Summary
Abbiamo sviluppato una base di collagene
Abstract
Il cancro al seno è una delle principali cause di mortalità nel mondo occidentale. E 'ben noto che la diffusione del tumore al seno, prima localmente e poi distalmente, è un fattore importante nella prognosi dei pazienti. Sistemi sperimentali di tumore al seno si basano su linee cellulari derivate da tumori di solito primaria o versamento pleurico. Due gli ostacoli principali ostacolare questa ricerca: (i) alcune note sotto-tipi di tumori al seno (in particolare scarsa prognosi dei tumori luminale B) non sono rappresentati all'interno di raccolte di linea corrente, (ii) l'influenza del microambiente tumorale di solito non è presa in considerazione.
Dimostriamo una tecnica per i campioni del cancro al seno primario cultura di tutti i sub-tipi. Questo è ottenuto utilizzando tridimensionale (3D) sistema di coltura in cui sono inserite piccole parti di tumore nel ratto collagene I cuscini morbidi. Entro 2-3 settimane, le cellule tumorali diffuse nel collagene e forma diverse strutture simili a quelli osservati in tumours1 umano. Adipociti vitali, le cellule epiteliali e fibroblasti all'interno del nucleo originario erano evidenti sulla istologia. Maligna delle cellule epiteliali con morfologia squamoidi sono state dimostrate in invadendo il collagene circostante. Pleomorfismo nucleare era evidente all'interno di queste cellule, insieme a figure mitotiche e corpi apoptotici.
Abbiamo impiegato Tomografia Ottica di proiezione (OPT), una tecnologia di imaging 3D, al fine di quantificare l'entità della diffusione del tumore nella cultura. Abbiamo usato OPT per misurare il volume della cultura di massa del tumore, un parametro di routine misurati durante la terapia neo-adiuvante dei pazienti con cancro al seno per valutare la risposta alla terapia farmacologica.
Qui, vi presentiamo l'opportunità di tumori al seno cultura umana, senza sotto-tipo di polarizzazione e quantificare la diffusione di questi ex-vivo. Questo metodo potrebbe essere utilizzato in futuro per quantificare la sensibilità ai farmaci nel tumore originale. Questo può fornire un modello più predittivo di linee cellulari attualmente in uso.
Protocol
1. Estrarre collagene da Tails Rat
- Luogo fresco congelato code di ratto in etanolo al 70%.
- Deglove la cute sovrastante i tendini con un bisturi esporre.
- Striscia tendini dalla coda e il luogo in etanolo al 70% per sterilizzare.
- Pesare i tendini raccolta e trasferimento in acido acetico (tendine 1g per 250 ml di acido acetico 0,5 M). Mescolare per 48 ore a 4 ° C.
- Centrifugare il mix acido tendine / acetico a 10.000 g per 30 minuti e scartare il pellet.
- Aggiungere un volume equivalente del 10% (w / v) di NaCl il supernatante e lasciare il mix riposare per una notte a 4 ° C.
- Raccogliere il collagene ricchi, strato insolubile fondo e centrifugato per un ulteriore 30 min a 10.000 g
- Risospendere il collagene materiale ricco in acido acetico 0.25M a 4 ° C e dializzato contro 1:1000 acido acetico al 4 ° C per 3 giorni, cambiando il buffer di dialisi due volte al giorno.
- Sterilizzare ulteriormente la soluzione di collagene per centrifugazione (20.000 g per 2 ore) e conservare a 4 ° C.
- Diluire collagene come richiesto con l'aggiunta di acido sterile 1:1000 acetico ad una concentrazione stock di 1mg/ml.
2. Saggio di creazione 3D
L'analisi 3D è basato su una linea cellulare saggio, pubblicato in precedenza 2.
- Biopsie multiple core vengono raccolte da pazienti consenzienti al momento della resezione chirurgica curativa per il tumore mammario invasivo.
- Ad occhio, dividere i nuclei con un bisturi in 1 millimetro 3 frammenti. Tagliare ed eliminare il grasso macroscopicamente distinte.
- Immergere i frammenti in MEGM mezzi di comunicazione completa. Il tessuto può essere immagazzinato in questo stato per un massimo di 1 ora.
- Per creare il gel di collagene, mix sul collagene ghiaccio coda di topo 1mg/ml, 1:1000 filtrato acido acetico, 10x DMEM/F12 e NaOH 0.22M in un rapporto di 3:5:1:1 per creare una concentrazione finale di 0,3 collagene mg / ml.
- Iniettare 1,2 ml di miscela di collagene nei singoli pozzetti di una piastra ben 24 e riporre in un incubatore a 37 ° C per 10 minuti per iniziare gelificante.
- Dopo 10 minuti, rimuovere la piastra ben 24 dal termostato. Mettere i pezzi tumore al collagene gelificazione e delicatamente spingere al centro del gel con una punta 10μl pipetta. Ritorna il piatto ben 24 per l'incubatore per 1 ora.
- Per i tumori ER +, supplemento MEGM mezzi Completo di β-estradiolo a una concentrazione di 3.2x10 -10 M. Una volta che i saggi di gel hanno gelificato per 1 ora, con attenzione introdurre 1,2 mL del supporto integrato in ciascun pozzetto. La finale β-estradiolo concentrazione all'interno del saggio sarà equilibriate di 1.6x10 -10 m di ricapitolare i livelli di estrogeni fisiologici trovato nel tessuto mammario 3.
- Eseguire una punta 10μl pipetta attorno al bordo interno di ogni bene, rilasciando ogni gel circonferenza in modo che ciascuno gel di galleggiare liberamente all'interno dei media. Ritorna il piatto ben 24 per l'incubatrice.
- Scambio integrato dei media due volte alla settimana fino al termine dell'esperimento. Interrompere l'esperimento, eliminando i media e l'aggiunta di un fissativo formalina.
3. La colorazione degli anticorpi del saggio in preparazione per la Tomografia Ottica di proiezione
Abbiamo adottato un metodo precedentemente pubblicato per 4 intera colorazione del campione.
- Lavare campioni fissati in formalina per 30 min in PBS. Disidratare i gel graduale in metanolo diluito in PBS contenente 0,05% di Tween 20 (0,05% PBST): 33%, 66% e 100% per ≥ 15 minuti ad ogni passo.
- Incubare il tessuto in appena preparato MeOH: DMSO: 30% H 2 O 2 ad un rapporto di 2:01:03 (15% v / v H 2 O 2) a temperatura ambiente per 24 ore per spegnere l'autofluorescenza.
- Lavare i campioni due volte per 30 minuti in metanolo. Congelare i campioni a -80 ° C cinque volte per almeno 1 ora ogni volta e torna a temperatura ambiente (RT) per assicurare che gli antigeni nelle parti più profonde del tessuto sono resi accessibili.
- Reidratare il tessuto torna al 0,05% PBST con metanolo come diluente (33%, 66% e 100% per 15 minuti ad ogni passo).
- Bloccare il tessuto nel bloccare soluzione (10% di siero in PBST 0,05%) per 24 ore.
- Incubare il tessuto con l'anticorpo primario per identificare il contenuto epiteliali, utilizzando coniglio anti-citocheratina ad una concentrazione di 1:500 diluito in 1,5 ml di soluzione bloccante contenente il 5% DMSO per 48 ore.
- Lavare i campioni quattro volte con PBST 0,05% per ogni 30 min.
- Incubare il tessuto fluorescente con anticorpo secondario (1:100 capra anti-coniglio Alexa555), diluito in 1,5 ml soluzione bloccante contenente il 5% DMSO per 48 ore.
- Lavare i campioni di nuovo con 0,05% PBST quattro volte per 30 minuti ciascuno.
4. Proiezione Tomografia ottica
Tomografia ottica di proiezione è una tecnica di microscopia precedentemente sviluppato per produrre immagini 3D ad alta risoluzione di campioni biologici fluorescente con uno spessore fino a 15 millimetri 5.
- Montare il sgel mantenuto in 1% di agarosio a basso punto di fusione e disidratare in 100% di metanolo per 24 ore. Cancella il campione in BABB soluzione (1:2 alcool benzilico, benzil benzoato) per 48 ore e la scansione con lo scanner OPT 3001M (Bioptonics).
- Bersaglio e autofluorescenza vengono catturati utilizzando il Cy3 set di filtri (eccitatore 545nm/30 nm, emettitore 610/75 nm) e GFP1 set di filtri (eccitatore 425nm/40 nm, emettitore LP475 nm) rispettivamente.
5. Ricostruzione e quantificazione 3D
- L'insieme di proiezioni angolari acquisita da OPT può essere ricostruita utilizzando NRecon software (SkyScan) per creare una serie di fette di sezione trasversale attraverso l'analisi invasione. Questo software è disponibile per il download gratuito a http://www.skyscan.be/products/downloads.htm .
- Analizzare i dati ricostruiti utilizzando un software Volocity (PerkinElmer). Software dimostrativo gratuito è disponibile per il download all'indirizzo http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/ .
- Al fine di quantificare il volume epiteliali dalla colorazione citocheratina, impostare una soglia minima di intensità voxel per ridurre le interferenze da fluorescenza di fondo nel canale di destinazione. Abbiamo definito questa soglia empiricamente a 9000 au Utilizzando un elenco dei parametri disponibili nella richiesta di misura, abbiamo quantificato il volume di epitelio in continuità con il nucleo originario (delimitata nel canale autofluorescenti). Questo ci ha permesso di quantificare i volumi di escrescenza epiteliali tra le diverse campioni di tumore.
6. Rappresentante dei risultati:
Durante lo sviluppo del test, un totale di 52 campioni di tumore della mammella biopsia con una vasta gamma di istopatologia sono stati utilizzati. Di questi <10% (5 / 52) non è riuscito a fornire almeno un test valido invasione. Fallimento del test è dovuto a uno sovra-infezione batterica o insufficiente materiale tumorale biopsia. Pertanto l'applicazione del test non è limitato a uno specifico sottotipo di tumore al seno.
Saggi tipici (figura 1) fissato dopo 20 giorni in cultura collagene e successivamente colorati per citocheratina. Il software Volocity è in grado di riconoscere sia il grosso epiteliale continuo con il nucleo originario e gruppi distaccata di invadere le cellule e quantificare ogni volume separatamente.
Figura 1. Saggi Invasion dopo la fissazione e la quantificazione. Il saggio sostiene campioni ottenuti da più sottotipi cancro al seno: a) ER + b) HER2 + e c) ER-.
Discussion
A base di collagene saggi per studiare il comportamento delle linee di cellule tumorali sono ora ampiamente utilizzate 6,7,8. Tuttavia, queste analisi non hanno riflesso in pieno la complessità del tumore e del suo ambiente. In questo studio, abbiamo dimostrato che il cancro al seno umano i materiali possono essere usati in modo simile, ex vivo. Inoltre, OPT è un utile strumento per caratterizzare l'espansione 3D di cancro al seno. Abbiamo scoperto che il limite principale di questa tecnica è la disponibilità di materiali tumore (un unico nucleo biopsia è sufficiente per 4-6 test). Un altro fattore limitante è che l'invasione strutturale si verifica solo nel 40% dei test. Per ovviare a questo, abbiamo regolarmente aggiungere qualsiasi trattamento desiderato intorno al giorno 7 per tutti i test con una crescita visibile.
L'uso di OPT potrebbe essere estesa in futuro anche per rilevare i cambiamenti di massa, ex vivo, derivante dalla terapia farmacologica. Ciò a sua volta potrebbe facilitare la terapia del cancro più individualizzata, indipendente di modelli animali. Stiamo attualmente valutando la risposta dei tumori ER + a tamoxifene ex vivo.
Disclosures
SEW e JF sono dipendenti di MRC Technology, che sta commercializzando Bioptonics scanner OPT. Altri autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo Lorna Renshaw (Breast Unit di Edimburgo) per la sua preziosa assistenza per ottenere campioni clinici.
Utilizzo di materiale tumorale è stato approvato dal Comitato Etico di ricerca Lothian (08/S1101/41) e ottenuto sotto l'egida del Centro di Medicina Sperimentale Cancer programma (Edimburgo).
Questo lavoro è supportato dal Consiglio scozzese finanziamento. ADL è una signorina Margaret Butters Reekie compagni Fiducia clinica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGM Complete | Lonza Inc. | CC-3150 | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8900 10X1L | |
| β-–stradiol | Sigma-Aldrich | E8875-250MG | |
| Rabbit anti-cytokeratin | Dako | Z0622 | |
| Goat anti-rabbit Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
| All other standard reagents were obtained from Sigma-Aldrich. | |||
References
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