Longo prazo Cultura de Amostras de mama Humano do Câncer e sua análise por meio de tomografia óptica de Projeção

Summary

Nós desenvolvemos um à base de colágeno

Abstract

Câncer de mama é uma das principais causas de mortalidade no mundo ocidental. Está bem estabelecido que a propagação do câncer de mama, primeiro localmente e, mais tarde distalmente, é um fator importante no prognóstico do paciente. Sistemas experimentais de câncer de mama dependem de linhas de células normalmente derivadas de tumores primários ou derrame pleural. Dois grandes obstáculos dificultam esta pesquisa: (i) alguns conhecidos sub-tipos de cânceres de mama (principalmente pobres prognóstico tumores luminal B) não estão representados em colecções linha atual, (ii) a influência do microambiente do tumor geralmente não é tido em conta.

Nós demonstramos uma técnica para a cultura amostras de câncer de mama primário de todos os tipos de sub-. Isto é conseguido usando sistema tridimensional de cultura (3D) em que pequenos pedaços de tumor são incorporados no colágeno de ratos macio eu almofadas. Dentro de 2-3 semanas, as células cancerígenas se espalham para o colágeno e formam várias estruturas semelhantes aos observados em tumours1 humana. Adipócitos viável, células epiteliais e fibroblastos dentro do núcleo original eram evidentes na histologia. Células epiteliais malignas com morfologia squamoid foram demonstradas em invadir o colágeno circundante. Pleomorfismo nuclear era evidente dentro dessas células, juntamente com figuras de mitose e corpos apoptóticos.

Nós empregamos Tomografia projeção óptica (OPT), uma tecnologia de imagem 3D, a fim de quantificar o grau de disseminação do tumor em cultura. Temos usado OPT para medir o volume maior da cultura tumor, um parâmetro rotineiramente medidas durante o tratamento neo-adjuvante de pacientes com câncer de mama para avaliar a resposta à terapia medicamentosa.

Aqui, apresentamos uma oportunidade de tumores de mama humano sem cultura sub-tipo de preconceito e quantificar a propagação dos ex vivo. Este método poderia ser usado no futuro para quantificar a sensibilidade da droga no tumor original. Isso pode fornecer um modelo mais preditivo do que linhas celulares usados ​​atualmente.

Protocol

1. Extração de colágeno de Tails Rat

1. Lugar fresco congelado rabos de rato em etanol 70%.
2. Deglove a pele sobrejacente com um bisturi expondo tendões.
3. Faixa de tendões longe de cauda e colocar em etanol 70% para esterilizar.
4. Pesar os tendões coletados e transferidos para o ácido acético (1g tendão ao ácido acético 0,5 M 250ml). Mix de 48hr a 4 ° C.
5. Centrifugar a mistura de ácido tendão / acético a 10.000 g por 30min e descartar o pellet.
6. Adicionar um volume igual a 10% (w / v) NaCl para o sobrenadante e deixar a mistura repousar uma noite a 4 ° C.
7. Recolher as ricas em colágeno, camada inferior insolúveis e centrifugado para um mais 30min a 10.000 g.
8. Ressuspender o material rico em colágeno em ácido acético 0,25 m a 4 ° C e dialyse contra 1:1000 ácido acético a 4 ° C por 3 dias, mudando o tampão de diálise duas vezes por dia.
9. Além disso esterilizar a solução de colágeno por centrifugação (20.000 g para 2hr) e armazenar a 4 ° C.
10. Diluir colágeno conforme requerido, com a adição de ácido acético 1:1000 estéril a uma concentração de ações de 1mg/ml.

2. 3D Criação de Ensaio

O ensaio 3D é baseado em um ensaio de linha celular, publicado anteriormente ^2.

1. Biópsias múltiplas são colhidas consentindo pacientes no momento da ressecção cirúrgica curativa para o câncer de mama invasivo.
2. Por olho, divide os núcleos com um bisturi em um milímetro ^três fragmentos. Guarnição e descartar gordura macroscopicamente distintos.
3. Mergulhe os fragmentos em MEGM mídia completa. O tecido pode ser armazenado neste estado por até 1h.
4. Para criar o gel de colágeno mix, no gelo colágeno da cauda de rato 1mg/ml, 1:1000 ácido acético filtrada, DMEM/F12 10x e 0,22 m NaOH em uma proporção de 3:5:1:1 para criar uma concentração de colágeno final de 0,3 mg / ml.
5. Injetar 1,2 ml da mistura de colágeno em poços individuais de uma placa de 24 poços e coloque em uma incubadora a 37 ° C por 10 min para iniciar gelificação.
6. Após 10min, retire a placa de 24 poços da incubadora. Coloque os pedaços de tumor para o colágeno gelificação e suavemente empurrá-los para o centro do gel usando uma ponteira 10μl. Devolver a placa de 24 poços para a incubadora de 1hr.
7. Para ER + tumores, suplemento MEGM media completo com β-estradiol a uma concentração de 3.2x10 ^-10 M. Uma vez que os ensaios de gel têm gel para 1hr, cuidadosamente introduzir 1,2 ml do meio suplementado em cada poço. A concentração de β-estradiol final no ensaio vai para equilibriate 1.6x10 M ^-10 a recapitular os níveis de estrogênio fisiológicas encontradas no tecido mamário ^3.
8. Executar uma ponteira 10μl em torno da borda interna de cada bem, liberando cada gel circunferencialmente, permitindo assim que cada gel para flutuar livremente na mídia. Devolver a placa de 24 poços para a incubadora.
9. Troca complementada media duas vezes por semana até o término do experimento. Rescindir o experimento através da remoção de mídia e adicionando um fixador formalina.

3. Coloração de anticorpos de Ensaio em preparação para Tomografia projeção óptica

Adotamos um método previamente publicados por ⁴ toda amostra de coloração.

1. Lavar formol espécimes fixados por 30min em PBS. Desidratar o gel stepwise em metanol diluído em PBS contendo 0,05% Tween 20 (PBST 0,05%): 33%, 66% e 100% para ≥ 15min em cada etapa.
2. Incubar o tecido em MeOH preparados na hora: DMSO: 30% H ₂ O ₂ em uma proporção de 02:01:03 (15% v / v H ₂ O ₂₎ em temperatura ambiente por 24 horas para saciar a autofluorescência.
3. Lavar as amostras duas vezes por 30min em metanol. Congelar as amostras a -80 ° C cinco vezes por pelo menos 1 hora de cada vez e de volta à temperatura ambiente (RT) para garantir que os antígenos nas partes mais profundas do tecido são tornados acessíveis.
4. Reidratar o tecido de volta para PBST 0,05% com metanol como solvente (33%, 66% e 100% por 15 min em cada etapa).
5. Bloquear o tecido em solução de bloqueio (10% de soro em PBST 0,05%) para 24 horas.
6. Incubar o tecido com o anticorpo primário para identificar o conteúdo epiteliais, usando de coelho anti-citoqueratina na concentração de 1:500 diluídos em 1,5 ml de solução bloqueadora contendo DMSO 5% para 48hr.
7. Lavar as amostras quatro vezes com PBST 0,05% para cada 30min.
8. Incubar o tecido com anticorpo fluorescente secundário (1:100 cabra anti-coelho Alexa555), diluído em solução de bloqueio de 1,5 ml contendo DMSO 5% para 48hr.
9. Lavar as amostras novamente com PBST 0,05% quatro vezes por 30min cada.

4. Tomografia projeção óptica

Tomografia projeção óptica é uma técnica de microscopia previamente desenvolvido para produzir imagens de alta resolução em 3D de espécimes biológicos fluorescentes com uma espessura de até 15 milímetros ^5.

1. Monte o sgel sustentado em 1% agarose baixo ponto de fusão e desidratação em metanol 100% para 24h. Limpar o espécime em Babb solução (1:2 álcool benzílico, Benzoato de benzilo) para 48hr e digitalizar usando o OPT Scanner 3001M (Bioptonics).
2. Alvo e autofluorescência são capturados usando o conjunto de Cy3 filtro (excitador 545nm/30 nm, emissor 610/75 nm) e GFP1 conjunto de filtros (excitador 425nm/40 nm, emissor LP475 nm), respectivamente.

5. Reconstrução e quantificação em 3D

1. O conjunto de projeções angular adquirida pela OPT pode ser reconstruído usando NRecon software (SkyScan) para criar uma série de fatias de seção transversal através do ensaio de invasão. Este software está disponível para download gratuitamente no http://www.skyscan.be/products/downloads.htm .
2. Analisar os dados reconstruídos usando software Volocity (PerkinElmer). Software de demonstração gratuita está disponível para download em http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/ .
3. Para quantificar o volume epiteliais através da coloração citoqueratina, definir um limite de intensidade mínima voxel para reduzir a interferência da fluorescência de fundo no canal alvo. Definimos esse limite empiricamente em 9000 au Usando uma lista de parâmetros disponíveis no aplicativo de medição, nós quantificamos o volume de epitélio em continuidade com o núcleo original (demarcadas no canal autofluorescent). Isso nos permitiu quantificar volumes de crescimento epitelial entre diferentes amostras de tumor.

6. Resultados representativos:

Durante o desenvolvimento do ensaio, um total de 52 biópsias de câncer de mama com uma ampla gama de estudos histopatológicos, foram utilizados. Destes <10% (5 / 52) não conseguiram fornecer pelo menos um ensaio de invasão viável. Falha ensaio foi devido a qualquer bacteriana supra-infecção ou insuficiente tumor material de biópsia. Portanto, aplicação do ensaio não está restrito a um subtipo específico de cancro da mama.

Ensaios típico (figura 1) fixo após 20 dias na cultura de colágeno e, posteriormente, coradas para citoqueratina. Volocity software é capaz de reconhecer tanto a granel, a epitelial contínua com o núcleo original e grupos destacados de invadir células e quantificar cada volume separadamente.

Figura 1. Ensaios Invasion seguintes fixação e quantificação. O ensaio suporta amostras obtidas a partir de múltiplos subtipos de câncer de mama: a) ER + b) HER2 + e c) ER-.

Discussion

À base de colágeno ensaios para estudar o comportamento de linhagens de células de câncer são hoje amplamente utilizadas ^6,7,8. No entanto, estas análises não têm refletido na complexidade do total do tumor e seu ambiente. Neste estudo, nós mostramos que materiais câncer de mama humano pode ser usado de uma maneira similar, ex vivo. Além disso, OPT é uma ferramenta útil para caracterizar a expansão 3D de câncer de mama. Descobrimos que a principal limitação desta técnica é a disponibilidade de materiais tumor (um único núcleo biópsia é suficiente para 4-6 ensaios). Outro fator limitante é que a invasão estrutural ocorre apenas em cerca de 40% dos ensaios. Para superar isso, nós regularmente adicionar qualquer tipo de tratamento desejado por volta do dia 7 para todos os ensaios com o crescimento visível.

O uso do OPT poderia ser estendido no futuro para também detectar alterações em massa, ex vivo, resultantes do tratamento da toxicodependência. Este por sua vez, poderia facilitar o tratamento do câncer mais individualizada, independente de modelos animais. Estamos a explorar a resposta de tumores ER + ao tamoxifeno ex vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEGM Complete	Lonza Inc.	CC-3150
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8900 10X1L
β-–stradiol	Sigma-Aldrich	E8875-250MG
Rabbit anti-cytokeratin	Dako	Z0622
Goat anti-rabbit Alexa555	Invitrogen	A21422
All other standard reagents were obtained from Sigma-Aldrich.