Summary
Poupado do Nervo modelo animal de lesão é descrita aqui como um modelo do rato da dor neuropática periférica seguintes denervação parcial do nervo ciático por a lesão do tibial e nervo peroneal comum ramos, deixando o nervo sural restante intacto. Modificação comportamental resultante da alodinia mecânica é quantificada por filamentos de von Frey.
Abstract
Dor neuropática periférica é uma condição de dor crônica grave que pode resultar de trauma de nervos sensoriais no sistema nervoso periférico. A lesão do nervo poupado modelo (SNI) induz sintomas da dor neuropática, tais como dor ou seja alodinia mecânica devido a estímulos táteis que normalmente não provocar uma resposta dolorosa [1].
O modelo do rato SNI envolve ligadura de dois dos três ramos do nervo ciático (nervo tibial eo nervo fibular comum), enquanto o nervo sural é deixada intacta [2]. Os resultados da lesão em hipersensibilidade marcada na região lateral da pata, que é inervado pelo nervo sural poupado. O lado não-operado do mouse pode ser usado como um controle. As vantagens do modelo de SNI são a robustez da resposta e que não requerem habilidades de microcirurgia especialista.
O limite para a resposta à dor mecânica é determinada por meio de testes com filamentos de von Frey de aumentar a força de flexão, que são repetidamente pressionado contra a região lateral da pata [3], [4]. Uma reação positiva dor é definida como a retirada de pata súbita, vacilar e / ou pata lambendo induzida pelo filamento. Uma resposta positiva em três dos cinco estímulos repetitivos é definido como o limiar de dor.
Como demonstrado no protocolo de vídeo, camundongos C57BL / 6 alodinia experiência profunda, logo no dia seguinte à cirurgia e manter isso por várias semanas.
Protocol
1. von Frey medidas de base antes da cirurgia
Para von Frey procedimento de teste, consulte a seção 5.
2. Anestesia / preparação
- Anestesiar os animais (injeção intraperitoneal de uma mistura de ketamina 100mg/kg e 15 Xilazina mg / kg).
- Colocar o animal em um lugar calmo até totalmente anestesiado (por exemplo, coberta com uma toalha de papel).
- Verifique reflexos por beliscar a ponta da cauda e as patas com um par de pinças. Certifique-se que os animais não respondem antes de prosseguir.
- Por via subcutânea injetar (área de ombro para trás) salina isotônica 0,5 ml com antibióticos, por exemplo, ampicilina (para evitar desidratação e evitar a infecção, embora este seja um pequeno procedimento cirúrgico).
- Usando um barbeador elétrico, a barba do campo operatório de um pouco abaixo da área do joelho para a área do quadril (para destros pessoas o membro posterior esquerdo é recomendado).
- Aplicar pomada oftálmica nos olhos com um chumaço de algodão hidrófilo.
- Colocar o animal em seu lado direito e coloque o membro posterior esquerdo em uma pequena plataforma para mantê-la elevada. Segura a perna com fita adesiva.
- Desinfectar o campo operatório com a alternância de scrubs de etanol e betadine de fora do sítio cirúrgico.
3. Cirurgia
- Localize o joelho com o polegar da mão esquerda e usar um bisturi para fazer uma app. Uma incisão cm no sentido longitudinal proximal ao joelho.
- Abra a pele por dissecção romba com a ponta de uma tesoura esterilizada.
- Separar a camada muscular por dissecção romba ao lado do vaso sangüíneo claramente visível, perto do osso da coxa (fêmur). Se feito corretamente, as camadas musculares facilmente separados sem qualquer sangramento, revelando o nervo ciático direito abaixo dos músculos.
Se o sangramento ocorre por exemplo, danos a um vaso sanguíneo próximo ao joelho, use estéril algodão botões ou pedaços de olhar para absorver o sangue. Pressione até que o sangramento pare. - Posicione o mouse em um microscópio estéreo e separe cuidadosamente os músculos com um par de pinças estéreis (nr. 2) para visualizar o nervo ciático. Retratores também pode ser aplicada.
- Identificar a área onde os ramos do nervo sural do nervo ciático. O nervo sural é o menor dos três ramos, ramificação à direita na perna esquerda.
- Aplicar sutura (6-0) em torno dos outros dois ramos que ainda estão em execução em paralelo (os nervos tibial e fibular comum), sendo muito cuidadoso para não tocar no ramo sural. Este é um passo crítico como o nervo sural tem de ser deixada completamente intacto.
- Faça um nó apertado cirúrgico. Se o primeiro nó está apertado, as contrações do membro será observado.
- Agarre os nervos a ser cortado abaixo da sutura com um par de pinças (nr. 5) e cortar os nervos acima e abaixo de uma pinça com um pequeno par de tesouras. Pelo primeiro corte acima do par de pinças, puxando dos nervos é evitada.
- Eliminar as extremidades da sutura com um par de tesouras micro e suavemente feche a camada muscular. Adicionar uma gota de lidocaína sobre a ferida e sutura com nós cirúrgicos.
4. Após a cirurgia
- Verifique se pomada ainda é suficiente.
- Posicione o mouse em uma gaiola limpa sob uma toalha de papel em uma postura confortável. Se o quarto é frio, coloque uma almofada de calor sob uma parte da gaiola (somente sob parte da gaiola que o animal deve ser capaz de escapar a uma área mais fria se preferir).
- Garantir água de fácil acesso e ração.
5. von Frey teste (linha de base, e desde o dia após a cirurgia)
- Coloque os ratos em vermelho cilindros de plástico colorido colocado sobre uma mesa de malha de arame de dois dias e um dia antes da cirurgia. Habituar por 15 min em cilindros antes do teste. A cor vermelha dos cilindros ajuda os ratos rapidamente relaxar, pois não podem ver um ao outro e estão em uma área mais escura.
- Verificar se os ratos são calmas e aplicar filamentos von Frey para a parte lateral da pata: Começando com o filamento 0,02 g, primeiro aplique força para a pata esquerda cinco vezes durante um período total de 30 segundos (cerca de 2 segundos por estímulo) e avaliar a reação do camundongo após cada aplicação. Repita com o filamento mesmo ea pata esquerda de qualquer outros ratos, e depois começar tudo de novo com a pata direita do mouse antes de passar para a próxima filamento, por exemplo:
- Rato 1: pata esquerda 5 vezes com filamentos de 0,02 g
- Mouse 2: pata esquerda 5 vezes com filamentos de 0,02 g etc
- Rato 1: pata direita 5 vezes com filamentos de 0,02 g
- Mouse 2: pata direita 5 vezes com filamentos de 0,02 g etc
- Rato 1: pata esquerda 5 vezes com filamentos de 0,04 g
- Mouse 2: pata esquerda 5 vezes com filamentos de 0,04 g etc
- Resposta em três dos cinco estímulos é considerada como uma reação positiva. Filamentos acima threshold pode ser aplicado para verificar o nível do limiar.
Resposta = retirada pata súbita, repentina vacilar pata, lambendo súbita.
6. Resultados representativos
Figura 1. Von Frey testes em camundongos C57BL / 6 ratos idade 80-10 semanas de idade foi realizada um dia antes da operação e repetidamente após a cirurgia. 4-8 animais foram incluídos em cada grupo. Von Frey testes do lado operado é representado por ipsilateral com o lado controle não operado é representado por contralateral. O dia após a cirurgia os animais desenvolvem hipersensibilidade significativo sobre a pata operada enquanto o não operado é apenas ligeiramente afetada em relação aos ratos sham operados. (* <0,05, ** <0,01, *** <0,001, em relação ao contralateral ipsilateral).
Discussion
Etapas críticas
Danos ao nervo sural devem ser evitados a fim de estudar alterações patológicas na lesão do nervo sural seguintes intacto para os nervos tibial e fibular comum. Danos colaterais do nervo sural pode levar à paralisia e pode assim ser visualizado como arrastar do membro operado traseiras.
Apenas o lado lateral da pata é inervado pelo nervo sural poupado e, portanto, apenas esta área desenvolve neuropatia. Testes de outras áreas, inervados pelos nervos seccionados, pode viés fortemente a avaliação do limiar de mecânica alterada.
Possíveis modificações
Outros tipos de ligaduras podem ser complementares em termos de estudar as condições de dor patológica após a lesão do nervo periférico, como a lesão constrição crônica [5] ou ligadura parcial do nervo [6]. Cada experimental procedimento resulta em alterações fenotípicas distintas que devem ser considerados antes da pós-operatório de testes.
Além disso, outros testes sensoriais, tais como hiperalgesia térmica pode ser aplicada [7], embora este fenótipo é menos robusto SNI seguinte.
Aplicações futuras
Esta técnica pode ser usada para testes de drogas alteram o desenvolvimento ou manutenção de alodinia mecânica [8]. Análise do nervo ciático, os gânglios da raiz dorsal (DRG) e / ou o cabo de coluna lombar permitir a investigação dos mecanismos moleculares responsáveis pelo fenótipo induzido.
Experimentação animal foi realizada de acordo com boas práticas de laboratório em plena conformidade com os regulamentos dinamarquês e europeu. Todos os experimentos foram aprovados pelo dinamarquês Experimentos em animais Inspecção do Ministério da Justiça (número de permissão 2006/561-1206).
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Lundbeck, a Fundação Carlsberg e Dagmar Marshall Foundation.
References
- Costigan, M., Scholz, J., Woolf, C. J. Neuropathic pain: a maladaptive response of the nervous system to damage. Annu. Rev. Neurosci. 32, 1-32 (2009).
- Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87, 149-158 (2000).
- Bourquin, A. -F., Süveges, M., Pertin, M., Gilliar, N., Sardy, S., Davidson, A. C., Spahn, D. R., Decosterd, I. Assessment and analysis of mechanical allodynia-like behavior induced by spared nerve injury (SNI) in the mouse. Pain. 122, 14.e1-14.e14 (2006).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J. Neurosci. Methods. 53, 55-63 (1994).
- Bennett, G. J., Xie, Y. -K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33, 87-107 (1988).
- Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 43, 205-218 (1990).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutanous hyperalgesia. Pain. 32, 77-88 (1988).
- Erichsen, H. K., Blackburn-Munro, G. Pharmacological characterization of the spared nerve injury model of neuropathic pain. Pain. 98, 151-161 (2002).
