לטווח ארוך של תרבות האדם סרטן השד דוגמאות וניתוח שלהם באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית

Summary

פיתחנו מבוססי קולגן

Abstract

סרטן השד הוא הגורם המוביל לתמותה בעולם המערבי. היא מבוססת היטב כי התפשטות של סרטן השד, תחילה מקומית ולאחר מכן distally, היא גורם מרכזי פרוגנוזה המטופל. מערכות ניסיוני של סרטן השד מסתמכים על שורות תאים שמקורם בדרך כלל גידולים ראשוניים או השתפכויות פלאורלי. שני המכשולים העיקריים המעכבים את המחקר הזה: (i) ידוע כמה תתי סוגים של סרטן השד (בעיקר העניים luminal הפרוגנוזה גידולים B) אינם מיוצגים בתוך אוספים הקו הנוכחי (ii) את ההשפעה של microenvironment הגידול לא נלקח כלל בחשבון.

אנו להפגין טכניקה ראשונית תרבות סרטן השד דגימות של כל סוגי המשנה. זו מושגת על ידי שימוש תלת ממדי (3D) מערכת התרבות שבה חתיכות קטנות של גידולים המוטבעים קולגן עכברוש רך אני כריות. בתוך 2-3 שבועות, בתאי הגידול התפשט לתוך קולגן ויוצרים מבנים שונים הדומים לאלו שנצפו tumours1 האדם. Adipocytes קיימא, תאים אפיתל fibroblasts בתוך הליבה המקורית ניכרו על היסטולוגיה. תאים אפיתל ממאירים עם מורפולוגיה squamoid היו הפגינו הפולש לתוך קולגן שמסביב. Pleomorphism גרעיני ניכרה בתוך תאים אלה, יחד עם דמויות mitotic גופים אפופטוטיים.

יש לנו תחזית המועסקים טומוגרפיה אופטית (הכבושים), טכנולוגיית הדמיה 3D, על מנת לכמת את מידת התפשטות הגידול בתרבות. השתמשנו הכבושים כדי למדוד את נפח עיקר הגידול תרבות, פרמטר נמדד באופן שגרתי במהלך טיפול ניאו אדג'ובנטי של חולות סרטן השד על מנת להעריך תגובה לטיפול תרופתי.

כאן, אנו מציגים הזדמנות גידולים התרבות האנושית השד ללא משוא פנים תת סוג ולכמת את התפשטות vivo אלה לשעבר. שיטה זו יכולה לשמש בעתיד כדי לכמת את רגישות התרופה בגידול המקורי. זו עשויה לספק מודל החיזוי יותר שורות תאים המשמשים כיום.

Protocol

1. מחלץ קולגן מ זנבות עכברוש

1. מקום קפוא זנבות עכברוש טרי אתנול 70%.
2. Deglove והעור שמעליה עם גידים חשיפת אזמל.
3. רצועת הגידים מן הזנב מקום אתנול 70% לעקר.
4. לשקול את הגידים נאספים להעביר חומצה אצטית (גיד 1g ל 250 מ"ל חומצה אצטית 0.5m). מערבבים עבור 48hr ב 4 ° C.
5. צנטריפוגה תמהיל חומצה גיד / אצטית ב g 10,000 עבור 30 דקות וזורקים את הכדור.
6. הוסף נפח שווה של 10% (w / v) NaCl כדי supernatant ולאפשר לתערובת לעמוד לילה בשעה 4 ° C.
7. אסוף את שכבת קולגן עשיר, תחתית מסיס ו centrifugate במשך 30 דקות נוספות על 10,000 g.
8. Resuspend קולגן עשיר החומר חומצה אצטית 0.25M ב 4 ° C ו dialyse נגד חומצה אצטית 1:1000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים, שינוי חיץ דיאליזה פעמיים ביום.
9. יתר על כן לעקר את הפתרון קולגן על ידי צנטריפוגה (20,000 g עבור 2hr) ולאחסן ב 4 ° C.
10. מדולל קולגן כנדרש עם תוספת של חומצה אצטית סטרילי 1:1000 ריכוז מלאי של 1mg/ml.

2. 3D יצירה Assay

Assay 3D מבוסס על assay קו התא, שפורסמו בעבר ^2.

1. ביופסיות מרובות ליבה נקצרים מן הסכמה חולים בזמן כריתה כירורגית מרפא עבור סרטן שד פולשני.
2. לפי העין, לחלק את ליבות באמצעות אזמל לתוך 1mm ³ שברים. חתוך וזורקים שומן ברורים macroscopically.
3. לטבול את שברי בתקשורת השלם MEGM. הרקמה ניתן לאחסן במצב זה עד 1 שעות.
4. כדי ליצור את ג'ל קולגן, על תמהיל קולגן קרח 1mg/ml זנב חולדה, 1:1000 חומצה אצטית מסונן, DMEM/F12 10x ו 0.22M NaOH ביחס של 3:5:1:1 ליצירת קולגן הריכוז הסופי של 0.3 מ"ג / מ"ל.
5. הזרק 1.2ml של תערובת קולגן לתוך בארות בודדים של צלחת 24 היטב לתוך מקום באינקובטור ב 37 מעלות 10min ליזום gelling.
6. לאחר 10min, הסר את צלחת גם 24 מתוך החממה. מניחים את חתיכות הגידול על הקולגן gelling בעדינות לדחוף אותם אל מרכז ג'ל באמצעות קצה 10μl פיפטה. מחזירים את הצלחת היטב 24 את החממה עבור 1 שעות.
7. עבור ER + גידולים, תוספת התקשורת השלם MEGM עם β-oestradiol ריכוז של 3.2x10 ^-10 מ ' לאחר מבחני ג'ל יש בג'ל עבור 1 שעות, בזהירות להציג 1.2ml של התקשורת השלים לבאר כל אחד. הריכוז הסופי β-oestradiol בתוך assay יהיה equilibriate ל ^-10 1.6x10 M לשחזר את רמות האסטרוגן פיזיולוגיים למצוא רקמת השד ^3.
8. הפעל טיפ פיפטה 10μl מסביב לקצה הפנימי של כל טוב, שחרור כל ג'ל circumferentially, ובכך מאפשר ג'ל כל לצוף בחופשיות בתוך התקשורת. מחזירים את הצלחת היטב 24 אל האינקובטור.
9. שערי בתוספת התקשורת פעמיים בשבוע עד תום הניסוי. לסיים את הניסוי על ידי הסרת התקשורת והוספת מקבע פורמלין.

3. נוגדן מכתים של Assay לקראת הקרנת טומוגרפיה אופטית

אימצנו שיטה שפורסמו בעבר עבור כל דגימה ⁴ מכתים.

1. לשטוף קבוע דגימות בפורמלין עבור 30 דקות ב-PBS. מייבשים את הג'לים בשלבים של מתאנול מדולל PBS המכיל 0.05% Tween 20 (0.05% PBST): 33%, 66% ו 100% ≥ 15min בכל שלב.
2. דגירה רקמות MeOH מוכן טרי: DMSO: 30% H ₂ O ₂ ביחס של 02:01:03 (15% v / v H ₂ O ₂₎ בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות כדי לכבות את autofluorescence.
3. לשטוף דגימות פעמיים בתוך 30 דקות מתנול. להקפיא את דגימות -80 ° C חמש פעמים לפחות 1 שעות בכל פעם בחזרה לטמפרטורת החדר (RT) על מנת להבטיח כי אנטיגנים בחלקים עמוקים יותר של רקמת ניתנים נגיש.
4. רעננותם רקמת חזרה PBST 0.05% עם מתנול כפי diluent (33%, 66% ו -100% עבור 15min בכל שלב).
5. חסום את הרקמה חוסמים פתרון (10% בסרום PBST 0.05%) עבור 24 שעות.
6. דגירה הרקמה עם נוגדן ראשוני לזהות את התוכן אפיתל, באמצעות ארנבת אנטי cytokeratin בריכוז של 1:500 מדולל 1.5ml של פתרון חסימת המכילה DMSO 5% 48hr.
7. לשטוף דגימות ארבע פעמים עם PBST 0.05% עבור כל 30 דקות.
8. דגירה הרקמה עם נוגדן פלואורסצנטי משני (1:100 עיזים נגד ארנב Alexa555), בדילול מלא בתמיסה המכילה DMSO חסימת 1.5ml 5% 48hr.
9. שטפו את דגימות שוב עם 0.05% ארבע פעמים PBST עבור 30 דקות כל אחד.

4. הקרנה אופטי טומוגרפיה

טומוגרפיה הקרנה אופטית היא טכניקה מיקרוסקופיה שפותחה בעבר כדי להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה 3D של דגימות ביולוגיות ניאון עם עובי של עד 15 מ"מ ^5.

1. הר יםג'ל מזרקת ב 1% נקודת התכה נמוכה agarose ו מייבשים מתנול ב 100% עבור 24 שעות. נקה את הדגימה ב באב פתרון (01:02 בנזיל אלכוהול, בנזיל בנזואט) עבור 48hr ולסרוק בעזרת סורק הכבושים 3001M (Bioptonics).
2. שני היעד autofluorescence נלכדים באמצעות מערכת Cy3 המסנן (exciter 545nm/30 ננומטר, פולט 610/75 ננומטר) GFP1 להגדיר מסנן (exciter 425nm/40 ננומטר, LP475 ננומטר פולט) בהתאמה.

5. שחזור וכימות 3D

1. סט התחזיות זוויתיים נרכשה על ידי הכבושים ניתן לשחזר באמצעות תוכנה NRecon (SkyScan) כדי ליצור סדרה של פרוסות חתך דרך assay את הפלישה. תוכנה זו זמינה להורדה בחינם ב http://www.skyscan.be/products/downloads.htm .
2. נתח את הנתונים מחדש באמצעות תוכנת Volocity (PerkinElmer). תוכנות הדגמה חינם זמין להורדה ב http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/ .
3. על מנת לכמת נפח אפיתל על ידי מכתים cytokeratin, להגדיר voxel מינימום עוצמת סף להפחית מהפרעות הקרינה רקע בערוץ היעד. הגדרנו את זה באופן אמפירי על סף 9000 au באמצעות רשימה של פרמטרים זמינים יישום המדידה, אנו לכמת את עוצמת הקול של אפיתל ברצף עם ליבת המקורי (התחום בערוץ autofluorescent). זו אפשרה לנו לכמת כרכים של תולדה אפיתל בין שונים הגידול דגימות.

6. נציג תוצאות:

במהלך הפיתוח של assay, סך של סרטן השד 52 דגימות ביופסיה עם מגוון רחב של histopathology כבר בשימוש. מבין אלה <10% (5 / 52) לא הצליחו לספק לפחות אחד assay הפלישה קיימא. הכישלון נבע Assay או חיידקי העל זיהום או מספיק חומר ביופסיה הגידול. לכן הבקשה של assay אינו מוגבל תת סוג מסוים של סרטן השד.

מבחני טיפוסית (איור 1) לאחר 20 ימים קבוע בתרבות קולגן מוכתם לאחר מכן עבור cytokeratin. תוכנה Volocity הוא מסוגל לזהות גם את עיקר אפיתל רציפה עם ליבת המקורי קבוצות מנותקים פולשים לתאים ולכמת כל כרך בנפרד.

באיור 1. הפלישה מבחני הבאים קיבעון וכימות. Assay תומכת דגימות שהתקבלו תת סרטן השד מרובות: א) ER + b) HER2 + ג) ER-.

Discussion

קולגן מבוססי מבחני ללמוד את ההתנהגות של שורות תאים סרטניים נמצאים כעת בשימוש נרחב ^6,7,8. עם זאת, מבחני אלה לא בא לידי ביטוי במורכבות מלאה של הגידול וסביבתו. במחקר זה, אנו מראים כי חומרים סרטן השד אנושי יכול לשמש באופן דומה, לשעבר vivo. יתר על כן, הפלסטינים הכבושים הוא כלי שימושי כדי לאפיין את התפשטות 3D של סרטן השד. מצאנו כי המגבלה העיקרית של הטכניקה הזו הוא הזמינות של חומרים הגידול (יחיד הליבה ביופסיה מספיק עבור מבחני 4-6). גורם נוסף המגביל הוא כי הפלישה מבניים מתרחשת רק כ -40% של מבחני. כדי להתגבר על זה, אנחנו באופן קבוע להוסיף כל טיפול הרצוי סביב יום 7 לכל מבחני עם צמיחה גלוי.

השימוש של השטחים הכבושים ניתן יהיה להרחיב בעתיד גם לזהות שינויים בתפזורת, vivo לשעבר, הנובע טיפול תרופתי. זה בתורו יכול להקל בטיפול בסרטן פרטנית יותר, עצמאיים של מודלים של בעלי חיים. כרגע אנחנו בוחנים את התגובה של ER + גידולים vivo לשעבר טמוקסיפן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEGM Complete	Lonza Inc.	CC-3150
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8900 10X1L
β-–stradiol	Sigma-Aldrich	E8875-250MG
Rabbit anti-cytokeratin	Dako	Z0622
Goat anti-rabbit Alexa555	Invitrogen	A21422
All other standard reagents were obtained from Sigma-Aldrich.