Immunohistochemistry : 벡터 연구소에서 Vectastain ABC 키트를 사용하여 파라핀 섹션

Summary

Abstract

Immunohistochemistry (IHC)는 집중 / 특정 항체를 사용하여 마운트된 조직 섹션에서 단백질 표현을 시각화하기 위해 활용 가치 기법입니다. 직접 및 간접 방법 : 두 가지 방법이 있습니다. 본 실험에서는, 우리는 간접 IHC의 얼룩의 사용을 설명합니다. 간접 IHC의 얼룩은 매우 구체적인 기본 및 비오틴 - 복합 이차 항체를 활용합니다. 차 항체는 이차 항체가 아닌 구체적인 배경에 대한 얼룩 빼기 및 기본 항체에 단지를 형성하여 신호를 증폭하는 동안 몰래, 특정 에피토프에 바인딩하여 관심 단백질을 식별하는 이용하고 있습니다. 슬라이드는 어느 냉동 섹션에서 생성된, 또는 파라핀 임베디드 섹션은 유리 슬라이드에 장착할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 내생 퍼옥시데이즈 활동이 아닌 특정 바인딩 사이트 알코올 기울기를 사용하여 dewaxing, 수화, 열 유도 항원 검색 및 차단하여 파라핀 - 임베디드 섹션의 준비에 대해 설명합니다. 일부 섹션은 다음 T 세포 마커 CD8 특정 항체 물들일하고 다른 사람은 티로신 hydroxylase에 대한 스테인드하는 동안. 슬라이드는 이후 비오틴에 복합 적절한 보조 항체로 처리되며, 다음과 같은 기판 Diaminiobenzidine (DAB)로 아비딘 - 복합 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (HRP)를 활용하여 개발하였습니다. 개발 다음, 슬라이드가 대비를위한 counterstained 있으며, permount와 coverslips 이하 탑재. 충분한 건조 후 다음 슬라이드 다음 이미지에 대한 준비가되어 있습니다.

Protocol

파라핀 섹션의 염색법

1. Dewax 각 5 분 배 크실렌 (피셔 X3 ^S -4)로 슬라이드 (사용에 따라 매월 변경 크실렌, 크실렌은 독성입니다.) 피셔 심판 08-812 - 1A 및 랙에서 20 슬라이드에 요리와 커버를 사용하여 이러한 요리를 맞게했다. 접시 당 200 ML 액체.
2. (모든 이주 경사도를 변경) 다음과 같이 알코올 기울기를 통해 하이드 레이트 :
   • 2 분 각각에 대해 100 %의 에탄올 (피셔 # A406 - 20)의 2 배
   • 2 분 각 95 % 에탄올에 2 배
   • 2 분 70 %의 에탄올에 1X
   • 1X 2 분 50 % 에탄올에
   • 1X 2 분 30 %의 에탄올에
   • 2 분 1X ddH ₂ O
3. 5 분 DPBS의 소크 (DPBS = Dulbecco의 수정 인산이 칼슘 ² 살린 버퍼 ^+와 MG ^{2 +).}

항원 복구 :

1. 전자렌지에 미리 열을 나 - 구연 산염 완충액 (10 MM, 산도 6.5).
2. 전자 레인지에서 15 분 슬라이드를 요리. 슬라이드 이렇게 모든 분을 확인하고 필요한 경우 나이 - 구연 산염 추가 건조하지 않습니다.
3. 실온에서 냉각하자.
4. 1% 20 분 대한 DPBS에서 H ₂ O ₂ (30 % 주식의 1.5 ML 시그마 50 ML의 DPBS에서 H - 1009).과 내생 퍼옥시데이즈 활동 블럭
5. DPBS 3 X 5 분에서 만끽해보세요.
6. 4 ° DPBS에서 C + 5% 소 혈청 알부민 (BSA) + 0.1 % 나 Azide + 5% 혈청에서 하룻밤 잠복기가 아닌 특정 사이트를 차단합니다.
   
   참고 : 혈청 중 선택이 얼룩에 사용되는 항체가 만들어진하는 종류에 따라 달라집니다. 보조 AB가 (비오틴에 복합)되었다있는 수종의 혈청과 차단합니다. 이 사용할 수없는 경우, 기본 AB가되었다하는 것과 다른 종 혈청 사용합니다.
   
   
7. 아비딘 / 비오틴 차단 키트 (벡터 실험실 카탈로그 # SP - 2001)와 비오틴 사이트를 차단 :
   • 15 분 아비딘 D와 부화. DPBS로 간단히 씻어.
   • 15 분 대한 비오틴 솔루션과 부화.
8. DPBS에 상온에서 2 시간, + 2% BSA + 0.1 % NaAzide + 혈청 2% (단계를 차단과 같은)에 대한 기본 AB에 품어.
9. PBS 3 X 5 분에서 만끽해보세요.
10. DPBS에서 실온 + 2% BSA + 0.1 % 나 Azide + 혈청 2퍼센트 (차단 단계에 사용되는 동일). 1 시간 동안 비오틴과 복합 보조 AB와 부화
11. 이것을 사용하기 전에 최소한 30 분 개발할 수 있기 때문에 동시에 ABC 시약을 준비! (자료 참조)
12. 50 ML 원뿔 관에 준비합니다. 15 ML의 DPBS에서 (없음 묘약, 아니 azide) 시약 3 방울을 추가, 믹스 및 시약의 B와 믹스 3 방울을 추가합니다. 병 쥐어 않도록, 오히려 자신의 양식에 방울 기다립니다. 벡터 실험실에서 ABC 키트 Vectastain PK - 6100.
13. DPBS 3 X 5 분에서 만끽해보세요.
14. 실온에서 30-45 분 ABC 시약과 부화.
15. DPBS 3 X 5 분에서 만끽해보세요.
16. (자료 참조) 사용하기 전에 즉시 유리관 5 ML ddH ₂ O에서 (벡터 실험실 #은 SK - 4100) DAB 퍼옥시데이즈 기판 준비
    • 버퍼 주식 솔루션 2 방울, 혼합
    • DAB 4 방울, 혼합 (약간 갈색이 될해야합니다)
    • 2 방울 H ₂ O _2, 믹스
17. 슬라이드 위에 DAB 기판을 드롭과 갈색 얼룩 살펴보십시오.
18. 얼음 파고 슬라이드 + 반응을 중지 수돗물.
19. 5 분 차가운 수돗물에 따라 헹굼.
20. Hematoxylin (20 초, 피셔 CS401 - D)와 Counterstain과 물이 빠져나가 올때까지 수돗물에 씻어.
21. 알코올 기울기는 100 % 에탄올 (2 분 각)으로 30 % 에탄올로 최대 시작을 통해 탈수.
22. 크실렌 3 X 5 분에서 만끽해보세요.
23. Permount와 마운트 (피셔 # SP15 - 100) : 슬라이드에있는 섹션 위의 일부를 넣고 기포없이 coverslip으로 섹션에 천천히 누르십시오. ~ 24 시간이 소요되는, 완전히 건조까지 coverslip를 이동하지 마십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Use to make EtOH gradient.
DPBS			Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+
Na-Citrate buffer			10 mM, pH 6.5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	30% stock => Dilute to 1% in DPBS
Blocking solution			DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum.
BSA
Sodium Azide			NaAzide
avidin/biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2001
Ab buffer			DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)
ABC kit Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100
ddH2O
Hematoxylin	Fisher Scientific	CS401-D	counterstain
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Slides and cover-slips			glass