Summary
Дендритные разветвление сенсорных нейронах
Abstract
Нервная система развития требует правильной спецификации нейронов позиции и идентичность, а затем точным нейрона класса специфическое развитие дендритных и аксонального проводки. Недавно дендритных разветвление (DA) сенсорных нейронов дрозофилы личиночной периферической нервной системы (ПНС) стали мощным генетических моделей, в которых выяснить как общие, так и класс-специфические механизмы дифференциации нейронов. Существуют четыре основных Д. А. нейрона классов (I-IV) 1. Они названы в порядке возрастания сложности дендритные беседка, и классовые различия в генетическом контроле их дифференциация 2-10. Д. А. сенсорные системы практическую модель для исследования молекулярных механизмов контроля за морфологию дендритных 11-13, потому что: 1) он может воспользоваться мощным генетических инструментов, доступных в плодовой мушки, 2) Д. А. нейрона дендритов беседка распространяется только в 2 размерах под оптически CLEар личиночной кутикулы что позволяет с легкостью визуализировать с высоким разрешением в естественных условиях, 3) класса видового разнообразия в дендритные морфологии облегчает сравнительный анализ, чтобы найти ключевые элементы управления образования простых по сравнению с сильно разветвленными дендритных деревьев, и 4) дендритных беседки стереотипных формы различных нейронов Д. облегчить морфометрических статистического анализа.
Д. А. нейронной активности изменяет вывод личиночной передвижения центральный генератор шаблона 14-16. Различных DA нейронов классов имеют различные сенсорные модальности, и их активация вызывает различные поведенческие реакции 14,16-20. Кроме различных классов отправить аксонального прогнозы стереотипно в дрозофилы личиночной центральной нервной системы в брюшной нервной цепочки (VNC) 21. Эти прогнозы прекратить с топографической представления как DA нейронов сенсорной модальности и положение в теле стены дендритных поле 7,22, 23. Следовательно, изучение Д. А. аксонального прогнозы могут быть использованы для выяснения механизмов, лежащих топографических карт 7,22,23, а также подключение простую схему модуляции передвижения личиночной 14-17.
Мы приведем здесь практическое руководство для получения и анализа генетической мозаики 24 Маркировка DA нейронов через MARCM (Мозаика Анализ с репрессируемый Маркер Cell) 1,10,25 и FLP-22,26,27 из методов (представлены на рис. 1).
Protocol
1.Preparation реагентов
- Подготовка Ca + +-бесплатный HL3.1 солевой 28.
- В мм: 70 NaCl, 5 KCl, 20 2 MgCl, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 сахарозы и 5 трегалозу; рН 7,2. Фильтры стерилизовать и хранить при температуре 4 ° C.
Примечание: Ca + +-бесплатное решение предотвращает сокращение мышц во время вскрытия.
- В мм: 70 NaCl, 5 KCl, 20 2 MgCl, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 сахарозы и 5 трегалозу; рН 7,2. Фильтры стерилизовать и хранить при температуре 4 ° C.
- Сделать поли-L-лизин (PLL) покровные.
- Растворите 100 мг PLL в 4.2ml воды и сделать 300 мкл аликвоты в пробирки Эппендорф и заморозить при температуре -20 ° C.
- Перед покрытием покровные, в первую оттепель аликвоту, довести его до 10 мл в DDH 2 O и добавить 20 мкл Kodak Photo-Flo, окончательный PLL концентрация составляет 0,7 мг / мл.
- Погрузитесь покровные для 30 минут в PLL решение, удалять и сухой, затем смойте водой кратко и сухо. Повторите дважды. Обработанные покровные длится около одного месяца.
2. Генетические кресты
- То генерировать MARCM клонов. Вот пример перекрестного использования пан-DA водитель 11,27:
FRT2A х hsFLP; Gal4 109 (2) 80, UAS-mCD8:: GFP, ванной-Gal80 FRT2A/SM5-TM6B - Для создания FLP-из клонов. Вот пример перекрестного использования класса IV-специальный драйвер 8:
ППК-Gal4 х уш, hsFLP; UAS-FRT-CD2, у +-стоп-FRT-mCD8:: GFP
3. Коллекция эмбрионов
- Держите дрозофилы крестов в коллекции бутылки при 25 ° С и собирать эмбрионы на агар яблочный сок пластины 29 распространяются с тонким слоем дрожжевой пасты 30,31.
4. Тепло шоковой терапии эмбрионов
- Место пустую тарелку в оппозиции к агар яблочный сок пластины, на которых эмбрионы были заложены. Уплотнение вокруг этих двух пластин с парафильмом (рис. 2).
- Во время теплового шока, погрузиться йэлектронной пластины в водяной бане и удерживайте ее использованием металла весом.
- Для MARCM эмбрионов
- Сбор эмбрионов для 2h и инкубировать в чашке Петри 10 см окружении смоченной ткани при температуре 25 ° С в течение дополнительных 2 часа.
Примечание: Настройка протокола теплового шока изменяет частоту, на которой клоны создаются. - Для меньшего количества клонов, стремясь к одной изолированной нейронов, погрузить и теплового шока в водяной бане в течение 1 часа при 38 ° C.
- Для большего количества клонов, теплового шока на 45 минут при 38 ° С, восстановление при комнатной температуре 30 мин, затем теплового шока снова для дополнительных 30 минут.
- Сбор эмбрионов для 2h и инкубировать в чашке Петри 10 см окружении смоченной ткани при температуре 25 ° С в течение дополнительных 2 часа.
- Сбор FLP-из эмбрионов в течение 24 часов, а также теплового шока в течение 1 ч при 38 ° C.
5. Скрининг клонов
- После теплового шока, снять крышку из водонепроницаемых расположение и место агар яблочный сок пластины в чашке Петри 10 см окружении смоченной ткани. Культура эмбриона и последующего личинки при 25 ° С до блуждатьING 3-го возраста.
Примечание: условия культивирования, особенно питание, как было показано, изменить морфологию дендритных Д. А. беседки 32,33. Убедитесь в том, что рост личинки имеют доступ к дрожжевой пасты в любое время контролировать и пополнять дрожжевой пастой по мере необходимости. - С этого момента в протоколе года, манипулировать личинки насекомых мягко использованием щипцов.
- Коротко и осторожно промыть личинки в водопроводной воде, а затем поместить на агар пластины.
Примечание: Этот шаг сокращает фоновые авто-флуоресценции от пищи или грязь на личиночной поверхности. - Изучите личинки под мощным микроскопом флуоресценции рассекает. Определить личинок с GFP-положительных нейронов / клеток в стенке тела.
6. В естественных изображений дендритов
- Место личинки во стекло депрессии с небольшую каплю 80% глицерина. Место покровное на слайде для иммобилизации личинки. Убедитесь, что воздух не остается между личинкой и coversliстр.
- Аккуратно надавите на покровное свернуть личинку, чтобы визуализация нейрона интересов. Изображение mCD8:: GFP-меченых дендритных беседки с помощью конфокальной микроскопии.
7. Личинки вскрытия
Обратите внимание, перед началом: Д. А. нейрона дендритами быстро разлагаться после начала вскрытия. Рассеките каждой отдельной личинки менее чем за 5 мин для обеспечения хорошей морфологией дендритов.
- Рассеките блуждающих 3-го возраста личинки на тарелку Sylgard, как описано выше 34 со следующими изменениями:
- Для визуализации Д. А. нейрона аксон концов, убедитесь, что ЦНС не поврежден и сегментарных нервов не нарушены. После открытия личинки, прежде всего, тщательно вырезать трахеи подключения к стенке тела, а затем аккуратно удалить весь кишечник.
- Если изображения дендритов один, удалить ЦНС, чтобы льстить монтажа.
8. Fixatионных и блокирование личинок филе
- С личинки все еще прикреплены к пластине Sylgard, зафиксировать его в 4% PFA в ФБР за 20 минут при комнатной температуре на мягко вращающийся шейкере.
- Удаление следов личиночных тканей (жир, трахеи и т.д.) после фиксации.
- Стирать в PBST (PBS с 0,1% Тритон Х-100) 3x 10 минут на Sylgard пластины и шейкер. Если изучение аксон концов, держать филе на тарелку Sylgard. (Если окрашивание дендритов можно перевести личиночной филе с 0,5 мл трубки на этот шаг 34)
- Блок личинок на 20 минут при комнатной температуре в 5% нормальной сыворотки осла (NDS) в PBST на шейкере.
9. Окрашивание личинок филе
- Удалите блокирующий раствор и инкубировать в первичных антител (в 5% НСР / PBST) в течение ночи при температуре 4 ° С в небольшой контейнер Tupperware окружении смоченной ткани.
- Снимите трубки от 4 ° С и выдержать дополнительный час при комнатной температуре.
- Вымойте 6x 10 минут в PBST. Добавить вторичных Антибоды (в 5% НСР / PBST), и крышка, чтобы предотвратить флуорофора фото-отбеливание 34.
- Инкубируйте либо при комнатной температуре в течение двух часов или на ночь при 4 ° C следует один час при комнатной температуре.
- Вымойте личинки 6x 10 минут в PBST и приступить к установке.
10. Монтаж личиночной филе для исследования дендритных беседки
- Горы каждой личиночной филе плоской, как можно с помощью ножниц или рассекает скальпелем, чтобы отрубить голову (в том числе рта крючки) и задний (в том числе дыхальца) 34.
- Место личиночной филе на слайде кутикулы стороной вниз, смонтировать в 80% глицерина, и печатью сторон покровным лаком для ногтей для 'быстрый' горе 34.
- Для постоянного монтажа и четкое изображение
- Место расчлененный личиночной филе мышц стороной вниз на каплю PBS на покровное PLL, он будет быстро присоединиться к покровным.
- Удалить столько жидкости, как можно раньше после монтажа, howeveт, не позволяют ему полностью высохнуть.
- Возьмите покровное (с прикрепленными личиночной филе) с помощью этанола серии: 35% этанола, а затем на 50%, 70%, 95%, и, наконец, 2x 100% этанола каждый в течение 10 минут (2-я 100% этанола решение следует часто менять ) и, наконец, мыть 2-3x 10 минут в ксилоле.
- Поместите каплю DPX mountant (Distyrene Пластификатор ксилола) на чистую слайдов и аккуратно лежали покровное филе стороны-вниз на вершине. Хранить в темноте, и подождать один день для DPX поставить перед изображениями.
11. Монтаж личиночной филе на экспертизу аксона концах
- Держите сегментарные нервы работает между ПНС и ЦНС не повредить во время вскрытия, фиксации и окрашивания, чтобы отслеживание аксоны от периферических сенсорных теле клетки нейрона к VNC.
- Горы каждой личиночной филе кутикулы стороной вниз в 80% глицерина в депрессию слайда. Трассировка аксонов от тела клетки к Д. А.VNC под конфокальной микроскопии. Примечание: ПНС нейронов в каждом сегменте проекта стенкой тела, чтобы родственные сегменте VNC.
12. Представитель Результаты:
Представитель Результаты приведены на рисунках 3-5. Рис. 3 показан весь вал класса IV-да-нейрона, захваченных в естественных условиях под конфокальной микроскопии. Рис. 4 показаны крупным планом часть дендритов беседке иммуногистохимическое помечены класса III нейрон, который был правильно закреплен сохранить морфологию. Связанные вставке деградации, которые могут возникнуть после неудачного вскрытия и фиксации (как окрашивали анти-GFP антител). Рис. 5 показан один класс IV аксон вокзал ЦНС (анти-GFP, зеленый), и все концы класса IV являются со-окрашенных анти-CD2 (пурпурный).
Рисунок 1 Протокол обзор. а) собирать и затем теплового шока эмбрионов. б) Выберите личинки с GFP-положительных Д. А. нейрона клон, а затем изображение GFP-меченых дендритов беседка в живых личинок. в) Рассеките личинки, а затем иммуногистохимическое пятно филе. г) Смонтировать окрашенных филе, а затем изображение дендритных беседки и аксонального проекции Д. А. нейрона клонов.
Рисунок 2 Подготовка агара яблочный сок пластина для теплового шока. Возьмите пластину (белая стрелка, аЬ), добавьте вторую чашку Петри на вершине (красная стрелка б) и уплотнения вокруг с парафильмом (синяя стрелка, б).
На рисунке 3 в естественных образ дендритов беседке mCD8:: GFP-меченых MARCM клон (генотип, как в 2.1), представляющий класс IV (v'ada) нейрон 3-го возраста личинки. Шкала бар 50 мкм.
d/3111/3111fig4.jpg "/>
Рисунок 4 mCD8:: GFP-меченых MARCM клон класса III нейрона (ddaA) окрашивали анти-GFP антител, показывая хорошую морфологии после успешного вскрытия и фиксации (зеленый). Вставке показана дендритов деградации (белые стрелки), возникающие после неудачного вскрытия и фиксации (пурпурный). Шкала бар 25 мкм.
Рисунок 5 3-го возраста личиночной VNC. ФЛП-клон из одного класса VI (vdaB) Аксон вокзал (генотип, как в 2.2) определяется с помощью анти-антител GFP (зеленый). Анти-CD2 этикетки всех концах класса IV (пурпурный). Шкала бар 25 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Дрозофилы личиночной Д. А. нейрона модель обеспечивает один прекрасный генетическая система для исследования механизмов, которые управляют морфологии нейронов и схемы формирования. MARCM обычно используется для маркировки и для создания мутанта Д. А. нейрона клонов. Для MARCM мы используем либо пан-нейронных (например Gal4 C155) или DA нейронов конкретным водителем. Использование пан-нейронных драйвера можно напрямую использовать несколько акций широко доступны из центров общественной акции. Однако при использовании DA-нейронов специальный драйвер может быть выгодно, поскольку отмеченные клонов не будет сформирована в центральной нервной системе, и такие клоны могут усложнить анализ Д. А. аксонального концах. Список наиболее часто используемых DA-Gal4 конкретной линии могут найти в Шимоно и др. (2009) 27. ФЛП-аут может быть особенно полезна, когда следователи хотят одновременно эктопически выразить ген использованием Gal4-UAS двоичной системе 35 и мера морфологии в одну меченых нейронов. Кроме того изображенийпротоколы, представленные здесь можно использовать, когда Д. А. нейронов помечаются Gal4-UAS системы 35 в одиночку.
Если хороший микроскоп флуоресцентный рассекает недоступно, можно выбрать личинки проведения клонов использования на обычной флуоресцентной микроскопии и объективом с большим рабочим расстоянием. Во время прямого визуализации дендритов беседка (раздел 6), иммобилизации личинки исключительно за счет вниз сила, покровное. В адаптации этого протокола для других исследователей использует также может парализовать личинок через анестезии 36,37.
Во время immunohistological окрашивания, мы обычно используем анти-GFP или анти-CD8 для маркировки нейрона. В FLP-эксперименты по борьбе с CD2 может дополнительно отметить все нейроны, в которых Gal4 линии используется драйвер активных (рис. 5). При рассмотрении Д. А. Аксон терминалов в VNC, анти-Fasciclin2 антител маркировка может быть, чтобы использовать для выделения участков аксона ориентир 7,22,38.
32. Кроме того, Д. А. нейрона дендритов, особенно класса III и IV класса, будет быстро разлагаться после начала вскрытия. Мы предлагаем рассекает и фиксации личинки в индивидуальном порядке. Фиксация должна произойти в течение 5 мин от начала вскрытия для обеспечения хорошего обслуживания дендритной морфологии. Наконец, монтаж личинками плоской, как возможно будет в значительной степени помощи последующих морфометрического анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность RIKEN для финансирования. Мы также благодарим Cagri Yalgin, Кэролайн Delandre, и Джей Пэрриш для обсуждения вопроса о генетических и иммуногистохимических протоколов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZX16 fluorescence dissection microscope (with GFPHQ filter) | Olympus Corporation | SZX16 | |
| Live Insect Forceps | Fine Science Tools | 26030-10 | |
| 26mm x 76mm depression slide glass | Toshinriko Co. | T8-R004 | |
| Sylgard 184 (or Silpot 184) | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1524 | This product has proven most effective |
| DPX mounting medium | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Rabbit anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-CD8 | Caltag | 5H10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-CD2 | AbD Serotec | MCA443R | Dilution 1:700 |
| Mouse anti-Fasciclin2 | DSHB | 1D4 | Dilution 1:10 |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315, 232-242 (2008).
- Hattori, Y., Sugimura, K., Uemura, T. Selective expression of Knot/Collier, a transcriptional regulator of the EBF/Olf-1 family, endows the Drosophila sensory system with neuronal class-specific elaborated dendritic patterns. Genes Cells. 12, 1011-1022 (2007).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43, 809-822 (2004).
- Li, W., Wang, F., Menut, L., Gao, F. B. BTB/POZ-zinc finger protein abrupt suppresses dendritic branching in a neuronal subtype-specific and dosage-dependent. 43, 823-834 (2004).
- Zlatic, M., Landgraf, M., Bate, M. Genetic specification of axonal arbors: atonal regulates robo3 to position terminal branches in the Drosophila nervous system. Neuron. 37, 41-51 (2003).
- Grueber, W. B., Ye, B., Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Dendrites of distinct classes of Drosophila sensory neurons show different capacities for homotypic repulsion. Curr Biol. 13, 618-626 (2003).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112, 805-818 (2003).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Moore, A. W. Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology. Cell Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol. Cell. Neurosci. 35, 383-396 (2007).
- Nishimura, Y. Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model. J Neurogenet. 24, 194-206 (2010).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 5199-5204 (2007).
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19, 799-806 (2009).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (1), e85-e85 (2006).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Merritt, D. J., Whitington, P. M. Central projections of sensory neurons in the Drosophila embryo correlate with sensory modality, soma position, and proneural gene function. J Neurosci. 15, 1755-1767 (1995).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Wong, A. M., Wang, J. W., Axel, R. Spatial representation of the glomerular map in the Drosophila protocerebrum. Cell. 109, 229-241 (2002).
- Shimono, K. Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death. Neural Dev. 4, 37-37 (2009).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Kaczynski, T. J., Gunawardena, S. Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (46), e2150-e2150 (2010).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. J Vis Exp. , (2009).
- Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster. Genetics. 172, 2325-2335 (2006).
- Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress. J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sugimura, K. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
- Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites. Dev Biol. 260, 207-225 (2003).
