Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

DNA-fingeravtryck av Mycobacterium leprae Stammar genom olika Upprepa Antal Tandem (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

Published: July 15, 2011 doi: 10.3791/3104

Summary

Spetälska, orsakad av

Abstract

Studiet av överföring av spetälska är särskilt svårt eftersom smittämnen, leprae Mycobacterium inte kan odlas i laboratoriet. De enda källorna till bakterier är spetälska patienter, och experimentellt infekterade bältdjur och nakna möss. Således är många av de metoder som används i moderna epidemiologin är inte tillgängliga för studier av spetälska. Trots en omfattande global medicinsk behandling för spetälska som genomförs av WHO 1, förblir spetälska endemisk i många länder med ungefär 250.000 nya fall varje år. 2 Hela M. leprae arvsmassa har kartlagts 3,4 och många loci har identifierats som har upprepade delar av två eller flera baspar (kallas mikro-och minisatellites). 5 kliniska stammar av M. leprae kan variera i antal tandem upprepade segment (kort tandem repeats, STR) på många av dessa loci. 5,6,7 varierande antal tandem repetera (VNTR) 5 analys har använts för att särskilja olika stammar av spetälska baciller. Några av de loci verkar vara mer stabil än andra, visar mindre variation i upprepa siffror, medan andra tycks förändras snabbare, ibland i samma patient. Medan variationen av vissa VNTRs har tagit upp frågor om deras lämplighet för stamtypning 7,8,9, den framväxande data tyder på att analysera flera loci, som är olika i sin stabilitet, kan användas som en värdefull epidemiologisk verktyg. Flera locus VNTR analys (MLVA) 10 har använts för att studera spetälska evolution och transmission i flera länder inklusive Kina 11,12, Malawi 8, Filippinerna 10,13, och Brasilien 14. MLVA involverar flera steg. För det första är bakteriellt DNA tillsammans med värdvävnaden DNA från kliniska biopsier eller springa fläckar huden (SSS). 10 Önskad loci sedan förstärks från den extraherade DNA via polymeraskedjereaktion (PCR). Fluorescerande-märkta grundfärger för 4-5 olika loci används per reaktion, med 18 loci förstärks i totalt fyra reaktioner. 10 PCR-produkter kan utsättas för agarosgelelektrofores att verifiera närvaron av önskat DNA-segment, och sedan lämnades för lysrör fragment längd analys (FLA) med hjälp av kapillärelektrofores. DNA från bältdjur passerats bakterier med ett känt antal upprepa kopior för varje locus används som positiv kontroll. FLA kromatogram undersöks sedan med hjälp av Peak Scanner mjukvara och fragment längd omvandlas till antal VNTR kopior (allel). Slutligen är VNTR haplotyper analyserades för mönster, och i kombination med patientens kliniska data kan användas för att spåra distributionen av stam typer.

Protocol

Syftet med denna videon artikel är att ge en överblick över arbetsflödet tillsammans med dataformat och tolkning för forskare som bara kan starta denna typ av arbete (Figur 1). Det omfattar demonstration av tekniker, förenklat protokoll och praktiska tips som beskrivs i tidigare publicerade verk. 5,10

Allmänna arbetsledare och laboratorium:

Det bör finnas minst 3 olika arbetsområden för denna typ av forskning. Laboratoriet bör ha 1) en pre-PCR-området med en PCR-huva (ren luft box eller isolerat arbete område) för primer förberedelse (utspädning, alikvot beredning och blandning), 2) en separat biologiskt säkra skåp för hantering och tillägg av DNA att PCR-blandningar, och 3) ett post-PCR arbetsområde för att förbereda och lastning geler och för att förbereda prover för FLA. Primers och DNA-prov bör hållas i separata frysar och kylskåp. Primer föroreningar är en av de viktigaste och mest bestående problem i laborationer av denna typ. Pipetter som används för grundfärger och PCR-mixar ska inte användas för DNA. Det bör finnas separata uppsättningar av pipetter för pre-PCR, PCR och post-PCR arbetsområden. Generellt kan en forskare bearbeta 12-18 prover i en 12-24 timmar med standard laboratorieutrustning.

Innan varje fas av arbetet:

  • Använd en skyddsrock och handskar. Handskar ska användas när som helst biologiska prover, primers, DNA och etidiumbromid hanteras. Byt handskar ofta.
  • Arbeta i en PCR-skåp huva, biosäkerhet skåp eller rent arbetsområdet.
  • Använd en ny bänk papper eller pad.
  • Sätt upp avfallsbehållare som lämpar sig för vätskor och tips pipett.
  • Torka med insidan av PCR huva och pipetter med 70% etanol.
  • Ämne pipetter och arbetsområdet för UV-ljus i 15 minuter innan PCR inrättas. (Ultraviolett ljus antipyridinantikropp ytan DNA föroreningar.)
  • Använd alltid aerosoler tips förebyggande pipett för material som innehåller DNA, primers och PCR reagenser.
  • Centrifugera alla rör / remsor / plattor som innehåller vätska innan den öppnas för att förhindra bildandet av aerosoler fly och korskontaminering av hantering.

1. M. leprae DNA-preparation

Kliniska prover som innehåller M. leprae erhålls från spetälska patienter som besöker hudkliniker. Rutin diagnostiska prover kan huden punsch biopsier, springa kladd hud eller nasal kompresser. Generellt punsch biopsier eller slitsar fläckar hud är det bästa för molekylär epidemiologi, eftersom de är rena och innehåller tillräckligt med M. leprae. Användning av dessa material för forskning måste vara godkända enligt institutionens riktlinjer.

  1. Bevara biopsi eller springa prover hud smeta på ett skruvlock injektionsflaska med 1 ml 70% etanol.
  2. Centrifugera varje prov i en variabel hastighet bänkbaserade centrifugera vid 12.000 xg under 15 minuter.
  3. Avlägsna supernatanten och placera den i ett mikrocentrifugrör. Vid behov kan det vara lämpligt att åter centrifug dessa prover och återhämta sig ytterligare vävnad eller DNA senare.
  4. Tillsätt 500 l av fosfat saltlösning (PBS) till vävnadsprover och njuta i 1 timme att byta kvarvarande etanol konserveringsmedel och återfuktar provet.
  5. Centrifugera proverna i en bänkbaserade centrifugera vid 12.000 xg under 20 minuter. Kassera PBS-lösning i en avfallsbehållare delvis fylld med desinfektionsmedel lösning.
  6. Utdrag bakteriellt DNA med Qiagen DNEasy blod och vävnad sats efter de föreskrivna riktlinjer.
  7. Extraherade DNA bör alikvoteras till 4 injektionsflaskor. Förvara 2 alikvoter vid -80 ° C för framtida bruk om / när reproducerbarhet av testresultat krävs eller när ny teknik blir tillgängliga. Förvara en alikvot vid -20 ° C och en vid 4 ° C i mer omedelbar användning.
  8. Det är klokt att förbereda ett utdrag blank "tillsammans med vävnadsprover. Den tomma utsätts för alla samma behandlingar som beskrivs ovan, men utförs utan vävnad. PCR utvinning tomt tillsammans med patientprover att garantera att operatörens utvinning teknik är korrekta och att reagens är fria från DNA-kontamination.

2. Primer förberedelse

  1. Grundfärg för lokus för vilka det är de mest omfattande stammen skriver in data finns i tabell 1. Fyra eller fem grundfärger kombineras för multiplex PCR. En primer för varje plats bär på en 5 "fluorescerande kemiska tagg som kommer att identifieras under kapillärelektrofores fragment längd analys (FLA).
  2. För varje multiplex PCR kombination är taggade primer och motsvarande omvända primer för varje locus kombineras i olika Eppendorf-rör: framåt grundfärg i ett rör, vända i en annan. Stock primers förberedda som 100μM lösningar (figur 2a), varav en delspäds 10x till en koncentration av 10 mikroM med TE (1x Tris-EDTA, pH 8,0). Återstående alikvoter av de 100 lösningarna mikroM primer lagras vid -20 ° C för senare användning.
  3. Lika mängder av varje 10 mikroM primer blandas resulterar i 2μM slutliga koncentrationer av varje grundfärg. När primern kombinationerna läggs till PCR-blandningen (tabell 3), sjunker den slutliga koncentrationen av varje primer till 0,2 mikroM.

När det kombinerade primers läggs till PCR-blandningar (tabell 3), slutkoncentrationer sjunka till 0.2μM vardera.

3. Förstärka bakteriellt DNA med multiplex PCR

  1. PCR-Setup
    • Spela in det antal prover som kommer att användas och förbereda ett kalkylblad med de reagenser och deras volymer innan samla in nödvändiga plast och andra material.
    • Märk sterila rör / band / plattor som ska användas för PCR med provnummer. Kom ihåg att inkludera positiva och negativa kontroller.
  2. Torka av termocykler med en rengöringslösning (till exempel Decon ELIMINase) och programmera den enligt tabell 2. Byt handskar efter rengöring och innan du hanterar primers och andra reagenser.
  3. Bered PCR Mastermix enligt Tabell 3 och etikett PCR-rör / band / tallrik med primern kombinationen och siffror prov som ska användas.
  4. Alikvotera 18μl av Mastermix till varje märkt PCR provrör eller bra. Byt handskar.
  5. Torka av en separat biosäkerhet skåp och pipetter med 70% etanol för att hjälpa rengöra och desinficera arbetsområdet och verktyg, sedan föremål arbetsområdet och pipetter för UV-ljus i 15 minuter att länka någon DNA föroreningar. Byt handskar.
  6. I den rena bio-säkra skåp, lägga 2μl av DNA-mallen på Mastermix i varje PCR-rör / plåt och att förvärva en total volym på 20μl (Figur 2b). Spraya tips förebyggande pipett för alla flytande material.
  7. Centrifugera PCR-rör / band / plattor kort för att blanda innehållet.
  8. Placera provrören / remsor / platta i termocykler och starta PCR-programmet.
  9. När programmet är klar, ta bort produkterna från termocykler och förvara vid 4 ° C tills elektrofores.

4. Gelelektrofores av PCR-produkter

* Detta protokoll har varit standard i många år och är ett valfritt steg som kan användas vid bekräftelse av PCR-produkter önskas innan du skickar dem för FLA.

  1. I en separat post-PCR arbetsplats, förbereda en 2% agarosgel. Använd 2.0g agarosen powder/100ml av 1x TBE (Tris / Borat / EDTA) buffertlösning i en kolv. Värm blandningen i ca 1,5-2 minuter i en mikrovågsugn. Snurra innehållet, värme om det behövs för att lösa upp agaros. Svalna något och häll gelen i en form med hjälp av en kam med tillräckligt brunnar för proven.
  2. Ta ut PCR-produkter från 4 ° C och centrifugera i ca 30 sekunder.
  3. Blanda 2-5μl av PCR-produkt med 0,5-1μl av 5x eller 6x gel loading buffert (buffert finns tillgängliga från olika företag, eller kan blandas in i labbet. Recept finns på nätet.)
  4. Lägg i brunnarna i gelen med 6μl prov / buffert mix. Lägg till en molekylär stege för att en bra (helst en 20 bp stege).
  5. Kör gelen vid 100 V i ungefär 90 minuter.
  6. Blötlägg gelen i ethidiumbromidlösning i 15-30 minuter, sedan i ultrarent vatten för en lika lång tid.
  7. Bild gelen medan UV-ljus används. Det bör finnas ett band för varje 4-5 DNA-segment i kombination (Figur 3).
  8. Kasta gelen i enlighet med institutionens farligt material politik. Ethidiumbromidlösning kan användas flera gånger innan korrekt avfallshantering.

5. Förbereda prover för fragment längd analys (FLA)

  1. I ett rent Eppendorf-rör, förbereda en mästare blandning som innehåller 12μl av Hi-Di formamid lösning från en färsk alikvot och 0.3μl av GeneScan -500 LIZ dimensionering standard (båda från Applied Biosystems) för varje prov som ska testas. (Hi-Di formamid denaturerar kemiskt DNA-strängar före kapillärelektrofores, vilket eliminerar behovet för uppvärmning.) Med hjälp av en 96-bra optisk kvalitet mothållsplattan, alikvot 12.3μl av formamid-Liz mix till varje brunn som används för prover och ställa plattan åt sidan.
  2. Gör en tallrik karta för din bokföring som visar vilka DNA-prov i varje brunn (Figur 4a).
  3. Använda rör / remsor eller en 96-brunnar, lägg 1μl av PCR-produkten (från del 3) till 59μl av PCR-kvalitet vatten skapar en 1:60 spädning av PCR-produkten. Spädningar kan justeras baserat på signalstyrka från FLA data eller ljusstyrka gel band. Ännu lägre koncentrationer av DNA kanvara tillräckligt (1:120 eller 1:180).
  4. Tillsätt 1μl av den utspädda PCR-produkt till rätt bra i plattan innehåller formamid-Liz blandning.
  5. Snabbhet och effektivitet kan öka betydligt om PCR gjordes även för ett 96-brunnar. Man kan helt enkelt rada upp 3 skyltarna i sekvens: Plate 1 med PCR-produkter, tavla 2 med sterilt vatten för utspädning av PCR-produkter, och tavla 3 med formamid och dimensionering stege för fragment längd analys. En flerkanalspipett möjliggör en snabb process för FLA beredning.

Provanalys via Genetiska Analyzer

  1. Kalibrera Genetic Analyzer för att upptäcka den tillämpade flurophores enligt tillverkarens instruktioner. Var noga med att använda en färg-set som inkluderar Liz.
  2. Fyll i vattnet skölja behållarna och lägga till nya löpande buffert med EDTA (1x) (Applied Biosystems) att buffra kammare.
  3. Lägg till ett spårade septum kisel på plattan och placera plattan i utformade hålla facket. Tryck på "fack"-knappen på Genetiska Analyzer för att föra autosampler framåt. Placera plattan på autosampler och stäng dörren till det Genetiska Analyzer.
  4. Skapa eller importera ett kalkylblad för analys. Importeras filer har en. Plt förlängning och är i tabbavgränsat format. Filer kan ändras i Excel (Microsoft) eller liknande program.
  5. Proverna sprutas in i kapillär (50-cm längd, POP-7 polymer) genom att tillämpa en injektion spänning på 1,6 kV för 15 s. I kapillärelektrofores körs vid en spänning på 15 kV vid 60 ° C under 1800 sekunder. Hela processen tar ungefär 45 minuter.
  6. När en körning är färdig, är de data för varje analyserat prov omvandlas till filer med en. FSA förlängning och placeras i en tallrik fil mapp (figur 4b). Varje datafil är ungefär 100 kB i storlek och kan lagras på ett flashminne eller zippade och mailade. Datafiler kan visas med lämplig programvara, såsom ABI: s GeneMapper eller Peak skanner.

6. Analys av resultat fragment längd

  1. Analys av data från fluorescerande kapillärelektrofores kräver särskild programvara. Om sådan programvara inte är tillgänglig, går det Applied Biosystems hemsida och ladda ner Peak Scanner. Programvaran är gratis och fungerar ganska bra. https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603624
  2. Öppna Peak Scanner och "Starta nytt projekt" följt av "Lägg till filer". Ladda valt. FSA datafiler till programmet, inklusive de positiva och negativa kontroller.
  3. Välj (markera) och "analysera" alla inlästa filer. Var noga med varje prov är satt till "Storlek Standard: GS500 (-250) och analysmetod:. Dimensionering Default-PP Press" Analysera ".
  4. Undersök storleken i baspar varje färgad topp produceras av DNA-fragment i proverna.
  5. Spela in varje topp storlek värde i baspar och jämför med den positiva kontrollen topp.
  6. Toppar i den positiva kontrollprover bör jämföra sig med antalet baspar och motsvarande antal tandem repeats som anges i tabellerna 4-7.
  7. Bestäm hur många korta tandem upprepa segment i varje prov-allelen i jämförelse med den positiva kontrollen. Vi använder NHDP63 som har sekvenserat för antal VNTR kopior på varje plats som undersöks. 4
  8. Skriv in de registrerade uppgifterna i ett kalkylblad för jämförande och / eller matematiska analyser. VNTR "fingeravtryck" eller haplotyper, är strängar av allelerna vid definierade loci som är karakteristiska för en M. leprae stam.

7. Representativa resultat

Gelelektrofores av PCR-produkterna kommer förhoppningsvis att ge ett band för varje locus i grundfärgen kombination (Figur 3). I figur 3 finns 2 sektioner på gelen: den övre delen har Kombination 1 PCR-prover och den nedre delen Kombination 2 prover. Varje avsnitt innehåller en 20 baspar molekylära stege, följt av PCR-produkter från 8 patientprover. Kombination 1 har också en negativ kontroll och slutligen en positiv kontroll (NHDP63 stam). (Reglagen för kombinationen 2 var på en annan gel.) Observera att de flesta prover som tydligt visar 5 band, ett för varje plats i kombinationen. I vissa fall kan banden vara för nära varandra för att visas som separata loci resulterar i uppkomsten av endast fyra band.

Förväntad amplicon storlekar finns i tabell 1. Vårt laboratorium använder NHDP63 stam av M. leprae som positiv kontroll. Två typer av återkommande segment har studerats: mikrosatelliten loci (med 1-5 bas upprepar) och minisatellite loci (med segment är större än 5 baspar upprepas flera gånger).

Tolkning av datafiler från kapillärelektrofores bygger på två standarder: en intern DNA-fragment dimensionering standard som kallas GeneScan-500LIZ (ABI) och en extern positiv kontroll urval av förstärkta bakteriellt DNA.

FLA kromatogram, visas med Peak skannerprogrammet kan ses i figurerna 5a, 5b och 6.

Peak Scanner ger uppgifter om amplicon storlek (x-axeln i baspar) och signalstyrka (y-axeln). (Figur 5b) Ytterligare uppgifter om topparean mm finns också, även om storlek och toppvärden höjd är viktigast. Peaks mindre än 100 enheter i höjd brukar anses för svag signal för att vara tillförlitliga.

Figur 6 jämförs den positiva kontrollen (NHDP63) och två patientprover, visar en variation i antalet tandem repeats på lokus (GTA) 9. I den positiva kontrollen, (GTA) sekvensen upprepas 10 gånger. Den NHDP63 VNTR och amplicon storlek var verifieras genom genen sekvensering. Patient 4: s PCR amplikon är 3 bp mindre än den positiva kontroll visar det bara 9 upprepade enheter, medan Patient 6 har en amplicon som är 3 BP större än NHDP63 avslöjande 11 ggr på (GTA). Patient 2 hade låga bakterie-index (BI) med liten eller ingen DNA-PCR-replikation, därför ingen FLA signal.

Svårigheter att FLA tolkning av data förekommer ibland som ett resultat av "stamning". Under PCR-reaktionen kan DNA-polymeras bildar brottstycken som är en eller flera upprepningar längre eller kortare än källan allel. Dessa är vanligtvis redovisas som toppar av lägre höjd kring de viktigaste topp. De kommer att vara "på stegen", dvs rätt antal baspar i upprepa segmentet större eller mindre än den huvudsakliga topp. Resultatet är en familj av toppar i samma färg. Figur 7 visar detta med lokus (TA) 10.

En annan svårighet ibland stöta på med FLA innebär '+ A' eller 'A-tailing ", där DNA-polymeras tillför en enda oädel [oftast adenin (A)] till 3" i slutet av den kopierade DNA-segment. Detta visar sig i FLA som en topp till höger om en huvud-eller stamma topp som är ett baspar större än den intilliggande toppen som visas i Figur 8. Det ska inte förväxlas med en huvud-eller stamma topp. Ett viktigt topp och dess A-svansen betraktas som en enda art. A-svansen ändrar inte antalet VNTR upprepas. (Vissa DNA-polymeras kit är speciellt utformat för att främja en-tailing i syfte att minska denna förbryllande effekt. Främjande komplett A-tailing tenderar att producera en enkel topp snarare än ett par toppar.)

Den DNA-extraktion och PCR-produkter innehåller både M. leprae och mänskligt DNA, dock med undantag av (TA) 18, primers är specifika nog att de bara förstärka bakteriellt DNA, och det finns liten eller ingen mänsklig DNA-amplifiering. (TA) 18 ger ofta en topp på 242 baspar som är från mänskligt DNA och inte ses i bältdjur passerats DNA-prover (Figur 9).

Hållbarheten för grundfärger är i allmänhet bra, förutsatt att de förvaras vid -20 ° C, bara bort för omedelbar användning, och sedan förvaras vid 4 ° C tills konsumeras. Primers måste vara stabilt vid 4 ° C i 1-2 veckor. Trots att primer kombinationer för PCR är något tidskrävande, är det rekommenderat att bara tillräckligt primer kombination för omedelbar användning vara beredd. Primer kombinationer tycks försämras något när de förvaras under längre perioder.

TE bör alikvoteras från större lager och alikvoter kan lagras antingen fryst eller vid rumstemperatur. Större portioner av 200-400μl är bra för spädning av torkad eller koncentrerad primer lager (Figur 2a). Mindre portioner av 10-50 l är användbara för att komplettera de volymer av primer kombinationer 3 och 4. TE är billig och alikvoter bör kasseras efter användning.

Multiplex enzym kit är ganska dyra och bör förvaras fryst (-20 ° C) fram till användning. Efter PCR-beredningen, all oanvänd multiplex lösningar omedelbart återlämnas till 4 ° C. Den lilla Qiagen Multiplex PCR kit levereras med 3 rör av multiplex-mix, som vardera innehåller 0.85ml (850μl) lösning, räcker för cirka 65-70 PCR.

Generellt är det bäst att undvika upprepade stora temperaturförändringar för material som används i denna typ av laborationer, inklusive DNA-prover, primers och multiplex lösningar kit. Allt material ska förvaras vid -20 ° C tills det behövs, och sedan förvaras vid 4 ° C tills konsumeras. Långtidslagring av DNA ska vara -80 ° C.

Allt material som innehåller tillbringade vävnad, grundfärger och / eller DNA skall autoklaveras och kasseras när den inte längre till någon nytta. Alla prover behandlademed etidiumbromid eller formamid ska behandlas som farligt avfall och destrueras i enlighet med institutionens farligt material politik.

Tabell 1
Tabell 1: Amplicon storlekar för stam NHDP63

Tabell 2
Tabell 2: Cykling Parametrar för VNTR PCR

Tabell 3
Tabell 3: Förberedelse av PCR

Tabell 4
Tabell 4: Allel begär Kombination 1

Tabell 5
Tabell 5: Allel begär kombination 2

Tabell 6
Tabell 6: Allel begär Kombination 3

Tabell 7
Tabell 7: Allel begär Kombination 4

Figur 1
Figur 1: VNTR-FLA processflödesdiagram

Figur 2
Figur 2. (A) Förberedelse av Kombination 1 Övre Primers (Eppendorf-rör Bildkälla www.clker.com ). (B) PCR-setup (för 8 PCR) (Eppendorf-rör Bildkälla www.clker.com)

Figur 3
Figur 3. Agarosgel kombinationer 1 och 2 VNTR PCR-produkten DNA

Figur 4a
Figur 4b
Figur 4. . (A) FLA tavla Karta (b) FLA datafiler: *. FSA

Figur 5a
Figur 5b
Figur 5. (A) FLA Kromatogram av den positiva kontrollen (NHDP63) för Kombination 1 VNTR loci. (B) Peak Scanner data för amplicon storlek och förekomst av (GTA) 9

Figur 6
Figur 6. Jämförelse av PCR-prover till PC (NHDP63) för locus (GTA) 9

Figur 7
Figur 7. Main och Peaks Stutter för (TA) 10

Figur 8
Figur 8: + A (A-svans) Peaks Intill Main eller Stutter Peaks.

Figur 9
Figur 9: (TA) 18 Huvudnamnrymden Peak, Peaks Stutter och mänskliga DNA Peak

Figur 10a
Figur 10b
Figur 10:. (A) stammen Differentiering av M. leprae baserade på VNTR data (B) stammen Differentiering av M. leprae baserat på MLVA DNA-fingeravtryck

Discussion

Insamlingen av hud prover från spetälska patienter kräver kvalificerade läkare eller tekniker som arbetar på hudkliniker. Laboratorium personer som hanterar dessa prover måste ta stor omsorg att bära rockar, handskar och skyddsglasögon och att arbeta i en bio-säkerhetsbänk vid hantering av infekterade prover från människor eller bältdjur vävnad. Desinfektion av ytor och redskap är också kritisk. Att arbeta i en ren, steril biologiskt säkra skåp är viktigt för att undvika kontaminering av DNA-prover.

DNA-extraktion har blivit relativt enkelt tack vare utvecklingen av utvinning kit från företag som Qiagen. Vägbeskrivning måste följas noggrant. Alla prover ska förvaras kallt när den inte används. Undvik upprepade, extrema temperaturväxlingar för prover.

DNA primers som används i detta arbete kan beställas från olika företag som har citerats i listan över litteraturreferenser i slutet av detta dokument. Försiktighet bör vidtas för att arbeta med grundfärg i en DNA-fri miljö för att undvika kontaminering. Grundfärger kommer som torrt pulver och måste blandas med TE och spädas till en 100μM koncentration, separeras sedan i mindre mängder (Figur 2a). Fungerande lösningar av grundfärger spädas ytterligare till 10μM koncentrationer. Återigen, inte använda DNA-prover i områden / kåpor där primers används och förberedda.

PCR-produkter bör också hållas kall när den inte används.

En 3% agarosgel förberedelser kommer att ge bättre separation DNA-bandet, men tar längre tid att köra. För rent kvalitativa ändamål är 2% vanligen tillräcklig. Ethidiumbromidlösning används för färgning av DNA i agarosgeler är en mycket aktiv genotoxin som absorberas genom huden. Hantera denna lösning och geler färgas med den med stor försiktighet och alltid vara säker på att använda handskar. Tvätta händerna noggrant efter hantering av alla DNA-prover eller Ethidium material bromid. Kasta etidiumbromid färgningslösningen och tvätta och geler enligt institutionens riktlinjer. Geler är inte rutinmässigt krävs, detta steg kan elimineras när FLA metoder har inrättats. Det är dags och reagens tidskrävande.

Den formamid lösning som används för att förbereda prover för FLA är också mycket giftigt och bör hanteras med försiktighet. Tvätta händerna efter dess användning. Kassera den följande institutionella riktlinjer.

Läsa resultat från FLA med Peak Scanner programvara kan vara en utmaning. En grundläggande uppsättning av allel samtal (antal tandem repeats) har utvecklats vid CSU (tabellerna 4-7). (Det bör noteras att tabellerna 4-7 kanske inte är heltäckande. Liksom andra stammar av M. leprae studeras, kan alleler med antalet kopior utanför de uppräknade områden hittas.) En särskild utmaning innebär "stammar" toppar. Dessa familjer av toppar, särskilt STRs som bara omfattar 2-3 upprepar baspar, såsom (TA) 10. Ibland välja rätt topp för att läsa är svårt (Figur 7). I denna figur är toppen i den positiva kontrollen vid 190 bp de största topp. Peaks lägre i höjd som är 2, 4, eller till och med 6 par bas större eller mindre än de största toppen kallas "stamma toppar." A-tailing kan också orsaka förvirring. A-tailing beskrivs tidigare i texten och i figur 8. Slutligen, om PCR-produkter förekommer rikligt i proverna, kanske toppar visas med en dubbel topp. I det här fallet, läs mitt i topp form. (Se figur 6, Patient 6.)

Datahantering kan vara en stor uppgift för denna typ av arbete. Det är viktigt att registrera all relevant information för alla experiment som: datum för en uppgift eller procedur, operatör, band / platta kartor, FLA order, PCR-förhållanden och recept, datum för geler och fotografier, temperaturer lagring, DNA-spädningar mall, FLA elektronisk fil lagringsplatser etc. Bra organisation och hantering av data kan spara dig timmar av tid åt att leta efter specifik information i framtiden.

Laborationerna beskrivs här har pågått i flera år på Colorado State University och på andra platser runt om i världen. Den stora bilden av vad alla insamlade data innebär och hur det kan vara för framtida bruk börjar växa fram. Figurerna 10A och 10B visar hur dessa DNA-fingeravtryck kan användas för att särskilja olika M. leprae stammar mellan länder (10A) eller till och mellan familjer (10B). Familjen och samhället kopplas fall har visat sig bära M. leprae av liknande eller identiska VNTR stam typer. Förhoppningen är att det kan vara möjligt att få ökad insikt i de (t) av spetälska överföring så att ett system för tidig upptäckt av överföringsnät kan utvecklas för dem MOSt vid risker och att kurativ läkemedelsbehandling kan inledas innan bestående neurologiska och dermatologiska skadan är skedd.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Finansieringen kom från NIH / NIAID bevilja RO1-AI-63.457 och Arra bevilja komplettera RO1-AI-63.457 S1. Vi erkänner bidragen från alla nuvarande och tidigare medlemmar av laboratoriet gruppen och medarbetare.

References

  1. World Health Organization. Chemotherapy of leprosy for control programmes. Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).
  2. Cole, S. T. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature. 409, 1007-1011 (2001).
  3. Leproma Web Server. Leproma Web Server [Internet]. Available from: http://genolist.pasteur.fr/Leproma/ (2004).
  4. Groathouse, N. A. Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae. J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).
  5. Young, S. K. Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India. Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).
  6. Monot, M. Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae. J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).
  7. Kimura, M. Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens. J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).
  8. Weng, X. iaoman Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study. J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).
  9. Weng, X. Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation. Infection, Genetics and Evolution. (2010).
  10. Sakamuri, R. M. Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines. J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).
  11. Fontes, A. N. B. Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients. Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).
DNA-fingeravtryck av<em> Mycobacterium leprae</em> Stammar genom olika Upprepa Antal Tandem (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Jensen, R. W., Rivest, J., Li, W., Vissa, V. DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA). J. Vis. Exp. (53), e3104, doi:10.3791/3104 (2011).More

Jensen, R. W., Rivest, J., Li, W., Vissa, V. DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA). J. Vis. Exp. (53), e3104, doi:10.3791/3104 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter