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Medicine

Poupado da lesão do nervo Model (SNI) de alodinia mecânica induzida em camundongos

doi: 10.3791/3092 Published: August 18, 2011

Summary

Poupado do Nervo modelo animal de lesão é descrita aqui como um modelo do rato da dor neuropática periférica seguintes denervação parcial do nervo ciático por a lesão do tibial e nervo peroneal comum ramos, deixando o nervo sural restante intacto. Modificação comportamental resultante da alodinia mecânica é quantificada por filamentos de von Frey.

Abstract

Dor neuropática periférica é uma condição de dor crônica grave que pode resultar de trauma de nervos sensoriais no sistema nervoso periférico. A lesão do nervo poupado modelo (SNI) induz sintomas da dor neuropática, tais como dor ou seja alodinia mecânica devido a estímulos táteis que normalmente não provocar uma resposta dolorosa [1].

O modelo do rato SNI envolve ligadura de dois dos três ramos do nervo ciático (nervo tibial eo nervo fibular comum), enquanto o nervo sural é deixada intacta [2]. Os resultados da lesão em hipersensibilidade marcada na região lateral da pata, que é inervado pelo nervo sural poupado. O lado não-operado do mouse pode ser usado como um controle. As vantagens do modelo de SNI são a robustez da resposta e que não requerem habilidades de microcirurgia especialista.

O limite para a resposta à dor mecânica é determinada por meio de testes com filamentos de von Frey de aumentar a força de flexão, que são repetidamente pressionado contra a região lateral da pata [3], [4]. Uma reação positiva dor é definida como a retirada de pata súbita, vacilar e / ou pata lambendo induzida pelo filamento. Uma resposta positiva em três dos cinco estímulos repetitivos é definido como o limiar de dor.

Como demonstrado no protocolo de vídeo, camundongos C57BL / 6 alodinia experiência profunda, logo no dia seguinte à cirurgia e manter isso por várias semanas.

Protocol

1. von Frey medidas de base antes da cirurgia

Para von Frey procedimento de teste, consulte a seção 5.

2. Anestesia / preparação

  1. Anestesiar os animais (injeção intraperitoneal de uma mistura de ketamina 100mg/kg e 15 Xilazina mg / kg).
  2. Colocar o animal em um lugar calmo até totalmente anestesiado (por exemplo, coberta com uma toalha de papel).
  3. Verifique reflexos por beliscar a ponta da cauda e as patas com um par de pinças. Certifique-se que os animais não respondem antes de prosseguir.
  4. Por via subcutânea injetar (área de ombro para trás) salina isotônica 0,5 ml com antibióticos, por exemplo, ampicilina (para evitar desidratação e evitar a infecção, embora este seja um pequeno procedimento cirúrgico).
  5. Usando um barbeador elétrico, a barba do campo operatório de um pouco abaixo da área do joelho para a área do quadril (para destros pessoas o membro posterior esquerdo é recomendado).
  6. Aplicar pomada oftálmica nos olhos com um chumaço de algodão hidrófilo.
  7. Colocar o animal em seu lado direito e coloque o membro posterior esquerdo em uma pequena plataforma para mantê-la elevada. Segura a perna com fita adesiva.
  8. Desinfectar o campo operatório com a alternância de scrubs de etanol e betadine de fora do sítio cirúrgico.

3. Cirurgia

  1. Localize o joelho com o polegar da mão esquerda e usar um bisturi para fazer uma app. Uma incisão cm no sentido longitudinal proximal ao joelho.
  2. Abra a pele por dissecção romba com a ponta de uma tesoura esterilizada.
  3. Separar a camada muscular por dissecção romba ao lado do vaso sangüíneo claramente visível, perto do osso da coxa (fêmur). Se feito corretamente, as camadas musculares facilmente separados sem qualquer sangramento, revelando o nervo ciático direito abaixo dos músculos.
    Se o sangramento ocorre por exemplo, danos a um vaso sanguíneo próximo ao joelho, use estéril algodão botões ou pedaços de olhar para absorver o sangue. Pressione até que o sangramento pare.
  4. Posicione o mouse em um microscópio estéreo e separe cuidadosamente os músculos com um par de pinças estéreis (nr. 2) para visualizar o nervo ciático. Retratores também pode ser aplicada.
  5. Identificar a área onde os ramos do nervo sural do nervo ciático. O nervo sural é o menor dos três ramos, ramificação à direita na perna esquerda.
  6. Aplicar sutura (6-0) em torno dos outros dois ramos que ainda estão em execução em paralelo (os nervos tibial e fibular comum), sendo muito cuidadoso para não tocar no ramo sural. Este é um passo crítico como o nervo sural tem de ser deixada completamente intacto.
  7. Faça um nó apertado cirúrgico. Se o primeiro nó está apertado, as contrações do membro será observado.
  8. Agarre os nervos a ser cortado abaixo da sutura com um par de pinças (nr. 5) e cortar os nervos acima e abaixo de uma pinça com um pequeno par de tesouras. Pelo primeiro corte acima do par de pinças, puxando dos nervos é evitada.
  9. Eliminar as extremidades da sutura com um par de tesouras micro e suavemente feche a camada muscular. Adicionar uma gota de lidocaína sobre a ferida e sutura com nós cirúrgicos.

4. Após a cirurgia

  1. Verifique se pomada ainda é suficiente.
  2. Posicione o mouse em uma gaiola limpa sob uma toalha de papel em uma postura confortável. Se o quarto é frio, coloque uma almofada de calor sob uma parte da gaiola (somente sob parte da gaiola que o animal deve ser capaz de escapar a uma área mais fria se preferir).
  3. Garantir água de fácil acesso e ração.

5. von Frey teste (linha de base, e desde o dia após a cirurgia)

  1. Coloque os ratos em vermelho cilindros de plástico colorido colocado sobre uma mesa de malha de arame de dois dias e um dia antes da cirurgia. Habituar por 15 min em cilindros antes do teste. A cor vermelha dos cilindros ajuda os ratos rapidamente relaxar, pois não podem ver um ao outro e estão em uma área mais escura.
  2. Verificar se os ratos são calmas e aplicar filamentos von Frey para a parte lateral da pata: Começando com o filamento 0,02 g, primeiro aplique força para a pata esquerda cinco vezes durante um período total de 30 segundos (cerca de 2 segundos por estímulo) e avaliar a reação do camundongo após cada aplicação. Repita com o filamento mesmo ea pata esquerda de qualquer outros ratos, e depois começar tudo de novo com a pata direita do mouse antes de passar para a próxima filamento, por exemplo:
    • Rato 1: pata esquerda 5 vezes com filamentos de 0,02 g
    • Mouse 2: pata esquerda 5 vezes com filamentos de 0,02 g etc
    • Rato 1: pata direita 5 vezes com filamentos de 0,02 g
    • Mouse 2: pata direita 5 vezes com filamentos de 0,02 g etc
    • Rato 1: pata esquerda 5 vezes com filamentos de 0,04 g
    • Mouse 2: pata esquerda 5 vezes com filamentos de 0,04 g etc
  3. Resposta em três dos cinco estímulos é considerada como uma reação positiva. Filamentos acima threshold pode ser aplicado para verificar o nível do limiar.
    Resposta = retirada pata súbita, repentina vacilar pata, lambendo súbita.

6. Resultados representativos

Figura 1
Figura 1. Von Frey testes em camundongos C57BL / 6 ratos idade 80-10 semanas de idade foi realizada um dia antes da operação e repetidamente após a cirurgia. 4-8 animais foram incluídos em cada grupo. Von Frey testes do lado operado é representado por ipsilateral com o lado controle não operado é representado por contralateral. O dia após a cirurgia os animais desenvolvem hipersensibilidade significativo sobre a pata operada enquanto o não operado é apenas ligeiramente afetada em relação aos ratos sham operados. (* <0,05, ** <0,01, *** <0,001, em relação ao contralateral ipsilateral).

Discussion

Etapas críticas

Danos ao nervo sural devem ser evitados a fim de estudar alterações patológicas na lesão do nervo sural seguintes intacto para os nervos tibial e fibular comum. Danos colaterais do nervo sural pode levar à paralisia e pode assim ser visualizado como arrastar do membro operado traseiras.

Apenas o lado lateral da pata é inervado pelo nervo sural poupado e, portanto, apenas esta área desenvolve neuropatia. Testes de outras áreas, inervados pelos nervos seccionados, pode viés fortemente a avaliação do limiar de mecânica alterada.

Possíveis modificações

Outros tipos de ligaduras podem ser complementares em termos de estudar as condições de dor patológica após a lesão do nervo periférico, como a lesão constrição crônica [5] ou ligadura parcial do nervo [6]. Cada experimental procedimento resulta em alterações fenotípicas distintas que devem ser considerados antes da pós-operatório de testes.

Além disso, outros testes sensoriais, tais como hiperalgesia térmica pode ser aplicada [7], embora este fenótipo é menos robusto SNI seguinte.

Aplicações futuras

Esta técnica pode ser usada para testes de drogas alteram o desenvolvimento ou manutenção de alodinia mecânica [8]. Análise do nervo ciático, os gânglios da raiz dorsal (DRG) e / ou o cabo de coluna lombar permitir a investigação dos mecanismos moleculares responsáveis ​​pelo fenótipo induzido.

Experimentação animal foi realizada de acordo com boas práticas de laboratório em plena conformidade com os regulamentos dinamarquês e europeu. Todos os experimentos foram aprovados pelo dinamarquês Experimentos em animais Inspecção do Ministério da Justiça (número de permissão 2006/561-1206).

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela Fundação Lundbeck, a Fundação Carlsberg e Dagmar Marshall Foundation.

References

  1. Costigan, M., Scholz, J., Woolf, C. J. Neuropathic pain: a maladaptive response of the nervous system to damage. Annu. Rev. Neurosci. 32, 1-32 (2009).
  2. Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87, 149-158 (2000).
  3. Bourquin, A. -F., Süveges, M., Pertin, M., Gilliar, N., Sardy, S., Davidson, A. C., Spahn, D. R., Decosterd, I. Assessment and analysis of mechanical allodynia-like behavior induced by spared nerve injury (SNI) in the mouse. Pain. 122, 14.e1-14.e14 (2006).
  4. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J. Neurosci. Methods. 53, 55-63 (1994).
  5. Bennett, G. J., Xie, Y. -K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33, 87-107 (1988).
  6. Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 43, 205-218 (1990).
  7. Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutanous hyperalgesia. Pain. 32, 77-88 (1988).
  8. Erichsen, H. K., Blackburn-Munro, G. Pharmacological characterization of the spared nerve injury model of neuropathic pain. Pain. 98, 151-161 (2002).
Poupado da lesão do nervo Model (SNI) de alodinia mecânica induzida em camundongos
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Richner, M., Bjerrum, O. J., Nykjaer, A., Vaegter, C. B. The Spared Nerve Injury (SNI) Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3092, doi:10.3791/3092 (2011).More

Richner, M., Bjerrum, O. J., Nykjaer, A., Vaegter, C. B. The Spared Nerve Injury (SNI) Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3092, doi:10.3791/3092 (2011).

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