Summary
विशिष्ट पौधों के जीन पर histone संशोधनों का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय और उपयोगी दृष्टिकोण वर्णित है. दृष्टिकोण chromatin immunoprecipitation (चिप) और वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर को जोड़ती है. यह विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं में एक भूमिका के साथ विशिष्ट जीन पर histone संशोधनों का पता लगाने की अनुमति देता है.
Abstract
Chromatin संरचना eukaryotes में जीन अभिव्यक्ति के नियमन के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रक्रिया में, histones H3 H4 और एमिनो टर्मिनल पूंछ पर chromatin remodeling, डीएनए मेथिलिकरण, और सहसंयोजक संशोधनों के आवश्यक भूमिका 1-2 निभाते हैं . H3 और H4 histone संशोधनों lysine और arginine मेथिलिकरण, lysine का एसिटिलीकरण, और सेरीन 1-2 अवशेषों की phosphorylation शामिल हैं. इन संशोधनों या तो जीन सक्रियण, दमन, या जीन कि अभिव्यक्ति की उचित (सूक्ष्म जीव जुड़े आणविक पैटर्न, प्रकाश, हार्मोन, आदि) संकेतों 3-7 की धारणा के बाद अधिक तेजी से और मजबूत सक्रियण का समर्थन करता है की एक primed राज्य के साथ जुड़े रहे हैं.
यहाँ, हम चयनित संयंत्र जीन पर विशिष्ट chromatin संशोधनों के विश्वसनीय और संवेदनशील पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. (संशोधित) 8,9 formaldehyde, निष्कर्षण और संशोधन विशिष्ट 9,10 एंटीबॉडी के साथ chromatin, chromatin immunoprecipitation (चिप) के sonication के साथ histones और डीएनए के crosslinking तकनीक पर आधारित है, histone - डीएनए परिसरों के डी - crosslinking , और जीन विशिष्ट वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर. दृष्टिकोण विशिष्ट histone 5,11 मक्का में 4 सी संश्लेषण और 3 Arabidopsis में प्रणालीगत रोगक्षमता के साथ जुड़े संशोधनों का पता लगाने के लिए उपयोगी साबित हो गया है.
Protocol
1. संयंत्र सामग्री के Crosslinking
- हार्वेस्ट 1-2g 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में Arabidopsis (6 10cm थाली व्यास) पत्तियों और 40ml crosslinking बफर के साथ भरने के.
- सुनिश्चित करें कि पत्तियों डूबे रहने के लिए, उदाहरण के लिए बफर सतह के ऊपर एक सिलवाया फिल्टर स्पंज सही भराई बनाओ. फिर एक desiccator में ट्यूबों की जगह है.
- वैक्यूम 10min के लिए घुसपैठ. प्रत्येक ट्यूब 2M ग्लाइसिन के 2.5ml जोड़ने के लिए crosslinking रोक, और ट्यूबों पलटना ग्लाइसिन के बराबर फैलाव वारंट.
- वैक्यूम दूसरे 5min के लिए घुसपैठ और तरल पदार्थ त्यागने जबकि एक चलनी पर पत्तियों की कटाई.
- धो दो बार पानी का एक गिलास बीकर में 1L, तो कागज तौलिये के साथ अच्छी तरह से सूखे पत्ते के साथ छोड़ देता है.
- एक ताजा प्लास्टिक ट्यूब में पत्तियों को ले लीजिए और तरल नाइट्रोजन में फ्रीज. स्टोर -80 पर पत्ते ° सी जब तक chromatin अलगाव.
2. Chromatin के अलगाव
- पत्तियां मोर्टार और जायांग कि तरल नाइट्रोजन में उपयोग करें जब तक रखा गया था के साथ जमीन थे.
- 50 एमएल प्लास्टिक ट्यूब स्थानांतरण पाउडर और 30ml निष्कर्षण बफर # 1 में निलंबित हैं.
- 4 ° C में 15min के लिए एक ओवरहेड हिलनेवाला पर सेते हैं.
- छानना निलंबन miracloth के चार परतों के माध्यम से एक ताजा 50 एमएल की प्लास्टिक ट्यूब में.
- 4 में 2800 XG में 20min के लिए स्पिन डिग्री सेल्सियस
- निकालें सतह पर तैरनेवाला और 1ml निष्कर्षण बफर # 2 में एक पेंट ब्रश के साथ गोली निलंबित. पहले # 2 बफर की एक छोटी मात्रा जोड़ने के लिए, तो एक पेंट ब्रश के साथ गोली निलंबित, और फिर बफर के बाकी जोड़ें.
- 1.5mL microfuge ट्यूब और स्पिन निलंबन 10min के लिए 4 में स्थानांतरण 12,000 XG पर डिग्री सेल्सियस
- इस बीच, 2ml microfuge 1.5mL निष्कर्षण बफर # 3 युक्त ट्यूबों तैयार करते हैं.
- काता ट्यूब (2.7 कदम) से सतह पर तैरनेवाला निकालें और 300μL निष्कर्षण बफर # 3 में गोली निलंबित. # 3 बफर के पहले एक छोटी मात्रा जोड़ने के लिए, एक पेंट ब्रश के साथ गोली निलंबित, और तब शेष बफर जोड़ने.
- ध्यान pipet 1.5 एमएल निष्कर्षण # 3 बफर 2.8 चरण में तैयार के शीर्ष पर गोली (2.9 कदम) को निलंबित कर दिया. सुनिश्चित करें कि दो चरणों मिश्रण नहीं होगा. 4 में +१६००० XG 1 के लिए स्पिन डिग्री सेल्सियस
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और sonication बफर के 300μL में एक पेंट ब्रश के साथ chromatin गोली निलंबित.
- Sonotrode के साथ, या एक अल्ट्रासोनिक स्नान में chromatin लगभग 400bp की एक डीएनए आकार के Sonicate. जब sonicating बनाने के लिए, यकीन है कि chromatin लगभग 30 से ऊपर नहीं गर्म ° सी गर्मी के प्रति संवेदनशील crosslinks की रक्षा के लिए. sonication की अवधि प्रयोगात्मक निर्धारित किया है, क्योंकि यह काफी अलग sonication उपकरणों के बीच बदलता है की जरूरत है. मार्गदर्शन के लिए, दो अलग अलग उपकरणों के लिए सेटिंग्स प्रदान की जाती हैं:
Bandelin ब्रांड 0.6mL microfuge ट्यूब में sonotrode बेनकाब chromatin सेटिंग्स 25% शक्ति, चक्र, = 50 के साथ पाँच बार 20 फटने के साथ sonication के लिए. ऐसा करते समय, एक बर्फ स्नान में हर 20 वें फटने के बाद शांत नमूना .
एक Diagenode Bioruptor अल्ट्रासोनिक स्नान के साथ sonication के लिए, पानी और बर्फ के साथ स्नान भरने और 1.5mL microfuge ट्यूबों में 30 सेकंड के लिए सेटिंग 'उच्च' के साथ दस बार sonicate. हर 30 सेकंड के बाद, एक और 30 सेकंड के लिए शांत नमूने.
- स्पिन 5min में 4 के लिए नमूना 16,000 जी पर sonicated ° सी undissolved सामग्री वेग. सतह पर तैरनेवाला सीधे immunoprecipitation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, नमूने तरल नाइट्रोजन में जमे हुए और आगे उपयोग ° जब तक सी -80 पर संग्रहीत सदमे जा सकता है.
3. Immunoprecipitation
- 2 एमएल microfuge 40μL प्रोटीन एक agarose और एंटीबॉडी बाध्यकारी बफर के 1.8mL. युक्त ट्यूबों तैयार Chromatin तैयारी के 200μL (2.13 कदम) जोड़ें.
- एक ओवरहेड हिलनेवाला पर 1 के लिए ट्यूबों सेते हैं.
- प्रोटीन एक agarose मोती त्यागें और immunoprecipitation के लिए सतह पर तैरनेवाला उपयोग.
- Chromatin एकाग्रता ('इनपुट') का निर्धारण एक 40μL - विभाज्य निकालें.
- जोड़ें 30μL प्रोटीन एक agarose और संशोधन विशिष्ट एंटीबॉडी कि विशिष्ट अभिकर्मकों 400μL sonicated chromatin निलंबन के लिए और उपकरणों के नीचे तालिका में संकेत दिया है की राशि.
- 4 बजे 2.5h या एक उपरि हिलनेवाला पर रात भर के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- नीचे 440 x जी पर मोती स्पिन 2min के लिए
- (देखें नीचे दी गई सूची) 900μL प्रत्येक धोने बफर के साथ मनका गोली धो लें. प्रत्येक बफर 10min के लिए बफर में 4 पर एक उपरि हिलनेवाला ° सी, पर सेते मोती तो 2min के लिए 440 XG पर स्पिन, सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए, और अगले बफर जोड़ें.
- कम नमक धोने बफर
- उच्च नमक धोने बफर
- LiCl धोने बफर
- ते धोने बफर
- अंतिम धोने के बाद, पूरी तरह से किसी भी शेष बफर हटा दें.
4. Histones और डीएनए के डी crosslinking, और उपजी डीएनए की शुद्धि
- Agarose गोली और 3.4 कदम से 40μl 'इनपुट' नमूना, 5min के लिए एक भंवर मिक्सर पर मिश्रण, स्पिन के नमूने, और incu डे - crosslinking बफर के 100μL जोड़ें65 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर ग़ुस्सा.
- एक वाणिज्यिक डीएनए या पीसीआर शुद्धि किट के साथ डीएनए शुद्ध.
- आमतौर पर अंतिम स्तंभ eluate के कमजोर पड़ने 1:05 5μl प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त हैं पारंपरिक ठिकाना विशिष्ट वास्तविक समय मात्रात्मक RT-पीसीआर (RT-qPCR).
5. Buffers की तालिका
| Crosslinking बफर | |
| सोडियम butyrate | 10mm |
| इक्षुसिता | 400mm |
| Tris - एचसीएल, 8.0 पीएच | 10mm |
| β-Mercaptoethanol | 5mm |
| Formaldehyde | 3% (v / वी) |
| निष्कर्षण बफर # 1 | |
| सोडियम butyrate | 10mm |
| इक्षुसिता | 400mm |
| Tris - एचसीएल, 8.0 पीएच | 10mm |
| β-Mercaptoethanol | 5mm |
| पूरा protease अवरोध करनेवाला | 1x |
| निष्कर्षण बफर # 2 | |
| सोडियम butyrate | 10mm |
| इक्षुसिता | 250mm |
| Tris - एचसीएल, 8.0 पीएच | 10mm |
| β-Mercaptoethanol | 5mm |
| 2 MgCl | 10mm |
| Triton एक्स - 100 | 1% (w / ध्) |
| पूरा protease अवरोध करनेवाला | 1x |
| निष्कर्षण बफर # 3 | |
| सोडियम butyrate | 10mm |
| इक्षुसिता | 1.7m |
| Tris - एचसीएल, 8.0 पीएच | 10mm |
| β-Mercaptoethanol | 5mm |
| 2 MgCl | 2mm |
| Triton एक्स - 100 | 0.15% (w / v) |
| पूरा protease अवरोध करनेवाला | 1x |
| Sonication बफर | |
| Tris - एचसीएल, 8.0 पीएच | 25mm |
| EDTA NaOH, 8.0 पीएच | 5mm |
| एसडीएस | 0.5% (w / v) |
| पूरा protease अवरोध करनेवाला | 1x |
| एंटीबॉडी बंधनकारी बफर | |
| Tris - एचसीएल, 8.0 पीएच | 50mm |
| EDTA NaOH, 8.0 पीएच | 1mm |
| NaCl | 150mm |
| Triton एक्स - 100 | 0.1% (w / v) |
| कम नमक धोने बफर | |
| NaCl | 150mm |
| एसडीएस | 0.1% (w / v) |
| Triton एक्स - 100 | 1% (w / ध्) |
| EDTA NaOH, 8.0 पीएच | 2mm |
| Tris - एचसीएल, 8.0 पीएच | 20mm |
| उच्च नमक धोने बफर | |
| NaCl | 500mm |
| एसडीएस | 0.1% (w / v) |
| Triton एक्स - 100 | 1% (w / ध्) |
| EDTA NaOH, 8.0 पीएच | 2mm |
| Tris - एचसीएल, 8.0 पीएच | 20mm |
| LiCl धोने बफर | |
| लिथियम क्लोराइड | 250mm |
| Nonidet-P40 | 1% (v / वी) |
| सोडियम desoxycholate | 1% (w / ध्) |
| EDTA NaOH, 8.0 पीएच | 1mm |
| Tris - एचसीएल, 8.0 पीएच | 20mm |
| ते धोने बफर | |
| EDTA NaOH, 8.0 पीएच | 10mm |
| Tris - एचसीएल, 8.0 पीएच | 1mm |
| Decrosslinking बफर | |
| Tris - एचसीएल, 6.8 पीएच | 62.5mM |
| NaCl | 200mm |
| एसडीएस | 2% (w / v) |
| डीटीटी | 10mm |
6. प्रतिनिधि परिणाम:
Arabidopsis thaliana PR2 रक्षा जीन की अभिव्यक्ति β-एन्कोडिंगरोगाणुरोधी 12 गतिविधि के साथ 1,3 glucanase (BTH) benzothiadiazole, संयंत्र हार्मोन चिरायता एसिड 3 की एक कृत्रिम अनुरूप द्वारा प्रेरित किया गया था चित्रा 1 PR2 अभिव्यक्ति की है कि सक्रियण को दर्शाता है. Histone पर लाइसिन अवशेषों का एसिटिलीकरण में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है H3 और PR2 प्रमोटर पर H4. चूंकि nucleosome घनत्व जीन 13 सक्रियण के दौरान घट जाती है, histone एसिटिलीकरण मूल्यों एक एंटीबॉडी के साथ 3 histone का एक अपरिवर्तनीय क्षेत्र के लिए प्राप्त संकेत के लिए सामान्यीकृत किया गया.
चित्रा 1 BTH Arabidopsis में PR2 प्रमोटर पर histone एसिटिलीकरण लाती है. संयंत्रों 100μM BTH या एक wettable पाउडर नियंत्रण के साथ इलाज किया गया. 72h के बाद, पत्तियों को एकत्र किया गया और chromatin पृथक किया गया. एसिटिलीकरण विशिष्ट एंटीबॉडी (के रूप में आकृति में संकेत दिया) के साथ वर्षा के बाद प्राप्त संकेत histone H3 की एक अपरिवर्तनीय डोमेन के लिए एक एंटीबॉडी के साथ तेज़ी से प्राप्त संकेत करने के लिए सामान्यीकृत था. उपजी chromatin RT-qPCR द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था. डेटा BTH से उपचार के अभाव में histone संशोधन के स्तर के लिए मानकीकृत कर रहे हैं.
Discussion
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम डीएनए और histones, पत्ता सामग्री के प्रकार और मात्रा के crosslinking हैं, सामग्री के पीस, और chromatin के sonication. इन मुद्दों के एक अधिक विस्तृत चर्चा के लिए, refs देखें. 9 और 10.
Sonication और crosslinking:
यह महत्वपूर्ण है 400bp के बारे में टुकड़े करने के लिए sonication के दौरान chromatin बाधित. संपूर्ण sonication डीएनए और histones में खलल न डालें द्वारा chromatin नष्ट, जबकि अपर्याप्त sonication लंबी chromatin टुकड़े छोड़ जाएगा. ये विधि की विशिष्टता को प्रभावित है, क्योंकि परीक्षण बिन्दुपथ से बाहर का histone संशोधनों स्थानीय संशोधनों से भेदभाव नहीं कर सकते हैं. Sonication दक्षता सर्वश्रेष्ठ 20μL chromatin एकत्रित नमूनों से पहले और बाद sonication, डीएनए डे crosslinking और histones, डीएनए अलग और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा sheared डीएनए की लंबाई निर्धारित करने के द्वारा परीक्षण किया है. RNase वैद्युतकणसंचलन पहले नमूने के लिए जोड़ा जाना चाहिए, क्योंकि chromatin तैयारी शुद्धि है कि खंडित डीएनए के दृश्य के साथ हस्तक्षेप कर सकता है की इस स्तर पर अभी भी शाही सेना की बड़ी मात्रा में होता है है. नमूने chromatin immunoprecipitation के लिए उपयोगी होते हैं यदि गैर - sheared chromatin से डीएनए 10kbp से अधिक लंबी है, जबकि sheared chromatin से डीएनए डीएनए के 400bp आसपास अधिकतम संकेत तीव्रता के साथ एक धब्बा रूपों है.
हम नियमित रूप से बरकरार पत्तियों में chromatin crosslinking के लिए तीन (v / v)% formaldehyde उपयोग करते हैं, लेकिन एक (v / v)% formaldehyde के ज्यादातर मामलों में पर्याप्त हो सकता है. हमारे हाथ में, कम formaldehyde सांद्रता कम sonication और समय फलस्वरूप पीसीआर प्रतिक्रियाओं में पृष्ठभूमि संकेतों के लिए अनुमति देते हैं. हालांकि, formaldehyde के अपर्याप्त मात्रा में अक्सर स्वतंत्र प्रयोगों के बीच पीसीआर संकेत के कम reproducibility में परिणाम. यह सांद्रता कम formaldehyde के साथ पत्तियों के अपर्याप्त पैठ की वजह से हो सकता है. अपने formaldehyde के शेयर अक्सर मुद्रा के रूप में मिश्रित करने के लिए समय के साथ भाजन करना आदत सुनिश्चित करें. Formaldehyde समाधान केवल लगभग एक महीने के लिए स्थिर रहे हैं, और इस अवधि शायद ही मेथनॉल स्थिरीकरण द्वारा लंबे समय तक है. यह जब प्रयोगात्मक शर्तों की स्थापना के लिए अलग formaldehyde सांद्रता का परीक्षण करने की सलाह दी है.
संयंत्र सामग्री की राशि और पीस:
यह महत्वपूर्ण है बफर की एक बड़ी मात्रा में पत्ता सामग्री की कम मात्रा में घुसपैठ करने के लिए एक दूसरे से चिपके हुए पत्ते से बचने. पत्ता चिपका formaldehyde के अपर्याप्त घुसपैठ में अक्सर परिणाम. इसके अलावा, बहुत ज्यादा संयंत्र सामग्री miracloth ऊतक के pores ब्लॉक जाएगा. पीस दक्षता और सही फिट के साथ एक मोर्टार और मूसल के प्रयोग पर काफी निर्भर करता है. हम नियमित रूप से एक तरल नाइट्रोजन ठंडा और अतिरिक्त तरल नाइट्रोजन के अभाव में मूसल और मोर्टार के साथ 50 सेकंड के लिए तीन बार जब तक सामग्री एक ठीक पाउडर के लिए जमीन है. पीसने
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम जर्मन विज्ञान फाउंडेशन (DFG) और जर्मन संघीय और राज्य सरकारों की उत्कृष्टता पहल द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein-A-Agarose | Roche Group | 11 134 515 001 | depends on the antibody class |
| Protein-G-Agarose | Roche Group | 11 243 233 001 | depends on the antibody class |
| Anti-hyperacetyl-H4 | EMD Millipore | 06-946 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K5 | EMD Millipore | 07-327 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K8 | EMD Millipore | 07-328 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K12 | EMD Millipore | 07-595 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K16 | EMD Millipore | 07-329 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K18 | EMD Millipore | 07-354 | we used 1μL |
| Anti-acetyl-H3K9 | EMD Millipore | 07-352 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H3K14 | EMD Millipore | 07-353 | we used 1μL |
| Anti-trimethyl-H3K4 | Diagenode | pAB-003-50 | we used 5μL |
| Anti-dimethyl-H3K4 | EMD Millipore | 07-030 | we used 5μL |
| Anti-monomethyl-H3K4 | Abcam | ab8895 | 2,5 -10μL |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | we used 1μL to check histone density |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 TO | |
| Sonotrode MS72 | Bandelin | ||
| Miracloth | Calbiochem | 475855 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche Group | 11836145001 |
References
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