Immunhistochemie: Paraffin Schnitte mit der Vectastain ABC Kit von Vector Labs

Summary

Abstract

Immunhistochemie (IHC) ist eine wertvolle Technik genutzt werden, um zu lokalisieren / visualisieren Proteinexpression in einem bereitgestellten Gewebeschnitt mit spezifischen Antikörpern. Es gibt zwei Methoden: die direkte und indirekte Methode. In diesem Experiment werden wir nur beschreiben die Verwendung der indirekten IHC Färbung. Indirekte IHC Färbung nutzt hochspezifische Primär-und Biotin-konjugierten Sekundärantikörper. Primäre Antikörper werden benutzt, um diskret zu identifizieren Proteine ​​von Interesse durch die Bindung an ein spezifisches Epitop, während Sekundärantikörper für unspezifische Hintergrundfärbung zu subtrahieren und zu verstärken Signal durch Bildung von Komplexen an den primären Antikörper. Folien können entweder von Gefrierschnitten erzeugt werden, oder in Paraffin eingebetteten Abschnitte montiert auf Glasplättchen. In diesem Protokoll, besprechen wir die Vorbereitung von in Paraffin eingebetteten Schnitte durch Entwachsen, Hydratation mit einem Alkohol-Gradienten-, Wärme-induzierte Antigen-Retrieval und Sperrung von endogenen Peroxidase-Aktivität und nicht-spezifischen Bindungsstellen. Einige Abschnitte werden dann mit spezifischen Antikörpern für T-Zell-Marker CD8 angefärbt und während andere für Tyrosinhydroxylase gefärbt. Die Folien werden anschließend mit den entsprechenden Sekundärantikörper konjugiert mit Biotin behandelt, dann entwickelt Nutzung Avidin-konjugierte Meerrettichperoxidase (HRP) mit Diaminiobenzidine (DAB) als Substrat. Nach der Entwicklung werden die Objektträger für Kontrast gegengefärbt und montiert unter Deckgläschen mit permount. Nach ausreichender Trocknung sind diese Folien dann bereit für die Bildgebung.

Protocol

Färbung von Paraffinschnitten

1. Entparaffinieren Objektträger mit Xylol (Fisher X3 ^S -4) 3x für jeweils 5 Minuten (change Xylol jeden Monat je nach Nutzung, ist Xylol TOXIC). Verwenden Sie Geschirr und Deckel für 20 Dias von Fisher ref 08-812-1A und Racks, um diese Gerichte passen. 200 ml Flüssigkeit pro Gericht.
2. Hydrate durch Alkohol Gradienten wie folgt (Änderung Gradienten alle 2 Wochen):
   • 2x in 100% Ethanol (Fisher # A406-20) für je 2 min
   • 2x in 95% Ethanol für 2 min jeweils
   • 1x in 70% Ethanol für 2 min
   • 1x in 50% Ethanol für 2 min
   • 1x in 30% Ethanol für 2 min
   • 1x ddH ₂ O für 2 min
3. Tauchen Sie ein in DPBS für 5 min (DPBS = Dulbecco modifiziertem Phosphate Buffered mit Ca ^{2 +} Saline und Mg ^{2 +).}

Antigen Erholung:

1. Heizen Sie den Na-Citrat-Puffer (10 mM, pH 6,5) in die Mikrowelle.
2. Kochen Sie die Folien für 15 min in der Mikrowelle. Die Folien sollten nie trocken, so prüfen jede min und fügen Na-Citrat, wenn nötig.
3. Lassen Sie bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
4. Block endogene Peroxidase-Aktivität mit 1% H ₂ O ₂ in DPBS für 20 min (1,5 ml 30% Lager Sigma H-1009 in 50 ml DPBS).
5. Tauchen Sie ein in DPBS 3 x 5 min.
6. Block nicht-spezifische Websites durch Inkubation über Nacht bei +4 ° C in DPBS + 5% Rinderserumalbumin (BSA) + 0,1% Na-Azid + 5% Serum.
   
   Hinweis: Wahl der Serum wird auf die Arten, bei denen Antikörper für die Färbung verwendet wurden abhängen. Block mit Serum von Spezies, bei denen die sekundäre Ab (konjugiert an Biotin) gemacht wurde. Wenn dieses nicht verfügbar ist, verwenden Serum aus einer Spezies unterscheidet sich von demjenigen, in dem die primäre Ab gemacht wurde.
   
   
7. Blockieren Sie die Biotin-Sites mit dem Avidin / Biotin-Blocking-Kit (Vector Laboratories Katalog # SP-2001):
   • Inkubieren mit Avidin D für 15 min. Spülen Sie kurz mit DPBS.
   • Inkubieren mit dem Biotin-Lösung für 15 min.
8. Inkubieren in primären Ab 2 Stunden bei Raumtemperatur in DPBS + 2% BSA + 0,1% NaAzide + 2% Serum (wie bei Blocking Schritt).
9. Tauchen Sie ein in PBS 3 x 5 min.
10. Inkubieren mit dem sekundären Ab mit Biotin konjugiert für 1 Stunde bei Raumtemperatur in DPBS + 2% BSA + 0,1% Na-Azid + 2% Serum (wie für die Sperrung Schritt verwendet).
11. Bereiten Sie ABC-Reagenz zur gleichen Zeit, weil sie für mindestens 30 min vor Gebrauch zu entwickeln hat! (Siehe Materialien)
12. Bereiten Sie in einem 50 ml konischen Rohr. In 15 ml DPBS (kein Serum, kein Azid) 3 Tropfen Reagenz A, mischen und mit 3 Tropfen Reagenz B und mischen. Vermeiden Sie das Drücken der Flaschen, sondern für die Tropfen warten, um auf ihre eigene Form. ABC-Kit Vectastain PK-6100 von Vector Labs.
13. Tauchen Sie ein in DPBS 3 x 5 min.
14. Inkubieren mit ABC-Reagenz für 30-45 min bei Raumtemperatur.
15. Tauchen Sie ein in DPBS 3 x 5 min.
16. Bereiten DAB Peroxidase Substrat (Vector Labs # SK-4100) in 5 ml ddH ₂ O in einem Glasfläschchen unmittelbar vor der Verwendung (siehe Materialien)
    • 2 Tropfen Puffer-Stammlösung mischen
    • 4 Tropfen DAB, mischen (sollte sich leicht braun)
    • 2 Tropfen H ₂ O _2, mix
17. Löschen Sie die DAB-Substrat auf der Oberseite des Dias und achten Sie auf braune Flecken.
18. Dip Slides in Eis + Wasser, um die Reaktion zu stoppen.
19. Spülen Sie mit kaltem Leitungswasser 5 min.
20. Gegenfärbung mit Hämatoxylin (20 sec; Fisher CS401-D) und spülen in Leitungswasser bis das Wasser kommt aus klar.
21. Entwässern durch Alkohol Gefälle ab 30% Ethanol bis zu 100% Ethanol (2 Min.).
22. Tauchen Sie ein in Xylol 3 x 5 min.
23. Berg mit Permount (Fisher # SP15-100): put einige über dem Abschnitt auf der Folie und drücken Sie langsam auf den Abschnitt mit einem Deckglas ohne Luftblasen. Bewegen Sie sich nicht das Deckglas, bis sie vollständig trocken, was dauert bis 24 Stunden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Use to make EtOH gradient.
DPBS			Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+
Na-Citrate buffer			10 mM, pH 6.5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	30% stock => Dilute to 1% in DPBS
Blocking solution			DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum.
BSA
Sodium Azide			NaAzide
avidin/biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2001
Ab buffer			DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)
ABC kit Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100
ddH2O
Hematoxylin	Fisher Scientific	CS401-D	counterstain
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Slides and cover-slips			glass