Summary
Abstract
المناعية (IHC) هي تقنية تستخدم لحصر قيمة / تصور بروتين تعبير في قسم الأنسجة المركبة باستخدام الاجسام المضادة المحددة. هناك طريقتين : الطريقة المباشرة وغير المباشرة. في هذه التجربة ، فإننا سوف تصف فقط استخدام تلطيخ IHC غير المباشرة. IHC غير المباشرة تلطيخ يستخدم محددة للغاية الأضداد الابتدائي والثانوي والبيوتين مترافق. وتستخدم الأجسام المضادة الأولية لتحديد البروتينات بتحفظ الاهتمام من جانب ملزم لحاتمة محددة ، في حين أن الأجسام المضادة الثانوية طرح لتلوين الخلفية غير محددة وتضخيم إشارة من خلال تشكيل المجمعات إلى الضد الابتدائي. إما أن تكون شرائح المتولدة من الفروع المجمدة ، وجزءا لا يتجزأ من البارافين أو المقاطع التي شنت على الشرائح الزجاجية. في هذا البروتوكول ، نناقش إعداد المقاطع البارافين مضمن بواسطة الماء ، dewaxing باستخدام التدرج الكحول ، واسترجاع الحرارة الناجمة عن مستضد ، وعرقلة النشاط البيروكسيداز المحلية والمنظمات غير محددة المواقع ملزمة. هي ملطخة ثم بعض المقاطع مع الأجسام المضادة المحددة للعلامة الخلايا التائية CD8 وبينما البعض الآخر لالملون هيدروكسيلاز التيروزين. بعد ذلك يتم التعامل مع الشرائح الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمترافق البيوتين ، ثم تطورت باستخدام أفيدين - مترافق البيروكسيداز الفجل (HRP) مع Diaminiobenzidine (DAB) والركيزة. التالية التنمية ، هي counterstained الشرائح للالنقيض من ذلك ، والتي شنت تحت coverslips مع permount. بعد تجفيف كافية ، وهذه الشرائح هي ثم جاهزة للتصوير.
Protocol
تلطيخ أقسام البارافين
- Dewax الشرائح مع الزيلين (فيشر X3 S -4) 3X لمدة 5 دقائق لكل منها (الزيلين تغيير كل شهر اعتمادا على الاستخدام والزيلين والسامة). أدلى استخدام الأطباق ويغطي لمدة 20 شرائح من المرجع فيشر 08-812 - 1A ورفوف لاحتواء هذه الأطباق. 200 مل السائل في الطبق.
- هيدرات من خلال التدرج الكحول على النحو التالي (تغيير التدرج كل أسبوعين 2) :
- 2X في الإيثانول بنسبة 100 ٪ (فيشر # A406 - 20) لمدة 2 دقيقة لكل
- 2X في الإيثانول 95 ٪ لمدة 2 دقيقة لكل
- 1X في الإيثانول 70 ٪ لمدة 2 دقيقة
- 1X في الإيثانول 50 ٪ لمدة 2 دقيقة
- 1X في الإيثانول 30 ٪ لمدة 2 دقيقة
- 1X DDH 2 O 2 دقيقة عن
- نقع في DPBS لمدة 5 دقائق (DPBS = الفوسفات Dulbecco لتعديل التخزين المؤقت المالحة مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 +).
مستضد الاسترداد :
- قبل الحرارة العازلة نا السيترات (10 ملم ، ودرجة الحموضة 6.5) في فرن الميكروويف.
- طهي الشرائح لمدة 15 دقيقة في فرن الميكروويف. وينبغي أن الشرائح أبدا الجافة حتى تحقق كل دقيقة وإضافة نا السيترات عند الضرورة.
- السماح لتبرد في درجة حرارة الغرفة.
- كتلة نشاط البيروكسيديز الذاتية مع 1 ٪ H 2 O 2 في DPBS لمدة 20 دقيقة (1.5 مل من الأسهم 30 ٪ سيغما H - 1009 في DPBS مل 50).
- نقع في 3 DPBS 5 دقائق س.
- كتلة غير محددة المواقع التي يحتضنها بين عشية وضحاها في +4 درجة مئوية في المصل البقري DPBS + 5 ٪ الزلال (BSA) + 0.1 ٪ + أزيد الصوديوم 5 ٪ المصل.
ملاحظة : اختيار المصل سوف يعتمد على الأنواع التي أدلى تستخدم لتلوين الأجسام المضادة. كتلة مع المصل من الأنواع التي تم فيها أب الثانوية (مترافق لالبيوتين). إذا كان هذا غير متوفر ، واستخدام المصل من فصيلة مختلفة عن تلك التي كان أدلى آب الابتدائي.
- حجب المواقع البيوتين مع عدة حظر أفيدين / البيوتين (ناقلات المختبرات كتالوج # SP - 2001) :
- احتضان مع D أفيدين لمدة 15 دقيقة. شطف لفترة وجيزة مع DPBS.
- احتضان مع الحل البيوتين لمدة 15 دقيقة.
- في احتضان أب الأولية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، في DPBS + 2 ٪ NaAzide + 0.1 ٪ + BSA 2 ٪ المصل (نفس الخطوة لحجب).
- نقع في 3 PBS 5 دقائق س.
- احتضان مع أب الثانوية مترافق مع البيوتين لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في DPBS + 2 ٪ BSA + 0.1 ٪ + 2 نا آزيد ٪ المصل (نفس المستخدمة في خطوة حجب).
- إعداد ABC كاشف في نفس الوقت لأنها لتطوير ما لا يقل عن 30 دقيقة قبل الاستخدام! (انظر المواد)
- تحضير في أنبوب مخروطي 50 مل. DPBS في 15 مل (أي مصل ، ولا أزيد) إضافة 3 قطرات من كاشف ألف ، وإضافة مزيج 3 قطرات من وباء كاشف المزيج. تجنب الضغط على الزجاجات والتريث لينخفض إلى شكل من تلقاء نفسها. ABC مجموعة Vectastain PK - 6100 من مختبرات المتجهات.
- نقع في 3 DPBS 5 دقائق س.
- احتضان مع كاشف ABC عن 30-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نقع في 3 DPBS 5 دقائق س.
- تعد الركيزة البيروكسيداز DAB (ناقلات مختبرات # SK - 4100) في 5 مل O 2 DDH في قارورة زجاجية على الفور قبل استخدامه (انظر المواد)
- 2 قطرات من محلول المخزون الاحتياطي ، ومزيج
- 4 قطرات من DAB ، مزيج من (يجب أن تصبح بنية اللون قليلا)
- قطرات 2 H 2 O 2 ، مزيج
- انخفاض الركيزة DAB على أعلى الشرائح ومشاهدة لتلطيخ البني.
- تراجع الشرائح في الثلج + ماء الحنفية لوقف التفاعل.
- الشطف تحت ماء الصنبور البارد لمدة 5 دقائق.
- ملون مباين مع الهيماتوكسيلين (20 ثانية ؛ فيشر CS401 - D) وشطف في مياه الحنفية حتى يأتي الماء واضحا بها.
- يذوى من خلال التدرج كحول الايثانول بدءا من 30 ٪ الى 100 ٪ من الإيثانول (2 دقيقة لكل منهما).
- نقع في الزيلين 3 دقائق و 5 ×.
- جبل مع Permount (فيشر # SP15 - 100) : وضعت بعض المقطع أعلاه على الشريحة واضغط ببطء على الباب مع ساترة دون فقاعات الهواء. لا تحرك ساترة حتى تجف تماما ، والتي تأخذ ~ 24 ساعة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC. |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Use to make EtOH gradient. |
| DPBS | Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+ | ||
| Na-Citrate buffer | 10 mM, pH 6.5 | ||
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | 30% stock => Dilute to 1% in DPBS |
| Blocking solution | DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum. | ||
| BSA | |||
| Sodium Azide | NaAzide | ||
| avidin/biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2001 | |
| Ab buffer | DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step) | ||
| ABC kit Vectastain PK-6100 | Vector Laboratories | ||
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| ddH2O | |||
| Hematoxylin | Fisher Scientific | CS401-D | counterstain |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Slides and cover-slips | glass |
