Summary
גישה אמין ושימושי כדי לזהות שינויים היסטון על גנים ספציפיים צמח מתואר. הגישה משלבת הכרומטין immunoprecipitation (שבב) בזמן אמת PCR כמותי. היא מאפשרת זיהוי של שינויים היסטון על גנים ספציפיים עם תפקיד בתהליכים פיזיולוגיים שונים.
Abstract
מבנה הכרומטין חשוב בוויסות של ביטוי גנים אאוקריוטים. בתהליך זה, שיפוץ הכרומטין, מתילציה DNA, שינויים קוולנטיים על אמינו מסוף הזנבות של ההיסטונים H3 ו-H4 ממלאים תפקידים חיוניים 1-2. H3 ו-H4 שינויים היסטון כוללים מתילציה של ליזין ארגינין, acetylation של ליזין, ו זרחון של שיירי סרין 1-2. שינויים אלו קשורים גם עם הפעלת הגן, דיכוי, או מדינה ערוכה של הגן התומכת הפעלה מהירה יותר וחזקה הביטוי אחרי תפיסה של אותות המתאים (חיידק הקשורים דפוסי מולקולרית, אור, הורמונים וכו '), 3-7.
כאן, אנו מציגים שיטה לגילוי אמין ורגיש של שינויים הכרומטין גנים ספציפיים על הצמח הנבחר. הטכניקה מבוססת על crosslinking של (שינה) היסטונים ו-DNA עם 8,9 פורמלדהיד, מיצוי sonication של הכרומטין, הכרומטין immunoprecipitation (שבב) עם נוגדנים ספציפיים שינוי 9,10, דה crosslinking-DNA של היסטון קומפלקסים, ו גנים ספציפיים בזמן אמת PCR כמותי. הגישה הוכיחה שימושי לאיתור שינויים היסטון ספציפיות הקשורות הפוטוסינתזה C 4 ב 5,11 תירס חסינות מערכתי 3 ארבידופסיס.
Protocol
1. Crosslinking של חומר צמחי
- קציר 1-2G עלים ארבידופסיס (6 לקוטר שושנת 10 ס"מ) בתוך שפופרת 50 מ"ל פלסטיק למלא עד 40mL עם חיץ crosslinking.
- ודא עלים להישאר שקוע, למשל על ידי מלית זכות המותאמים ספוג לסנן מעל פני השטח חיץ. אז במקום צינורות ייבוש.
- אבק לחדור עבור 10min. כדי להוסיף צינור כל 2.5mL של גליצין 2M להפסיק crosslinking, וכן להפוך צינורות כדי להצדיק פיזור שווה של גליצין.
- אבק לחדור עבור 5min נוסף וזורקים נוזל תוך קצירת העלים על מסננת.
- שטפו פעמיים עם העלים 1 ליטר של מים בכוס זכוכית, אז העלים היבשים ביסודיות בעזרת מגבות נייר.
- איסוף העלים בצינור פלסטיק טריים להקפיא בחנקן נוזלי. חנות יוצאת בשעה -80 ° C עד הבידוד הכרומטין.
2. בידוד של הכרומטין
- עלים היו הקרקע עם מרגמה פיסטיל כי הוחזקו חנקן נוזלי עד לשימוש.
- העברת אבקת שפופרת 50 מ"ל פלסטיק להשעות במאגר מיצוי 30 מ"ל # 1.
- דגירה עבור 15min ב 4 ° C על שייקר תקורה.
- תסנין ההשעיה דרך ארבע שכבות של miracloth לתוך צינור 50 מ"ל טרי פלסטיק.
- ספין עבור 20min XG ב 2800 ב 4 ° C.
- הסר supernatant ו להשעות גלולה עם מברשת צבע במאגר מיצוי 1mL # 2. ראשית להוסיף נפח קטן של חיץ # 2, אז להשעות גלולה עם מברשת צבע, ולאחר מכן להוסיף את שאר חיץ.
- העברת ההשעיה לצינור microfuge ספין 1.5mL עבור 10min ב XG 12,000 ב 4 ° C.
- בינתיים, להכין 2ml-microfuge צינורות המכיל מאגר מיצוי 1.5mL # 3.
- הסר supernatant מהצינור סובב (שלב 2.7) ו להשעות גלולה ב 300μL של חיץ מיצוי # 3. ראשית להוסיף נפח קטן של חיץ # 3, להשעות גלולה עם מברשת צבע, ולאחר מכן להוסיף את המאגר הנותרים.
- בזהירות pipet מושעה גלולה (שלב 2.9) על גבי החיץ 1.5 מ"ל מיצוי # 3 מוכן בשלב 2.8. ודא כי שני השלבים לא לערבב. ספין עבור 1h ב XG 16,000 ב 4 ° C.
- הסר supernatant ו להשעות הכרומטין גלולה עם מברשת צבע 300μL של חיץ sonication.
- Sonicate הכרומטין עם sonotrode, או באמבטיה קולי, לגודל ה-DNA של 400bp כ. כאשר sonicating, לעשות הכרומטין בטוח לא יהיה מחומם מעל כ -30 ° C כדי להגן רגישים לחום crosslinks. משך sonication צריך להיקבע באופן ניסיוני, כי זה משתנה באופן משמעותי בין התקנים sonication שונים. לקבלת הדרכה, ההגדרות עבור שני מכשירים שונים ניתנים:
עבור sonication עם sonotrode המותג Bandelin לחשוף הכרומטין בצינור microfuge 0.6mL חמש פעמים עד 20 התפרצויות עם הגדרות 25%, מחזור כוח = 50. תוך כדי כך, מדגם מגניב אחרי כל 20 התפרצויות ה באמבט קרח.
עבור sonication עם אמבטיה Diagenode Bioruptor קולי, למלא אמבטיה עם מים וקרח sonicate עשר פעמים במשך 30 שניות בתוך צינורות microfuge 1.5mL עם ההגדרה "גבוה". אחרי כל 30 שניות, דגימות מגניב עוד 30 שניות.
- ספין sonicated מדגם עבור 5min ב g 16,000 ב 4 ° C כדי לזרז חומר שלא נמס. Supernatant יכול ישירות לשמש immunoprecipitation. לחלופין, ניתן דגימות הלם קפוא בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
3. Immunoprecipitation
- הכן 2-mL צינורות microfuge המכיל חלבון 40μL agarose ו 1.8mL של חיץ נוגדן מחייב. הוסף 200μL של הכנת הכרומטין (שלב 2.13).
- דגירה צינורות עבור 1h על שייקר תקורה.
- בטל חלבון חרוזים agarose ולהשתמש supernatant עבור immunoprecipitation.
- הסרת 40μL-aliquot כדי לקבוע ריכוז הכרומטין ("קלט").
- הוסף 30μL חלבון agarose ואת כמות הנוגדנים שינוי ספציפי זה המצוין בטבלה שלהלן של ריאגנטים ספציפיים וציוד ההשעיה 400μL הכרומטין sonicated.
- דגירה עבור 2.5h או לילה על שייקר תקורה ב 4 ° C.
- ספין למטה חרוזים עבור 2min ב 440 x ז
- לשטוף עם חרוז גלולה 900μL של חיץ כל לשטוף (ראה רשימה להלן). במשך כל חיץ, חרוזים דגירה במאגר עבור 10min על שייקר ממעל על 4 מעלות צלזיוס, אז בשביל ספין 2min ב XG 440, להשליך supernatant, ולהוסיף את המאגר הבא.
- מלח נמוכה לשטוף חיץ
- מלח גבוהה לשטוף חיץ
- LiCl לשטוף חיץ
- TE לשטוף חיץ
- לאחר לשטוף הסופי, להסיר לחלוטין כל חיץ הנותרים.
4. De-crosslinking של היסטונים ו-DNA, וטיהור של ה-DNA זירז
- הוסף 100μL של חיץ דה crosslinking של גלולה agarose מדגם "קלט" את 40μl משלב 3.4, תערובת של 5min על מערבל מערבולת, דגימות ספין, incuבייט ב 65 ° C במשך הלילה.
- לטהר DNA עם DNA מסחרי או ערכת טיהור PCR.
- בדרך כלל 5μl של דילול של 1:05 eluate הטור הסופי מספיקים כדי לבצע קונבנציונאלי מוקד ספציפי בזמן אמת כמותי RT-PCR (RT-qPCR).
5. טבלה של מאגרים
| Crosslinking חיץ | |
| סודיום בוטיראט | 10mm |
| סוכרוז | 400mm |
| טריס-HCl, pH 8.0 | 10mm |
| β-Mercaptoethanol | 5mm |
| פורמלדהיד | 3% (V / V) |
| הפקת המאגר # 1 | |
| סודיום בוטיראט | 10mm |
| סוכרוז | 400mm |
| טריס-HCl, pH 8.0 | 10mm |
| β-Mercaptoethanol | 5mm |
| מעכבי פרוטאז השלם | 1x |
| הפקת המאגר # 2 | |
| סודיום בוטיראט | 10mm |
| סוכרוז | 250mm |
| טריס-HCl, pH 8.0 | 10mm |
| β-Mercaptoethanol | 5mm |
| MgCl 2 | 10mm |
| טריטון X-100 | 1% (w / v) |
| מעכבי פרוטאז השלם | 1x |
| הפקת המאגר # 3 | |
| סודיום בוטיראט | 10mm |
| סוכרוז | 1.7M |
| טריס-HCl, pH 8.0 | 10mm |
| β-Mercaptoethanol | 5mm |
| MgCl 2 | 2mm |
| טריטון X-100 | 0.15% (w / v) |
| מעכבי פרוטאז השלם | 1x |
| Sonication חיץ | |
| טריס-HCl, pH 8.0 | 25mm |
| EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 | 5mm |
| SDS | 0.5% (w / v) |
| מעכבי פרוטאז השלם | 1x |
| נוגדן מחייב חיץ | |
| טריס-HCl, pH 8.0 | 50mm |
| EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 | 1mm |
| NaCl | 150mm |
| טריטון X-100 | 0.1% (w / v) |
| מלח נמוכה לשטוף חיץ | |
| NaCl | 150mm |
| SDS | 0.1% (w / v) |
| טריטון X-100 | 1% (w / v) |
| EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 | 2mm |
| טריס-HCl, pH 8.0 | 20mm |
| מלח גבוהה לשטוף חיץ | |
| NaCl | 500mm |
| SDS | 0.1% (w / v) |
| טריטון X-100 | 1% (w / v) |
| EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 | 2mm |
| טריס-HCl, pH 8.0 | 20mm |
| LiCl לשטוף חיץ | |
| ליתיום כלוריד | 250mm |
| Nonidet-P40 | 1% (V / V) |
| נתרן desoxycholate | 1% (w / v) |
| EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 | 1mm |
| טריס-HCl, pH 8.0 | 20mm |
| TE לשטוף חיץ | |
| EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 | 10mm |
| טריס-HCl, pH 8.0 | 1mm |
| Decrosslinking חיץ | |
| טריס-HCl, pH 6.8 | 62.5mM |
| NaCl | 200mm |
| SDS | 2% (w / v) |
| DTT | 10mm |
6. נציג התוצאות:
הביטוי של הגן ארבידופסיס thaliana PR2 הגנה קידוד β-1,3-glucanase עם פעילות מיקרוביאלית 12, הנגרמת על ידי benzothiadiazole (BTH), אנלוגי סינתטי של חומצה סליצילית הורמון צמח 3. איור 1 מראה כי הפעלת הביטוי PR2 קשורה לעלייה acetylation של שאריות ליזין על היסטון H3 ו-H4 על האמרגן PR2. מאז צפיפות הנוקלאוזום פוחתת במהלך הפעלת הגנים 13, ערכים acetylation היסטון היו מנורמל עבור האות המתקבל עם נוגדן לאזור משתנה של היסטון 3.
איור 1 BTH גורם acetylation היסטון על האמרגן PR2 ב ארבידופסיס. צמחים שטופלו 100μM BTH או פקד אבקת wettable. לאחר 72h, העלים נאספו הכרומטין היה מבודד. האות המתקבל לאחר משקעים עם נוגדנים ספציפיים acetylation (כמצוין באיור) היה מנורמל לאות מתקבל על ידי משקעים עם נוגדן ל תחום משתנה של היסטון H3. הכרומטין זירז היה לכמת על ידי RT-qPCR. הנתונים סטנדרטי עבור רמות שינוי היסטון בהעדר טיפול BTH.
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם crosslinking של דנ"א ההיסטונים, סוג וכמות החומר עלה, שחיקה של החומר, ואת sonication של הכרומטין. לדיון מפורט יותר של סוגיות אלה, ראה השופטים. 9 ו -10.
Sonication ו crosslinking:
חשוב לשבש הכרומטין במהלך sonication כדי שברי על 400bp. Sonication ממצה יהרוס הכרומטין ע"י שיבוש דנ"א ההיסטונים, ואילו sonication מספיק יותיר שברים הכרומטין ארוך. אלו משפיעים על סגוליות של השיטה, כי שינויים היסטון דיסטלי של מוקד שנבדקו לא ניתן להפלות בין שינויים מקומיים. יעילות Sonication נבדק הטובה ביותר על ידי איסוף דגימות הכרומטין 20μL לפני ואחרי ה-DNA, דה crosslinking sonication ו ההיסטונים, בידוד דנ"א בקביעת אורכו של ה-DNA טעון על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. RNAse יש להוסיף את דגימות לפני אלקטרופורזה, משום הכנה הכרומטין עדיין מכיל כמויות גדולות של RNA בשלב הזה של טיהור שעשוי להפריע להדמיה של ה-DNA מקוטעת. הדגימות שימושיים immunoprecipitation הכרומטין אם דנ"א הכרומטין אי טעון ארוך יותר 10kbp, בעוד ה-DNA של הכרומטין טעון צורות כתם עם עוצמת אות מקסימלית סביב 400bp של ה-DNA.
אנו משתמשים באופן שגרתי 3% (v / v) פורמלדהיד עבור crosslinking הכרומטין בעלים שלמים, אבל 1% (v / v) פורמלדהיד עשוי להיות מספיק ברוב המקרים. בידיים שלנו, פורמלדהיד בריכוזים נמוכים מאפשרים פעמים sonication קצר אותות רקע עקב התגובות PCR. עם זאת, כמויות מספיקות של פורמלדהיד לעיתים לגרום reproducibility נמוך של האות PCR בין ניסויים עצמאיים. זה יכול להיות בגלל חדירה מספקת של עלים עם פורמלדהיד בריכוזים נמוכים. הקפד בורסה פורמלדהיד שלך בתדירות גבוהה ככל במתחם נוטה לפלמר עם הזמן. פורמלדהיד פתרונות יציבים רק למשך חודש אחד בערך, וגם זה בקושי תקופה ממושכת על ידי ייצוב מתנול. מומלץ לבדוק את ריכוזי פורמלדהיד שונים בעת הגדרת תנאי הניסוי.
כמות של חומר צמחי וטחינה:
חשוב לחדור כמויות נמוכות של החומר עלה בנפח גדול של חיץ כדי למנוע עלים דבוקים זה לזה. ליף דבק לעתים קרובות תוצאות חדירה מספקת של פורמלדהיד. יתר על כן, חומר צמחי רב מדי יחסום נקבוביות של הרקמה miracloth. יעילות שחיקה ניכרת תלוי בעזרת מכתש ועלי עם התאמה מושלמת. אנו שגרתי לטחון עם העלי חנקן נוזלי מקורר ו מרגמה בהעדר חנקן נוזלי נוספות שלוש פעמים במשך 50 שניות עד החומר הקרקע לאבקה דקה.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי קרן המדע הגרמנית (DFG) ויוזמת מצוינות של ממשלות פדרליות ואת המדינה הגרמנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein-A-Agarose | Roche Group | 11 134 515 001 | depends on the antibody class |
| Protein-G-Agarose | Roche Group | 11 243 233 001 | depends on the antibody class |
| Anti-hyperacetyl-H4 | EMD Millipore | 06-946 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K5 | EMD Millipore | 07-327 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K8 | EMD Millipore | 07-328 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K12 | EMD Millipore | 07-595 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K16 | EMD Millipore | 07-329 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K18 | EMD Millipore | 07-354 | we used 1μL |
| Anti-acetyl-H3K9 | EMD Millipore | 07-352 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H3K14 | EMD Millipore | 07-353 | we used 1μL |
| Anti-trimethyl-H3K4 | Diagenode | pAB-003-50 | we used 5μL |
| Anti-dimethyl-H3K4 | EMD Millipore | 07-030 | we used 5μL |
| Anti-monomethyl-H3K4 | Abcam | ab8895 | 2,5 -10μL |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | we used 1μL to check histone density |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 TO | |
| Sonotrode MS72 | Bandelin | ||
| Miracloth | Calbiochem | 475855 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche Group | 11836145001 |
References
- Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO rep. 3, 224-229 (2002).
- Ruthenburg, A. J. Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic. 25, 15-30 (2007).
- Jaskiewicz, M. Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response. EMBO rep. 12, 50-55 (2011).
- Ng, D. W. Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter. Plant Cell. 18, 119-132 (2006).
- Offermann, S. Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize. Plant Physiol. 141, 1078-1088 (2006).
- Deng, W. Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis. Plant Physiol. 143, 1660-1668 (2007).
- Benhamed, M. Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression. Plant Cell. 18, 2893-2903 (2006).
- Bowler, C. Chromatin techniques for plant cells. Plant Journal. 39, 776-789 (2004).
- Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem. Sci. 25, 99-104 (2000).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Meth. 3, 11-11 (2007).
- Danker, T. Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize. Plant J. 53, 465-474 (2008).
- Uknes, S. Acquired resistance in Arabidopsis. Plant Cell. 4, 645-656 (1992).
- Workman, J. L. Nucleosome displacement in transcription. Genes Develop. 20, 2009-2017 (2006).
