Summary
Den skonas Nerve Injury djurmodell beskrivs här som en musmodell av perifer neuropatisk smärta efter partiell denervering av ischiasnerven som lesioning den sken-och gemensamma peroneusnerven grenar och lämnar de övriga Sural nerven intakt. Beteendemodifikation följd av mekanisk allodyni kvantifieras av von Frey filament.
Abstract
Perifer neuropatisk smärta är en svår kroniskt smärttillstånd som kan uppstå genom trauma till sensoriska nerverna i perifera nervsystemet. De skonade nervskada (SNI) modell framkallar symtom på neuropatisk smärta, såsom mekanisk allodyni, dvs smärta på grund av taktila stimuli som normalt inte provocera fram ett smärtsamt svar [1].
Den SNI musmodell innebär ligation av två av de tre grenarna av ischiasnerven (tibial nerv och det gemensamma peroneusnerven), medan Sural nerven finns kvar intakt [2]. Lesionen resulterar i markerad överkänslighet i laterala delen av tassen, som innerveras av de skonade Sural nerv. Den icke-opererade sidan av musen kan användas som en kontroll. Fördelarna med SNI modellen är robustheten i svaret och att den inte kräver kompetens expert mikrokirurgisk.
Tröskeln för mekanisk smärta reaktion bestäms genom att testa med von Frey filament av ökad böjning kraft, som upprepade gånger pressas mot den laterala delen av tassen [3], [4]. En positiv smärta reaktion definieras som plötsliga tassen tillbakadragande, blinka och / eller tass slicka framkallas av glödtråden. Ett positivt svar i tre av fem repetitiva stimuli definieras som smärtgräns.
Som framgår i videon protokollet, C57BL / 6 möss erfarenhet djupa allodyni redan dagen efter operation och upprätthålla detta i flera veckor.
Protocol
1. von Frey baslinje mätningar före operation
För von Frey testproceduren, se avsnitt 5.
2. Anestesi / beredningen
- Bedöva djur (intraperitoneal injektion av en blandning av 100mg/kg ketamin och 15 mg / kg Xylazine).
- Placera djuret på en lugn plats tills helt bedövad (t.ex. täckt med hushållspapper).
- Kontrollera reflexer genom att klämma spetsen på svansen och tassarna med en pincett. Var noga med att djuren inte svarar innan du fortsätter.
- Subkutant injicera (baksida axlar) 0,5 ml isoton koksaltlösning med antibiotika, t.ex. ampicillin (för att undvika uttorkning och förhindra infektion, trots att detta är ett mindre kirurgiskt ingrepp).
- Använda en elektrisk rakapparat, raka operativa fältet från strax under knäet område till det hippa området (för högerhänta personer till vänster bakbenen rekommenderas).
- Applicera oftalmologiska salva till ögon med en bomull-ull knopp.
- Placera djuret på dess högra sida och placera den vänstra bakdelen på en liten plattform för att hålla den förhöjda. Säkra benet med tejp.
- Desinficera operativa fältet med omväxlande skurar av etanol och Betadine från operationsområdet ut.
3. Kirurgi
- Leta reda på knä med tummen på vänstra handen och använd en skalpell för att göra en app. 1 cm snitt i längsgående riktning proximalt om knäet.
- Öppna huden genom dissektion hjälp av spetsen på ett par av steril sax.
- Separera muskellagret genom dissektion precis intill den väl synliga blodkärl, nära lårbenet (femur). Om det görs på rätt sätt, kommer muskeln lagren separata enkelt utan blödning, avslöjar ischiasnerven precis under musklerna.
Om blödning uppstår t.ex. genom att skada ett blodkärl nära knäet, använd sterila bomull ull knoppar eller bitar av blick för att absorbera blod. Tryck tills blödningen stannar. - Placera musen under en lupp och noggrant separata musklerna med ett par av steril pincett (nr. 2) att visualisera ischiasnerven. Upprullningsdon kan också tillämpas.
- Identifiera det område där Sural nerven grenar från ischiasnerven. Den Sural nerv är den minsta av de tre grenarna, förgrening till höger i vänster ben.
- Applicera sutur (6-0 sutur) runt de andra två grenarna som fortfarande körs parallellt (den sken-och gemensamma peroneal nerver), är mycket noga med att inte röra vid Sural gren. Detta är ett kritiskt steg som Sural nerv måste lämnas helt intakt.
- Gör en snäv kirurgisk knut. Om den första knut är stram, kommer sammandragningar av lem följas.
- Ta nerverna som ska klippas under suturen med en pincett (nr. 5) och skär nerverna över och under pincett med en liten sax. Genom att först klippa ovanför pincett, dra av nerverna undviks.
- Skär av sutur avslutas med ett par mikro sax och försiktigt stänga muskellagret. Tillsätt en droppe av lidokain i såret och sutur med kirurgiska knutar.
4. Efter operation
- Kontrollera om ögonsalva fortfarande är tillräcklig.
- Placera musen i en ren bur under en pappershandduk i en bekväm hållning. Om rummet är kallt, placera en värmedyna under en del av buren (endast under en del av buren som djuret ska kunna fly till ett kallare område om man föredrar det).
- Se till lättillgängligt vatten och käk.
5. von Frey testning (baslinje, och från dagen efter operationen)
- Placera mus i röd färgad plast cylindrar placeras på ett trådnät bord två dagar och en dag före operation. Vänja i 15 min i cylindrar före testning. Den röda färgen på cylindrarna hjälper möss att snabbt slappna av eftersom de inte kan se varandra och är i ett mörkare område.
- Kontrollera att mössen är lugn och gäller von Frey filament till den laterala delen av tassen: Från och med 0,02 g glödtråd, först ansöka tvinga till vänster tass fem gånger under en period på totalt 30 sekunder (ca 2 sekunder per stimulus) och mäta musens reaktion efter varje program. Upprepa med samma glödtråd och vänster tass av andra möss, och sedan börja om igen med rätt tass i den första musen innan vi går vidare till nästa glödtråden, t.ex.:
- Mus 1: vänster tass 5 gånger med glödlampa 0,02 g
- Mus 2: vänster tass 5 gånger med glödlampa 0,02 g etc.
- Mus 1: höger tass 5 gånger med glödlampa 0,02 g
- Mus 2: höger tass 5 gånger med glödlampa 0,02 g etc.
- Mus 1: vänster tass 5 gånger med glödlampa 0,04 g
- Mus 2: vänster tass 5 gånger med glödlampa 0,04 g etc.
- Svar i tre av fem stimuli uppfattas som en positiv reaktion. Filament ovan threshold kan tillämpas för att kontrollera tröskelvärdet.
Svar = plötslig tass tillbakadragande, plötsliga blinka, plötslig tass slicka.
6. Representativa resultat
Figur 1. Von Frey tester på C57BL / 6 möss ålder 8-10 veckor gamla gjordes en dag före operationen och upprepade gånger efter operationen. 4-8 djur i varje grupp. Von Frey tester på den opererade sidan representeras av ipsilaterala och de icke-manöverdon sidan representeras av kontralateral. Dagen efter operationen djuren utveckla betydande överkänslighet på den opererade tassen medan de icke-drift påverkas endast marginellt i förhållande till bluff drivs möss. (* <0,05, ** <0,01, *** <0,001, ipsilaterala förhållande till kontralaterala).
Discussion
Kritiska steg
Skador på Sural nerv bör undvikas för att studera sjukliga förändringar i den intakta Sural nerv efter skada på sken-och gemensamma peroneal nerver. Säkerheter skador på Sural nerv kan leda till förlamning och kan därmed visualiseras som att dra av det opererade bakbenen.
Endast den laterala sidan av tassen är innerveras av skonade Sural nerv och därmed utvecklar endast detta område neuropati. Testa andra områden, innerveras av transected nerver, kan starkt partiskhet utvärdering av ändrade mekanisk tröskel.
Möjliga ändringar
Andra typer av ligations kan vara kompletterande i termer av att studera patologiska smärttillstånd efter perifer nervskada, till exempel kronisk sammandragning skador [5] eller delvis nerv ligation [6]. Varje experimentella procedur resulterar i olika fenotypiska förändringar som bör övervägas före efter operation testning.
Dessutom kan andra sensoriska tester såsom termisk hyperalgesi tillämpas [7], även om detta fenotyp är mindre robust följande SNI.
Framtida tillämpningar
Denna teknik kan användas för testning av läkemedel förändra utveckling eller underhåll av mekanisk allodyni [8]. Analys av ischiasnerven, dorsalrotsganglier (DRG) och / eller ländryggen ryggmärgen tillåta forskning om de molekylära mekanismerna ansvariga för den inducerade fenotypen.
Djurförsök har utförts enligt god laboratoriesed i full överensstämmelse med danska och europeiska regler. Alla experiment har godkänts av den danska djurförsök Inspektionen under justitieministeriet (tillstånd antal 2006/561-1206).
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Lundbeck Foundation, Carlsberg Foundation och Dagmar Marshall Foundation.
References
- Costigan, M., Scholz, J., Woolf, C. J. Neuropathic pain: a maladaptive response of the nervous system to damage. Annu. Rev. Neurosci. 32, 1-32 (2009).
- Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87, 149-158 (2000).
- Bourquin, A. -F., Süveges, M., Pertin, M., Gilliar, N., Sardy, S., Davidson, A. C., Spahn, D. R., Decosterd, I. Assessment and analysis of mechanical allodynia-like behavior induced by spared nerve injury (SNI) in the mouse. Pain. 122, 14.e1-14.e14 (2006).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J. Neurosci. Methods. 53, 55-63 (1994).
- Bennett, G. J., Xie, Y. -K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33, 87-107 (1988).
- Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 43, 205-218 (1990).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutanous hyperalgesia. Pain. 32, 77-88 (1988).
- Erichsen, H. K., Blackburn-Munro, G. Pharmacological characterization of the spared nerve injury model of neuropathic pain. Pain. 98, 151-161 (2002).
