Summary
हम एक कोलेजन आधारित विकसित किया है
Abstract
स्तन कैंसर के पश्चिमी दुनिया में मृत्यु दर का प्रमुख कारण है. यह अच्छी तरह से स्थापित है कि स्तन कैंसर के प्रसार, पहली बार स्थानीय और बाद में distally रोगी रोग का निदान में एक प्रमुख कारक है. स्तन कैंसर के प्रायोगिक प्रणाली सेल आमतौर पर प्राथमिक ट्यूमर या फुफ्फुस बहाव से व्युत्पन्न लाइनों पर भरोसा करते हैं. दो प्रमुख बाधाओं इस शोध में बाधा: (i) स्तन कैंसर (विशेषकर गरीब पूर्वानुमान luminal ट्यूमर बी) के उप - प्रकार में जाना जाता है चालू लाइन संग्रह के भीतर कुछ नहीं प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, (ii) ट्यूमर microenvironment के प्रभाव आम तौर पर खाते में नहीं लिया है.
हम संस्कृति के सभी प्रकार के उप प्राथमिक स्तन कैंसर के नमूनों के लिए एक तकनीक प्रदर्शित करता है. यह तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणाली में जो ट्यूमर के छोटे टुकड़े नरम चूहे कोलेजन मैं तकिये में एम्बेडेड रहे हैं का उपयोग करके हासिल की है. 2-3 सप्ताह के भीतर, ट्यूमर कोशिकाओं कोलेजन में फैला है और विभिन्न मानव tumours1 में मनाया उन लोगों के लिए इसी तरह की संरचनाओं के रूप में. व्यवहार्य adipocytes, मूल कोर के भीतर उपकला कोशिकाओं और fibroblasts ऊतक विज्ञान पर स्पष्ट थे. Squamoid आकारिकी के साथ घातक उपकला कोशिकाओं के आसपास के कोलेजन में हमलावर प्रदर्शन किया गया. परमाणु pleomorphism mitotic आंकड़े और apoptotic निकायों के साथ साथ, इन कोशिकाओं के भीतर स्पष्ट किया गया था.
हम ऑप्टिकल प्रोजेक्शन (ऑप्ट) टोमोग्राफी, एक 3 डी इमेजिंग तकनीक कार्यरत है क्रम में करने के लिए संस्कृति में ट्यूमर प्रसार की हद तक यों. हम ऑप्ट इस्तेमाल किया है ट्यूमर संस्कृति के थोक मात्रा को मापने के लिए, एक पैरामीटर नियमित रूप से नव - सहायक स्तन कैंसर के रोगियों के उपचार के दौरान मापा ड्रग थेरेपी के जवाब का आकलन है.
यहाँ, हम संस्कृति मानव स्तन ट्यूमर के लिए उप प्रकार के पूर्वाग्रह के बिना एक अवसर और वर्तमान उन पूर्व vivo के प्रसार यों . इस विधि भविष्य में इस्तेमाल किया जा सकता करने के लिए मूल ट्यूमर में दवा संवेदनशीलता यों. यह वर्तमान में इस्तेमाल किया सेल लाइनों की तुलना में अधिक भविष्य कहनेवाला मॉडल उपलब्ध करा सकता है.
Protocol
1. चूहा पूंछ से कोलेजन एक्स्ट्रेक्टिंग
- 70% इथेनॉल में जमे हुए ताजा चूहे की पूंछ रखें.
- एक स्केलपेल उजागर tendons के साथ overlying त्वचा Deglove.
- Tendons पूंछ और 70% इथेनॉल में जगह के लिए बाँझ से दूर पट्टी.
- वजन एकत्र tendons और एसिटिक एसिड (1g 250ml 0.5m एसिटिक एसिड के लिए पट्टा) स्थानांतरण. 4 में 48hr के लिए मिक्स डिग्री सेल्सियस
- 30min के लिए 10,000 ग्राम पर पट्टा / एसिटिक एसिड मिश्रण अपकेंद्रित्र और गोली त्यागें.
- सतह पर तैरनेवाला के 10% के बराबर मात्रा (w / v) NaCl जोड़ें और मिश्रण 4 में रात भर खड़े रहने के लिए अनुमति देते हैं डिग्री सेल्सियस
- 10,000 पर कोलेजन युक्त, अघुलनशील नीचे और एक और आगे 30min के लिए परत centrifugate लीजिए जी
- 4 में कोलेजन युक्त 0.25M एसिटिक एसिड में सामग्री डिग्री सेल्सियस Resuspend और 4 ° C में 1:1000 एसिटिक एसिड के खिलाफ 3 दिनों के लिए, dialyse दो बार दैनिक डायलिसिस बफर बदलने.
- इसके अलावा centrifugation (2hr के लिए 20,000 छ) और दुकान के द्वारा 4 पर कोलेजन समाधान को बाँझ ° सी.
- कोलेजन पतला बाँझ 1:1000, एसिटिक एसिड के अलावा के साथ 1mg/ml के एक शेयर एकाग्रता के लिए आवश्यक के रूप में.
2. 3D परख निर्माण
3D परख एक सेल लाइन परख पर आधारित है, 2 पहले प्रकाशित.
- एकाधिक कोर बायोप्सी इनवेसिव स्तन कैंसर के लिए उपचारात्मक शल्य लकीर के समय में रोगियों की सहमति से harvested रहे हैं.
- आँख से, 1mm 3 टुकड़े में एक स्केलपेल का उपयोग कोर विभाजित . छाँटो और macroscopically अलग वसा त्यागें.
- MEGM पूरा मीडिया में टुकड़े विसर्जित कर दिया. ऊतक इस राज्य में संग्रहीत किया जा सकता 1hr के लिए के लिए.
- बर्फ 1mg/ml चूहे की पूंछ कोलेजन पर कोलेजन जेल मिश्रण बनाने, 1:1000 फ़िल्टर एसिटिक एसिड, 10x DMEM/F12 और 3:5:1:1 के अनुपात में 0.22M NaOH 0.3 का एक अंतिम कोलेजन एकाग्रता बनाने के लिए मिलीग्राम / एमएल.
- 37 पर एक 24 अच्छी तरह से और एक इनक्यूबेटर में थाली जगह के अलग - अलग कुओं में कोलेजन मिश्रण की 1.2ml ° सी 10min के लिए इंजेक्षन करने के लिए बीच बढ़िया तालमेल आरंभ.
- 10min के बाद, मशीन से 24 अच्छी तरह से थाली हटा. बीच बढ़िया तालमेल कोलेजन पर ट्यूमर के टुकड़े प्लेस और धीरे से उन्हें एक 10μl विंदुक टिप का उपयोग जेल के केंद्र में धक्का. 1hr लिए इनक्यूबेटर के लिए अच्छी तरह से थाली 24 लौटें.
- ईआर + ट्यूमर के लिए, 3.2x10 -10 एम. के एक एकाग्रता के लिए β oestradiol साथ MEGM पूरा मीडिया के पूरक एक बार जेल assays 1hr लिए gelled है, ध्यान से प्रत्येक में अच्छी तरह से पूरक मीडिया के 1.2ml परिचय. परख के भीतर अंतिम एकाग्रता β-oestradiol 1.6x10 -10 एम equilibriate शारीरिक एस्ट्रोजन स्तन ऊतक 3 में पाया स्तर की पुनरावृत्ति करना होगा .
- प्रत्येक अच्छी तरह के भीतर बढ़त के चारों ओर एक 10μl पिपेट टिप, प्रत्येक जेल circumferentially जारी, इस प्रकार प्रत्येक जेल स्वतंत्र रूप से मीडिया के भीतर फ्लोट करने की अनुमति चलाएँ. इनक्यूबेटर करने के लिए 24 अच्छी तरह से थाली लौटें.
- विनिमय मीडिया में दो बार प्रयोग की समाप्ति तक साप्ताहिक पूरक. मीडिया को हटाने और एक formalin लगानेवाला जोड़ने के द्वारा प्रयोग बर्खास्त.
3. तैयारी में परख के ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी के लिए एंटीबॉडी धुंधला
हम पूरे नमूना धुंधला 4 के लिए एक पहले प्रकाशित विधि को अपनाया है .
- पीबीएस में 30min के लिए formalin तय नमूनों धो लें. पीबीएस 0.05% बीच 20 (0.05% PBST) से युक्त 33%, 66%, और हर कदम पर 15min ≥ के लिए 100%: पतला मेथनॉल में stepwise जैल निर्जलीकरण.
- 30% एच 2 2 हे 02:01:03 के अनुपात (15% v / v 2 एच 2 हे) 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर autofluorescence बुझाने में: DMSO: हौसले से तैयार MeOH में ऊतक सेते हैं.
- मेथनॉल में 30min के लिए नमूनों को दो बार धो. -80 ° सुलभ सी कम से कम हर बार 1hr और कमरे के तापमान (आर टी) वापस लिए पांच बार गाया हैं कि ऊतक के गहरे भागों में प्रतिजनों सुनिश्चित करने के लिए नमूने रुक.
- ऊतक मंदक के रूप में मेथनॉल (33%, 66% और हर कदम पर 15min के लिए 100%) के साथ 0.05% PBST वापस rehydrate.
- 24 घंटे के लिए समाधान (10% 0.05% PBST में सीरम) अवरुद्ध में ऊतक ब्लॉक.
- प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक सेते उपकला सामग्री की पहचान करने के लिए, 1:500 के एक एकाग्रता अवरुद्ध 48hr के लिए 5% DMSO युक्त समाधान के 1.5ml में पतला पर विरोधी cytokeratin का उपयोग खरगोश.
- चार बार के नमूने 30min प्रत्येक के लिए 0.05% PBST के साथ धोएं.
- फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी (1:100 बकरी Alexa555 विरोधी खरगोश), 1.5ml अवरुद्ध 48hr के लिए 5% DMSO युक्त समाधान में पतला के साथ ऊतक सेते हैं.
- 0.05% 30min प्रत्येक के लिए PBST चार बार के साथ नमूनों को फिर से धो लें.
4. ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी
ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी एक माइक्रोस्कोपी पहले से विकसित तकनीक के लिए 5 15 मिलीमीटर की मोटाई के साथ फ्लोरोसेंट जैविक नमूनों के उच्च संकल्प 3 डी छवियों का उत्पादन है.
- एस पर्वत1% कम पिघलने बिंदु agarose में tained जेल और 24 घंटे के लिए 100% मेथनॉल में निर्जलीकरण. Babb समाधान (01:02 लोबान शराब, लोबान benzoate) में 48hr के लिए नमूना और साफ़ ऑप्ट 3001M स्कैनर (Bioptonics) का उपयोग स्कैन.
- दोनों लक्ष्य और autofluorescence Cy3 फ़िल्टर सेट (उत्तेजक 545nm/30 एनएम, emitter 610/75 एनएम) और GFP1 फिल्टर (उत्तेजक 425nm/40 एनएम, emitter LP475 एनएम) क्रमशः सेट का उपयोग करने के लिए कब्जा कर रहे हैं.
5. पुनर्निर्माण और 3 डी मात्रा का ठहराव
- कोणीय ऑप्ट द्वारा अधिग्रहीत अनुमानों के सेट NRecon सॉफ्टवेयर (SkyScan) का उपयोग करने के लिए आक्रमण परख के माध्यम से पार अनुभाग स्लाइस की एक श्रृंखला बनाने के खंगाला जा सकता है. इस सॉफ्टवेयर पर मुक्त करने के लिए डाउनलोड उपलब्ध है http://www.skyscan.be/products/downloads.htm .
- खंगाला Volocity सॉफ्टवेयर (PerkinElmer) का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण. नि: शुल्क प्रदर्शन सॉफ्टवेयर पर डाउनलोड के लिए उपलब्ध है http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/.
- आदेश में cytokeratin धुंधला द्वारा उपकला मात्रा मात्रा ठहराना करने के लिए, एक न्यूनतम voxel तीव्रता लक्ष्य चैनल में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से हस्तक्षेप कम दहलीज सेट. हम इस सीमा से empirically 9000 au में परिभाषित माप आवेदन में उपलब्ध मापदंडों की एक सूची का उपयोग करना, हम मूल कोर (autofluorescent चैनल में सीमांकन) के साथ निरंतरता में उपकला की मात्रा मात्रा निर्धारित यह हमें उपकला परिणाम की मात्रा के बीच अलग मात्रा ठहराना करने के लिए अनुमति दी. ट्यूमर के नमूनों.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
परख के विकास के दौरान कुल 52 स्तन कैंसर के एक बायोप्सी ऊतकविकृतिविज्ञानी की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ नमूनों का इस्तेमाल किया गया है. इनमें से 10% (5 / 52) के लिए कम से कम एक व्यवहार्य आक्रमण परख प्रदान करने में विफल रहा है. परख विफलता या तो ऊपर अर्थ का उपसर्ग संक्रमण बैक्टीरिया या अपर्याप्त ट्यूमर बायोप्सी सामग्री की वजह से किया गया था. इसलिए परख के आवेदन के स्तन कैंसर के एक विशिष्ट उप प्रकार तक सीमित नहीं है.
विशिष्ट assays (1 आंकड़ा) कोलेजन संस्कृति में 20 दिनों के बाद तय की और बाद में cytokeratin के लिए दाग. Volocity सॉफ्टवेयर दोनों उपकला मूल कोर और कोशिकाओं हमलावर की अलग समूहों के साथ लगातार थोक समझते हैं और यों तो प्रत्येक अलग - अलग मात्रा में सक्षम है.
चित्रा 1 निर्धारण और मात्रा का ठहराव के बाद आक्रमण assays . परख कई स्तन कैंसर उपप्रकारों से प्राप्त नमूनों का समर्थन करता है: क) ईआर + ख) HER2 + और ग) ईआर.
Discussion
कोलेजन - आधारित assays के कैंसर कोशिका लाइनों के व्यवहार का अध्ययन अब व्यापक रूप से कर रहे हैं 6,7,8 इस्तेमाल किया. बहरहाल, इन assays ट्यूमर और उसके वातावरण से भरा जटिलता में परिलक्षित नहीं है. इस अध्ययन में, हम बताते हैं कि मानव स्तन कैंसर सामग्री एक समान तरीके से, पूर्व vivo में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, ऑप्ट स्तन कैंसर के विस्तार 3D विशेषताएँ करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है. हमने पाया है कि इस तकनीक का मुख्य सीमा ट्यूमर सामग्री (एक एकल कोर बायोप्सी 4-6 assays के लिए पर्याप्त है) की उपलब्धता है. एक और सीमित कारक है कि संरचनात्मक आक्रमण assays के बारे में 40% में होता ही है. इस पर काबू पाने के लिए, हम नियमित रूप से दिखाई वृद्धि के साथ सभी assays के लिए 7 दिन के आसपास किसी भी वांछित उपचार जोड़ने.
ऑप्ट के उपयोग भविष्य में बढ़ाया जा सकता है भी थोक परिवर्तन, पूर्व vivo, नशीली दवाओं के उपचार से उत्पन्न का पता लगाने. यह बदले में और अधिक individualized कैंसर के उपचार की सुविधा, पशु मॉडल की स्वतंत्र. हम वर्तमान में ईआर + ट्यूमर के tamoxifen पूर्व vivo के जवाब तलाश रहे हैं .
Disclosures
और SEW JF MRC प्रौद्योगिकी, जो Bioptonics ऑप्ट स्कैनर है commercializing द्वारा नियोजित कर रहे हैं. अन्य लेखकों ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा.
Acknowledgments
हम उसे चिकित्सीय नमूनों को प्राप्त करने में अमूल्य सहायता के लिए Lorna Renshaw (एडिनबर्ग स्तन यूनिट) धन्यवाद.
ट्यूमर सामग्री के उपयोग लोथियन अनुसंधान आचार समिति (08/S1101/41) द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगात्मक कैंसर चिकित्सा केंद्र कार्यक्रम (एडिनबर्ग) के तत्वावधान प्राप्त है.
इस काम स्कॉटिश अनुदान परिषद द्वारा समर्थित है. ADL मिस मार्गरेट butters Reekie ट्रस्ट नैदानिक साथी है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGM Complete | Lonza Inc. | CC-3150 | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8900 10X1L | |
| β-–stradiol | Sigma-Aldrich | E8875-250MG | |
| Rabbit anti-cytokeratin | Dako | Z0622 | |
| Goat anti-rabbit Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
| All other standard reagents were obtained from Sigma-Aldrich. | |||
References
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