Summary
Пощадили повреждение нерва животного модель описывается здесь как мышь модель периферической нейропатической боли после частичной денервации седалищного нерва lesioning большеберцового и общего малоберцового ветвей нерва, оставив икроножных нервов нетронутым. Поведенческие модификации в результате механической аллодиния можно измерить с помощью нитей фон Фрей.
Abstract
Периферийные нейропатической боли является тяжелым хроническим заболеванием боль, которая может быть результатом травмы чувствительных нервов в периферической нервной системе. Пощадили повреждение нерва (SNI) модель вызывает симптомы нейропатической боли, такие как механическая боль аллодиния т.е. из-за тактильные раздражения, которые обычно не вызывают болезненных ответ [1].
Модель SNI мыши включает перевязку двух из трех ветвей седалищного нерва (большеберцового нерва и общего малоберцового нерва), а икроножных нервов остается без изменений [2]. Поражение приводит к повышенной чувствительности отмечен в боковой площади лапу, которая иннервируется пощадил икроножных нерва. Неоперированных сторону мышь можно использовать в качестве контроля. Преимущества модели SNI являются надежность и ответ, что он не требует навыков эксперт микрохирургических.
Порог для механического ответа боли определяется путем тестирования с фон нитей Фрей увеличения силы изгиба, которые многократно прижимается боковой площади лапу [3], [4]. Положительная реакция боль определяется как внезапное снятие лапу, дрогнув и / или лапу лизать индуцированных нити. Положительный отклик в трех из пяти повторяющихся стимулов определяется как болевой порог.
Как показано в видео-протокол, C57BL / 6 мышей опыт глубокого аллодиния уже на следующий день после операции и сохранить это в течение нескольких недель.
Protocol
1. фон Фрей базовые измерения до операции
Для фон процедуру тестирования Фрей, пожалуйста, обратитесь к разделу 5.
2. Анестезия / препарата
- Анестезию животных (при введении препарата в смеси 100mg/kg кетамин и 15 мг / кг Ксилазин).
- Место животное в тихое место, до полного наркоза (например, покрыты бумажным полотенцем).
- Проверить рефлексы, зажимая кончик хвоста и лап с пинцетом. Будьте уверены, что животные не реагируют прежде чем продолжить.
- Подкожно вводят (задняя область плеча) 0,5 мл изотонический солевой раствор с антибиотиками, например, ампициллин (чтобы избежать обезвоживания и профилактики инфекции, хотя это незначительные хирургические процедуры).
- Использование электрической бритвы, бритье операционного поля от чуть ниже колен области для области бедра (для правшей левой задней конечности рекомендуется).
- Применение глазной мази для глаз с ватой зародыше.
- Место животных на правый бок и положите левую задние конечности на небольшую площадку, чтобы держать это повышение. Безопасные ноги клейкой лентой.
- Лечить операционного поля с чередующимися скрабы этанола и бетадин от хирургического нашем сайте.
3. Хирургия
- Найдите колена с большим пальцем левой руки и использовать скальпель, чтобы сделать приложение. 1 см разрез в продольном направлении, проксимальнее коленного сустава.
- Открытое кожи тупой диссекции с помощью иглы парой стерильных ножниц.
- Отдельные мышечного слоя путем тупой диссекции в непосредственной близости от хорошо видны кровеносные сосуды, близкие к бедренной кости (бедро). Если все сделано правильно, мышечные слои будут легко отделить без каких-либо кровотечение, выявление седалищного нерва справа внизу мышц.
Если кровотечение происходит, например, с повреждением кровеносных сосудов близко к колену, используйте стерильные ватные почки или части взгляда, чтобы поглотить кровь. Нажимайте, пока не остановится кровотечение. - Наведите под стерео микроскопом и тщательно отдельных мышц с парой стерильных пинцетов (№ 2) для визуализации седалищного нерва. Ретракторы также может быть применен.
- Определите область, где икроножных ветвей нерва от седалищного нерва. Икроножных нерва является самым маленьким из трех ветвей, ветвление, чтобы прямо в левую ногу.
- Применить шва (6-0 шва) вокруг двух других отраслей, которые все еще работают параллельно (большеберцового и общего малоберцового нервов), будучи очень осторожны и не прикасайтесь икроножных отрасли. Это очень важный шаг, как икроножных нервов, чтобы их оставили в полной неприкосновенности.
- Сделать плотно хирургических узлов. Если первый узел туго, сокращений конечности будут соблюдены.
- Захватите нервы быть сокращены ниже шва с пинцетом (№ 5) и вырезать нервы выше и ниже пинцетом с небольшим ножницы. По первой резки выше пинцетом, перетягивание нервов не происходит.
- Отрежьте шов заканчивается пару микро-ножницы и аккуратно закрыть мышечного слоя. Добавить каплю раствора лидокаина на рану и шовные хирургические узлы.
4. После операции
- Проверьте, глазная мазь по-прежнему достаточно.
- Наведите в чистой клетке под бумажным полотенцем в удобном положении. Если в комнате холодно, место тепла площадку под часть клетки (только под часть клетки, как животных должны быть в состоянии бежать в холодные области, если предпочтительно).
- Обеспечить легко доступной водой и кормом.
5. фон Фрей тестирования (базовый уровень, и на следующий день после операции)
- Место мышей в красные пластиковые цилиндры стоящую на столе проволочной сетки двух дней и один день до операции. Приучать течение 15 мин в цилиндры перед тестированием. Красный цвет цилиндров помогает мышам быстро расслабиться, поскольку они не могут видеть друг друга и находятся в темной области.
- Убедитесь, что мышь спокойны и применять фон Фрей нитей на боковой части лапу: начиная с 0,02 г нити, сначала прикладывать к левой лапой в пять раз за весь период от 30 секунд (примерно 2 секунды на раздражитель) и оценить реакцию мыши после каждого применения. Повторите с той же нити и левой лапой любой другой мыши, а затем начните снова с правой лапой первую мышь, прежде чем перейти к следующему нити, например:
- Мышь 1: левая лапа 5 раз нити 0,02 г
- Мышь 2: левая лапа 5 раз с 0,02 г нити и т.д.
- Мышь 1: правая лапа 5 раз нити 0,02 г
- Мышь 2: правая лапа 5 раз с 0,02 г нити и т.д.
- Мышь 1: левая лапа 5 раз нити 0,04 г
- Мышь 2: левая лапа 5 раз с 0,04 г нити и т.д.
- Ответ в трех из пяти стимулов рассматривается как положительная реакция. Нити выше thresholг может быть применен для проверки порогового уровня.
Ответ = внезапного изъятия лапу, внезапные дрогнув, внезапные лапу лизать.
6. Представитель результаты
Рисунок 1. Фон Фрей тестирование на C57BL / 6 мышей возрасте 8-10 недель было выполнено за 1 день до операции и несколько раз после операции. 4-8 животных, включенных в каждую группу. Фон Фрей тестирование на оперированной стороне представлена ипсилатеральной и неоперированных контрольной стороне представлена контралатеральной. День после операции животных развивать значительные гиперчувствительности на оперированной лапе при неоперированных лишь немного пострадавших по отношению к мнимой работать мышей. (* <0,05, ** <0,01, *** <0,001, ипсилатеральных по отношению к контралатеральной).
Discussion
Критические шаги
Повреждение нервов икроножных следует избегать в целях изучения патологических изменений в нетронутой икроножных травмы следующие нерв голени и общего малоберцового нервов. Сопутствующий ущерб в икроножных нерва может привести к параличу и тем самым могут быть представлены в виде увлечения работают задние конечности.
Только боковые стороны лапы иннервируется пощадил икроножных нервов и, следовательно, только в этой области развивается нейропатия. Тестирование других областях, иннервируемых пересекаются нервы, может сильно искажать результаты оценки измененных механических порога.
Возможные изменения
Другие виды перевязки может быть дополнительным с точки зрения изучения патологических состояний боли после травмы периферических нервов, таких как хронические травмы сужение [5] или частичной перевязке нервов [6]. Каждый экспериментальных результатов процедуры в различных фенотипические изменения, которые должны быть рассмотрены до послеоперационного тестирования.
Кроме того, в других сенсорных тестов, таких как тепловой гипералгезии может быть применен [7], хотя этот фенотип менее надежные следующие SNI.
Будущие приложения
Этот метод может быть использован для тестирования лекарств изменяя развития или поддержания механической аллодиния [8]. Анализ седалищного нерва, спинной ганглий корня (DRG) и / или поясничного спинного мозга позволяют исследование молекулярных механизмов, ответственных за индуцированного фенотипа.
Эксперименты на животных проводили в соответствии с надлежащей лабораторной практики в полное соответствие с датскими и европейскими нормами. Все эксперименты были одобрены датский эксперименты на животных, инспекция при Министерстве юстиции (разрешения числа 2006/561-1206).
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана фондом Lundbeck, Carlsberg фонда и Фонда Маршалла Дагмар.
References
- Costigan, M., Scholz, J., Woolf, C. J. Neuropathic pain: a maladaptive response of the nervous system to damage. Annu. Rev. Neurosci. 32, 1-32 (2009).
- Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87, 149-158 (2000).
- Bourquin, A. -F., Süveges, M., Pertin, M., Gilliar, N., Sardy, S., Davidson, A. C., Spahn, D. R., Decosterd, I. Assessment and analysis of mechanical allodynia-like behavior induced by spared nerve injury (SNI) in the mouse. Pain. 122, 14.e1-14.e14 (2006).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J. Neurosci. Methods. 53, 55-63 (1994).
- Bennett, G. J., Xie, Y. -K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33, 87-107 (1988).
- Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 43, 205-218 (1990).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutanous hyperalgesia. Pain. 32, 77-88 (1988).
- Erichsen, H. K., Blackburn-Munro, G. Pharmacological characterization of the spared nerve injury model of neuropathic pain. Pain. 98, 151-161 (2002).
