Summary
본 논문은 제한된 억제 뉴런의 인구에 GFP를 표현 형질 전환 생쥐에서 전체 셀 녹음과 photostimulation를 검색 레이저를 결합 방법을 소개합니다. 이 기술은 특정 억제 대뇌 피질의 뉴런의 지역 신경 회로의 광범위한 매핑 및 정량 분석 할 수 있습니다.
Abstract
억제 뉴런은 대뇌 피질의 기능에 중요한 수 있습니다. 그들은 전체 대뇌 피질의 neuronal 인구의 약 20 %를 구성하고 자세한 1-4의 immunochemical, 형태학, 그리고 생리 학적 특성에 따라 다양한 하위 유형으로 세분화 할 수 있습니다. 이전 연구 억제 뉴런의 개별 유형의 고유 특성에 대해 많은 발표했지만, 지역 회로 연결에 대한 지식은 아직 3,5,6 상대적으로 제한됩니다. 각 신경 세포의 기능이 대뇌 피질의 회로 내에서의 흥분성의 억제 신경과 입력에 의해 형성되는 감안할 때, 우리는 특정 억제 세포 유형에 대한지도 지역 회로 연결에 레이저 스캐닝 photostimulation (LSPS)를 사용하고 있습니다. 기존의 전기 자극 또는 glutamate 뒤를 자극에 비해 LSPS 개별적으로 기록 뉴런 3,7-9에 광범위한 매핑 및 지방 기능 입력의 정량 분석을 허용하는 독특한 장점이 있습니다. 레이저 사진glutamate의 uncaging을 통해 자극을 선택적으로 통과 또는 하위 박판 매핑 해상도를 보장 말초 수석의 axons을 활성화하지 않고 perisomatically 뉴런을 활성화한다. 넓은 지역 이상 많은 자극을 사이트에서 매핑 입력을위한 LSPS의 감도와 효율성은 잘 대뇌 피질의 회로 분석에 적합합니다.
여기 전체 세포 패치가 현지 억제 회로 매핑에 대한 클램핑과 함께 LSPS의 기술을 소개합니다. 특정 억제 세포 유형의 대상으로 녹음 대상 세포 유형의 일관성 샘플링 및 기록 된 세포 유형의 모호 식별 할 수 피질 3,10에 제한 억제 뉴런의 인구에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 유전자 변형 마우스의 사용에 의해 촉진 아르 . LSPS 매핑에 관해서는, 우리는 시스템 장비를 설명 실험 절차 및 데이터 수집을 설명하고, 마우스 기본 somatose의 회로 매핑 현재의 예nsory 피질. 저희 실험에서 도시, 갇힌 glutamate는 UV 레이저 광분해에 의해 뇌 슬라이스의 spatially 제한된 지역에서 활성화되어, 동시 전압 클램프 녹음 photostimulation-evoked 신경 반응을 검출 할 수 있습니다. 대상 신경 세포에 흥분성의 또는 억제하거나 신경 입력의지도는 잠재적 인 presynaptic 사이트의 수백을 촉진하기 위해 레이저 빔을 검색하여 생성됩니다. 따라서, LSPS 반복 실험을 통해 억제 뉴런의 특정 유형에 impinging 신경 입력의 상세지도를 건설 할 수 있습니다. 함께 촬영, photostimulation 기반 기술은 neuroscientists에게 지역의 대뇌 피질 회로의 기능 조직을 결정하기위한 강력한 도구를 제공합니다.
Protocol
1. 뇌 슬라이스 준비
- 유전자 변형 마우스는 pentobarbital 나트륨 (> 100 밀리그램 / kg, IP)와 깊이 anesthetized 빠르게 목이 베 있으며, 자신의 뇌는 냉동과 산소를 절단 솔루션으로 추출.
- GFP 고글은 마우스의 뇌가 실제로 GFP를 표현하는 경우 시각적으로 상영하는 데 사용됩니다.
- 두께 400 μm의 기본 somatosensory 피질 부분은 자당 함유 인공 뇌척수 (ACSF)에 vibratome로 절단됩니다. 조각 먼저 32 ° C에서 30 분 ~ 1 H에 대한 자당 함유 ACSF에 incubated하고, 초기 잠복기 후, 실온에서 녹화 ACSF으로 전송됩니다. 부화 및 녹화를 통해 슬라이스가 지속적으로 95% O이 -5 % CO 2와 함께 부풀어 오른 있습니다.
2. 장비 시작
전체 시스템 구현은 그림 1에 도시된다.
- 레이저 냉각 시스템 및 전원 공급 turne입니다d는에 레이저가 준비.
- photostimulation 제어 (스캔 미러 시스템, 광 변조기, 전자 셔터와 포토 다이오드 입력 앰프 포함)와 관련된 모든 하드웨어 설정되어 있습니다.
- electrophysiological 장비 (Multiclamp 700B 앰프 및 마이크로 포함) 설정되어 있습니다. Electrophysiological 녹음 photostimulation, 그리고 슬라이스 준비의 이미지는 현미경의 동력 무대에 장착 슬라이스 재관류 챔버에서 수행된다.
- 영상 카메라 (Retiga 2000, Q-이미징, 오스틴, TX)가 설정되어 있습니다. 조각 적외선 차등 간섭 대비 (DIC) 및 이미징 시스템을 통해 어려운 형광 광학와 수직 현미경 (BW51X, 올림푸스)과 시각화 수 있습니다.
- MATLAB 기반 EPHUS 소프트웨어 및 Q-캡처 카메라 소프트웨어는 최대 시작됩니다. Ephus 소프트웨어의 사용자 정의 - 수정 버전 (Ephus에서 제공 https://openwiki.janelia.org/ </ a>는) photostimulation 프로토콜을 제어하고 photostimulation 데이터를 수집하는 데 사용됩니다.
- 시스템이 켜져 후, 하나는 레이저 photostimulation 시스템이 작업 상태에 있는지 확인해야합니다. 4 배 현미경 대물은 glutamate uncaging의 UV 깜박를 전달하는 데 사용됩니다 바와 같이, 흰 종이는 시스템이 실행되는 동안 레이저 스캐닝 패턴을 관찰 할 아래 넣어 할 수 있습니다.
3. 슬라이스 재관류 설정
- 가압 재관류 시스템은 슬라이스 챔버에 기록 ACSF을 먹여 설정되어 있습니다. 케어는 챔버의 단면 위 2.0 mm의 일정한 유체 수준을 보장하기 위해 이루어집니다.
- MNI-갇힌-glutamate의 주식 솔루션의 나누어지는이 0.2 MM 갇힌 glutamate의 농도에 대한 ACSF를 순환의 25 ML에 추가됩니다. 실험 5-6 H 후 목욕 솔루션과 MNI-glutamate가 새로 고침됩니다.
- 뇌 슬라이스가 기록 챔버로 이동합니다. 하나는 영상을 실행할 수 있습니다ystem는 슬라이스의 품질을 확인하고 해부학 적 기본 somatosensory 지역을 찾을 수 있습니다. 그런 다음 슬라이스는 주문 제작 현 플래티넘 링과 정박 해 있습니다. 녹음하기위한 뇌 영역 위에 닻을 넣어하지 않도록주의하십시오.
4. 전체 세포 패치 - 클램프 녹음
- 유리 전극은 (4-6 MΩ 저항) 셀 라벨 및 형태학의 식별 0.1 % biocytin을 포함하는 내부 솔루션으로 끌어 가득합니다.
- 패치 녹화를 수행하려면 셀 60x 목적의 시각화 수 있습니다. 억제 세포 유형 먼저 확인하고 형광등 / DIC 올림푸스 현미경 아래에서 GFP의 표현의 시각화에 따라 선택되며, 녹음 이후 적외선 DIC 비디오 감시하여 왔으며 시각적 인 통제하에 수행됩니다. DIC 및 형광등 모드 사이를 전환 몇 번이 대상 셀에 전극을 접근하는 동안 GFP 세포의 위치를 확인 할 필요가 있습니다.
- 에 침입하면, DIC 및 형광등 모드에 따라 60x의 셀의 이미지가 온라인 확인을 위해 이동합니다. photostimulation 데이터의 수집하기 전에, hyperpolarizing 및 전류 펄스를 depolarizing는 각 셀의 기본 electrophysiological 속성을 검토 주입합니다.
- 일단 안정적으로 전체 셀 녹음이 편리 저항 (보통 MΩ <20)로 달성된다, 현미경 대물은 60x에서 레이저 스캔 photostimulation에 대한 배속으로 전환합니다. 4 배의 슬라이스 이미지가 획득되어 photostimulation 사이트를지도하고 등록을 위해 사용됩니다.
5. 레이저 SCAphotostimulation을 nning
- photostimulation 및 데이터 수집 매개 변수가 Ephus의 구성 스위치 모듈을 활성화하여 설정합니다. 일반적으로, 1 초 자극 간격 1 밀리 초 레이저 (20 MW)이 photostimulation 매핑에 사용됩니다. 10 kHz에서에서 맛보실 일초의 데이터 흔적을 찾았습니다.
- 4 배 슬라이스 이미지가 Ephus의 매퍼 모듈에로드됩니다. 셀 소마의 위치를 정의하고 있으며, 16x16 규격의 패턴 (80 μm X 80 μm 간격)의 photostimulation 사이트는 모두 대뇌 피질의 레이어를 덮고, 셀 위치 주변에 설정되어 있습니다.
- 기록 뉴런의 여기 프로필은 현재 클램프 모드에서 photostimulation에 대한 응답으로 솟고 위치를 검토하여 매핑됩니다. 온라인 디스플레이 기능과의 사용자 친화적 인 소프트웨어가 매핑 실험을 용이하게한다.
- 레이저가 다른에서 스캔하는 동안 지역 흥분성의 회로 연결 기록 세포에서 흥분성의 postsynaptic 전류 (EPSC)의 감지로 매핑됩니다위치. 세포는 안쪽 흥분성의 전류를 감지하는 전압 클램프 모드에서 -70 뮤직 비디오에서 개최됩니다. EPSC지도 photostimulation 패턴 회전을 2-3 번을 반복하거나 뒤집혀 있습니다.
- 선택 사항 : 지역 억제 회로 연결도 외측 억제 전류를 감지 전압 클램프 모드에서 가까운 0 뮤직 비디오에서 개최 기록 된 세포에서 억제 postsynaptic 전류 (IPSC)의 감지로 매핑 할 수 있습니다. IPSC 매핑에 대한 세슘로 대체 칼륨과 전극 내부 솔루션을 사용하는 것이 가장 좋습니다 것입니다합니다.
- 모든 생리적 assays가 완료 후, 전극은 부드럽게 녹화 셀에서 제거됩니다. 뇌 슬라이스는 밤새 4 % paraformaldehyde에서 촬영하고 고정됩니다. 기록 세포는 biocytin에 대해 얼룩이 있습니다. 셀 형태는 각 기록 세포가 실제로 원래 목표 GFP-표현 interneuron되었음을 확인하는 공 촛점 또는 에피 형광 현미경과 검토하고 있습니다.
6. Photostimulat이온 데이터 분석
우리의 새로 개발 된 방법론 및 소프트웨어 구현 11 원시 데이터지도에서 photostimulation-evoked 신경 이벤트의 검출 및 측정에 적용됩니다. 그림 2에 예시, 색으로 구분지도는 기록 뉴런에 신경 입력의 패턴을 설명하기 구성되어 있습니다.
7. 대표 결과 :
electrophysiological 녹음 및 photostimulation 매핑의 예 결과는 그림 2에 표시됩니다. 특정 억제 세포 유형의 대상으로 녹음 알려진 억제 세포 유형에 GFP를 표현 형질 전환 생쥐를 사용하여 가능하게됩니다. 억제 interneurons의 다양성을 감안할 때, GFP의 표현, 고유 전기 생리학 및 형태학의 특성 (그림 2A)의 분석은 최종 세포 유형 분류에 도착하는 결합됩니다. 그림 2B-C는 레이저 스캔 photostimulation 지역 cortic의 다양한 매핑을 허용하는 설명단일 억제 뉴런에 알 회로 연결. 원시 데이터 맵은 그림 2C에 표시됩니다. 직접 uncaging 응답은 데이터 분석 (그림 2C)에서 제외됩니다. 양적 입력지도, 색 그림 2D-F에 표시됩니다. 예를 들어 빠른 속도로 튀어 오르고 억제 interneurons는 레이어 4 깊은 층에서 강한 흥분성의 시냅스 입력 (EPSCs)를 받았습니다. 정의 대뇌 피질의 경로에있는 세포의 시냅스 입력 단체와 관련된함으로써, 우리는 대뇌 피질의 정보 처리에의 가능한 역할 (예를 들면, 피드백과 피드 포워드 억제) 추론 할 수 있습니다.
1 그림. 레이저 스캔 photostimulation 일반 시스템 장비. 우리의 전체 시스템은 photostimulation 제어, 비디오 이미징 및 electrophysiological 레코딩 시스템으로 구성되어 있습니다. 우리는 LSPS 시스템의 설계는 이전에 7,17 설명 하였다. 레이저 단위는 355 nm의 UV 라스를 생성하는 데 사용됩니다glutamate의 uncaging에 대한 어. 레이저 빔은 시스템의 광학 경로를 통해 전달됩니다. 레이저 플래시 (예를 들어, 1-3 밀리 초)의 짧은 기간은 전기 광학 변조기 (즉, pockels 셀) 및 기계적 셔터를 사용하여 제어됩니다. 레이저 빔 에너지는 중립적 인 밀도 기울기 휠의 조절과 광 다이오드에 유리 coverslip으로 레이저 빔의 작은 부분을 우회에 의해 모니터링된다. 레이저 스캐닝 시스템은 검사 거울, 스캔 렌즈, 튜브 렌즈와 목적 렌즈의 XY 쌍을 포함합니다. 거울은 스캔 렌즈를 통해 레이저 빔을 제공 한 후 빔은 이색 성 거울을 통해 현미경을 입력하고 주문 제작 UV-전송 튜브 렌즈에 의해 초점을 맞추고 있습니다. 빔보다 원주를 축 해상도를 줄여 가능한 2 차원으로 매핑을 유지, 조명 빔 (같은 원추형이 아닌)를 제공 할 수있는 현미경 대물의 뒷면 조리개를 underfills. 4 배 목표 아래, 레이저 빔 uncaging 명소, 각 approximati을 형성NG 초점 평면 (삽입 참조)에서 옆으로 153 μm의 폭 가우스 프로필. 거울과 목표의 뒷면 개구는 목적 렌즈 초점 평면에서 다른 스캔 위치에 미러 위치를 번역, 공액 비행기에 다양한 레이저 자극 위치는 galvanometers 기반 XY 검사 거울을 통해 달성 될 수있다. uncaging 동안, 전체 필드를 포함 패턴 사이트의 변수 번호는 최근에 자극 사이트의 주변을 다시 방문하지 않도록하는 nonraster, nonrandom 순서에 순차적으로 자극되어 있습니다. 더 자세한 정보는 슈 외. (2010)를 참조하십시오.
그림 2. 마우스 기본 감각 피질의 레이어 4 GFP-표현할 빠른 속도로 튀어 오르고 interneuron에 지역 흥분성의 회로 연결을 매핑. A1과 A2는 60x에서 대상 셀의 DIC와 GFP 형광 이미지를 표시생활 뇌 슬라이스의 목적, A3는 후 녹음, 고정 슬라이스의 biocytin의 착색에 의해 밝혀 세포 형태를 보여줍니다 동안. A4 서로 다른 강점 intrasomatic 현재 주사에 대한 응답으로 빠른 속도로 튀어 오르고 억제 interneuron의 특징 기록 된 GFP 세포,의 발사 패턴을 보여줍니다. B 16 배속 photostimulation 사이트 (*)로 겹쳐 슬라이스 이미지를 보여줍니다. 셀 위치는 작은 빨간색 원으로 표시됩니다. C는 셀이 안쪽으로 흥분성의 전류를 감지 할 -70 뮤직 비디오에서 개최되었을 때, B에 표시되는 자극의 위치에서 photostimulation-evoked 응답 흔적의 배열을 보여줍니다. photostimulation 응답의 다양한 형태의 확장과 별도로 삽입에 표시된 1과 2의 위치에서 흔적에 설명되어 있습니다. 추적 1 전지 본체와 promximal 수석에 uncaging glutamate 할 수있는 직접 응답의 예 (빨간색 화살촉으로 표시)입니다. 2 다른 흔적은 흥분성의 시냅스에서의 전형적인 예입니다응답 (파란색)를 넣어. 직접 응답과 시냅스 입력을들은 진폭 및 응답 대기 시간으로 구분 될 수 있습니다. D, E와 F는 원시 데이터가 각에서 평균 입력 진폭 C.에 표시되는지도 각각 평균 EPSC 진폭의 색으로 구분지도 (16x16 규격의 사이트), EPSC 번호, 사이트 당 처음 발견 EPSC 지연입니다 자극 사이트는 동일한 사이트의 photostimulation 응답에서 차감 기준 자발적인 반응과 함께 분석 창에서 EPSCs의 평균 진폭입니다. EPSCs과 도착 시간 또는 사이트 당 처음 발견 EPSC의 지연의 수는 측정 해본 있습니다. 자세한 내용은 (시 외., 2010)를 참조하십시오.
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Discussion
Photostimulation 기반의 매핑 기법을 효과적으로 대뇌 피질의 회로를 분석하는 적용되었습니다. 많은 다른 장소에서 presynaptic 뉴런의 클러스터 photostimulation과 postsynaptic 신경 세포의 동시 녹음이 흥분성의의 공간적 분포의 정량적 측정을 제공하기 때문에 전체 셀 녹음과 함께 레이저 스캐닝 photostimulation는 하나의 뉴런에 presynaptic 입력 소스의 판상 분포의 고해상도 매핑 할 수 있습니다 또는 억제 입력. 알려진 억제 세포 유형에 GFP를 표현 형질 전환 생쥐를 사용하여 왔으며이 기술은 크게 지역의 억제 대뇌 피질의 네트워크를 elucidating으로 현재 작업을 촉진하고 있습니다. 예를 들어 연구에서는, 우리는 spatially 레이저 uncaging에 방법을 제한 할의 뉴런을 활성화 갇힌 glutamate를 사용했습니다. 그것은 glutamate의 uncaging이 channelrhodopsin 또는 다른 유전자 코드 감광성 molecu을 통해 photoactivation로 대체 할 수 있다는 것을 알아야한다특정 세포 유형 12,13의 레. 따라서 photostimulation 기술은 특정 대뇌 피질의 지역뿐만 아니라 자신의 참여 회로 14-16에서 뉴런의 특정 하위 집합뿐만 아니라 타겟팅 할 수 있습니다. 또한, 우리는 최근에 전압에 민감한에 의해 달성 될 수 evoked 네트워크 활동의 신속하고 높은 시간적 해상도 평가에 레이저 스캐닝 photostimulation에 의해 달성 될 수 활성화의 공간 정밀도를 통합 새로운 photostimulation 기반의 매핑 기법 9 개발 염료 이미지. 개별적으로 기록 뉴런에 로컬 회로 입력을 매핑 photostimulation있는 전체 셀 녹음의 조합과는 달리,이 혁신은 neuronal 인구 수준에서 대뇌 피질의 회로 출력과 기능 연결을 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원을 위해 트란 Huynh, 앤드류 산 안토니오 (San Antonio), 제리 린 감사합니다. 이 작품은 건강 보조금 DA023700 국립 연구소에 의해 기금 XX에 DA023700-04S1되었습니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| transgenic mouse lines | Jackson lab or other sources | Please refer to Xu and Callaway (2009) | |
| GFP goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| vibratome | Leica Systems | VT1200S | |
| MNI caged glutamate (4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged l-glutamate) | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | Cat No. 1490 | |
| biocytin | B4261 | ||
| electrode puller | Sutter Instrument, Novato, CA | P-97 | |
| glass tubes for making electrodes | BF150-86-10 | ||
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Multiclamp 700B | |
| digital CCD camera | Q-imaging, Austin, TX | Retiga 2000 | |
| Research microscope | Olympus, Tokyo, Japan | BW51X | |
| UV laser unit | DPSS Lasers, Santa Clara, CA | model 3501 | |
| Other equipment for Laser scanning phostimulation | Please refer to Xu et al. (2010) | ||
Solutions: |
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References
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