرية.
وقد وافق استخدام المواد الورم عن طريق لجنة أخلاقيات البحث لوثيان (08/S1101/41) ويتم الحصول عليها تحت رعاية مركز الطب التجريبي للسرطان برنامج (ادنبرة).
ويؤيد هذا العمل من قبل مجلس التمويل الاسكتلندي. ADL هي مارغريت ملكة جمال ترست زبد زميل Reekie السريرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGM Complete | Lonza Inc. | CC-3150 | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8900 10X1L | |
| β-–stradiol | Sigma-Aldrich | E8875-250MG | |
| Rabbit anti-cytokeratin | Dako | Z0622 | |
| Goat anti-rabbit Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
| All other standard reagents were obtained from Sigma-Aldrich. | |||
References
- Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology. 57, 171-192 (2010).
- Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited. J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).
- Dabrosin, C. Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle. J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat Methods. 4, 31-33 (2007).
- Sharpe, J. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Hidalgo-Carcedo, C. Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6. Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).
- Katz, E. A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk. Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).
- Timpson, P. Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53. Cancer Res. 71, 747-757 (2011).
