Summary
の樹状分枝感覚ニューロン
Abstract
神経系の発達には、正確なニューロンのクラス特有の樹状突起の発達と軸索の配線が続くニューロンの位置と同一の正確な仕様が必要です。最近ショウジョウバエの幼虫の末梢神経系（PNS）の樹状分枝（DA）の感覚ニューロンは、ニューロンの分化の両方の一般とクラス固有のメカニズムを解明するための強力な遺伝的モデルとなっている。 4つの主要なDAニューロンのクラス（I - IV）1があります。彼らは、増加する樹状突起の複雑さの順に名前が付けられ、それらの分化2-10の遺伝的制御のクラス固有の相違点を持っています。 1）それが2）、DAニューロン樹状突起が広がる、ショウジョウバエで利用できる強力な遺伝学的ツールを活用することができますので、DA感覚システムは、樹枝状形態の制御11から13の背後にある分子メカニズムを調べるために実用的なモデルです。光学的にCLEの下にだけ2次元のそれは容易にin vivoでの高分解能で可視化することAR幼虫のクチクラ、3）樹枝状形態におけるクラス固有の多様性は、単純な比較高度に分岐した樹枝状の木の形成を制御する重要な要素を見つけるために比較分析を容易に、そして4）樹状あずまや固定観念別のDAニューロンの形状は、形態学的統計分析を促進する。
DAニューロンの活動は、幼虫の運動中枢パターン発生器14から16の出力を変更します。別のDAニューロンのクラスは、異なる感覚モダリティを持っており、それらの活性化は、14,16-20異なる行動反応を誘発する。さらに別のクラスには、腹側神経索のショウジョウバエ幼虫の中枢神経系（VNC）21に型通りに軸索投射を送る。これらの予測は、樹状フィールド7,22の体壁のDAニューロンの感覚モダリティと位置の両方の地形表現で終了、23。 DA軸索突起のよって検査は、地形図7,22,23、だけでなく、簡単な回路を変調幼虫の運動14から17までの配線の基礎となるメカニズムを解明するために使用することができます。
ここではMARCM（抑制性細胞マーカーを持つモザイク解析）1,10,25とFLPアウト22,26,27技術（図1に要約）を介して24マーキングDAニューロンを生成し、遺伝的モザイクを分析する実用的なガイドを提示する。
Protocol
試薬の1.Preparation
- のCa + + -フリーHL3.1生理食塩水28を準備する。
- mMで：70のNaCl、5のKCl、20のMgCl 2、10飽和NaHCO 3、5 HEPES、115スクロース、および5トレハロース、pHは7.2。滅菌濾過し、4℃で保存します。
注：CA + + - free溶液は、解剖時の筋収縮を防ぎます。
- mMで：70のNaCl、5のKCl、20のMgCl 2、10飽和NaHCO 3、5 HEPES、115スクロース、および5トレハロース、pHは7.2。滅菌濾過し、4℃で保存します。
- ポリ- L -リジン（PLL）カバースリップを行います。
- -20℃で4.2ミリリットルの水に100mgのPLLを溶解し、エッペンドルフチューブや凍結で300μlアリコートを作る
- コーティングのカバースリップは、最初の雪解けアリコートを、のddH 2 Oで10ミリリットルにそれを起動してコダックフォト-フローの20μlのを追加する前に、最終的なPLL濃度は0.7 mg / mlのです。
- PLL溶液中で30分のための水没のカバースリップは、削除して乾燥させ、その後水と乾燥で簡単にすすいでください。二回繰り返します。治療をカバースリップ最後の約1ヶ月。
2。遺伝的交雑
- ToはMARCMのクローンを生成する。ここでパン- DAのドライバ11,27を使用して例のクロスは、次のとおりです。
FRT2A X hsFLP、Gal4の109（2）80、UAS - mCD8：：GFP、浴槽- Gal80 FRT2A/SM5-TM6B - FLPアウトのクローンを生成する 。ここにクラスIV固有のドライバ8を使用して例のクロスは、次のとおりです。
PPK - Gal4のX YW、hsFLP、UAS - FRT - CD2、Y +ワンストップFRT - mCD8：：GFP
3。胚のコレクション
- 25℃コレクションの瓶の中にショウジョウバエの交配を維持° Cと酵母ペースト30,31の薄い層でリンゴジュース寒天プレート29スプレッドに胚を収集する。
4。胚の熱ショックの治療
- 胚が敷設されている時にりんごジュースの寒天プレートに反対して空の皿を置きます。パラフィルム（図2）これらの二つのプレートの周囲に封をします。
- 熱ショック時に、水没の目eの水浴中でプレートとは、金属の重量を使用して、それを押したままにします。
- MARCMの胚の
- 2Hのための胚を収集し、囲まれた10センチメートルペトリ皿で培養するには、追加の2時間25℃で組織を湿らせた。
注：熱ショックプロトコルを調整するには、クローンが生成される頻度を変更します。 - 単一の孤立したニューロンを目指すクローンの数が少なく、、38で1時間、水浴で沈めると熱ショック℃での
- クローンの数が多いほど、38〜45分の熱ショック° Cの場合は、追加の30分のためにもう一度、RT 30分で熱ショックを回復する。
- 2Hのための胚を収集し、囲まれた10センチメートルペトリ皿で培養するには、追加の2時間25℃で組織を湿らせた。
- 38で1HのためにFLPアウト24時間のための胚、および熱ショックを収集℃に
5。クローンのスクリーニング
- 熱ショック後は、防水配置と場所湿らせたティッシュに囲まれた10cmのペトリ皿にリンゴジュース寒天プレートの蓋を取り外します。文化ワンダまでの胚および25℃で、その後の幼虫° CING第3齢幼虫。
注：特に培養条件、栄養は、DA樹状アーバ形態32,33を変更することが示されている。成長する幼虫は常に酵母ペーストへのアクセス権を持っていることを確認してください。必要に応じて貼り付け、酵母を監視し、補充する。 - プロトコルの以降で、この点から、ゆっくりと昆虫鉗子を使用して幼虫を操作。
- 簡単に言うと、ゆっくりと水道水の幼虫をリンスし、寒天プレート上に置きます。
注：このステップは、バックグラウンド幼虫の表面上に食べ物や汚れから自家蛍光を減少させる。 - 強力な蛍光解剖顕微鏡下で幼虫を調べます。体壁のGFP陽性ニューロン/細胞と幼虫を識別します。
（6）樹状突起のin vivoイメージング
- 80％グリセロールの小滴とうつ病のスライドグラスに幼虫を置きます。幼虫を固定するためにスライドにカバースリップを配置。空気が幼虫とcoversliの間に残っていないことを確認してください頁
- 静かに関心のニューロンの可視化を可能にする幼虫をロールバックするためにカバースリップを押してください。イメージmCD8：：共焦点顕微鏡を介してGFPで標識された樹状アーバー。
7。幼虫の解剖
開始する前に注意してください：DAニューロンの樹状突起は、解剖の開始後に急激に低下する。良好な樹状突起の形態を確保するために以下の5分で、個々の幼虫を解剖。
- 次の変更で以前に34に記載のようにSylgard板の上に第3齢幼虫をさまよう解剖：
- DAニューロン軸索末端のイメージングのための、CNSが損なわれていないと分節神経が壊れていないことを確認してください。幼虫を開いた後、最初に慎重に体壁に気管の接続を切断してから、ゆっくりと全体の腸を取り除く。
- 単独でのイメージング樹状突起の場合、平坦に取り付け可能にするためにCNSを取り除く。
8。 Fixat幼虫のフィレットのイオンとブロッキング
- それでもSylgardプレートに固定幼虫で、そっと回転シェーカー上で室温で20分のためにPBS中4％PFAで固定して下さい。
- 固定した後、幼虫組織の痕跡を（脂肪体、気管など）を取り外します。
- Sylgardプレートとシェーカー上で3倍の10分（0.1％トリトンX - 100を含むPBS）をPBSTで洗浄する。軸索の末端を調べる場合、Sylgardのプレート上にフィレットを保持します。 （染色の樹状突起の場合には、このステップ34で、0.5 mlチューブに幼虫のフィレットを転送することが可能です）
- シェーカーでPBSTで5％正常ロバ血清（NDS）で、室温で20分のための幼虫をブロックする。
9。幼虫のフィレットの染色
- 一次抗体のブロッキング溶液とインキュベートすることにより囲まれた小さなタッパーウェアの容器に° Cがティッシュを湿らせ一晩4（NDS / PBST 5％）を取り外します。
- 4℃からチューブを外し、室温でさらに1時間インキュベートする。
- PBSTで6倍の10分を洗ってください。二次antibを追加odyは、（5％でNDS / PBST）、およびカバーは、フルオロフォアの光退色34を防止する。
- 2時間室温でどちらインキュベート、または一晩4℃で、室温で一時間が続く。
- PBSTで幼虫6倍の10分を洗浄し、取り付けに進みます。
10。樹状突起の検査のために幼虫のフィレットの取付け
- 解剖ハサミや頭部（口のフックを含む）、および34（気門を含めて）後部を切断する外科用メスを用いて可能な限り平坦各幼虫のフィレットをマウントします。
- スライドダウンキューティクル側での幼虫のフィレットを配置し、80％グリセロールでマウントし、そして"速い"マウント34に対してマニキュアとカバーの両側をシール。
- 永久的な取付けと鮮明な画像のための
- PLLのカバースリップ上でPBSのドロップに解剖幼虫のフィレット筋肉側を下に置く、それはすぐにカバースリップを遵守します。
- howeve、実装後できるだけ大量の液体を削除します。rはそれが完全に乾燥することはできません。
- エタノール系列を通してカバースリップを（添付の幼生フィレット付き）を取る：35％エタノール、50％、70％、95％、続いて、最後に10分間ごとに100％エタノールの2倍（2番目の100パーセントEtOH溶液を頻繁に変更する必要があります。 ）、最終的に、キシレンの2〜3倍に10分を洗浄する。
- 洗浄したスライド上でDPX封入（Distyreneの可塑剤をキシレン ）のドロップを入れて、慎重に上にフィレットサイドダウンカバースリップを置く。暗所で保管し、イメージングの前に設定してDPXに1日待つ。
11。軸索末端の検査のために幼虫のフィレットの取付け
- 分節性神経は解剖、固定時にそのままPNSとCNSとの間で実行されている、と末梢感覚神経の細胞体からVNCへの軸索のトレースを可能にするために染色してください。
- うつ病のスライドの80％グリセロール中でそれぞれの幼虫のフィレットキューティクル側を下にマウントします。 DAの細胞体から軸索へのトレース共焦点顕微鏡下でVNC。注：VNCの同族セグメントにそれぞれ体壁のセグメントのプロジェクトでPNSニューロン。
12。代表的な結果：
代表的な結果は、図3-5に示します。図。図3は、共焦点顕微鏡下で生体内でキャプチャされたクラスIVダニューロン、全体のアーバーを示しています。図。 4は正しく形態を維持するために修正されている免疫組織化学的に標識されたクラスIIIのニューロンの樹状突起の部分のクローズアップを示しています。関連するはめ込みショー失敗解剖と固定（抗GFP抗体で染色の両方）の後に発生する可能性が低下。図。図5にCNS内の単一のクラスIV軸索の末端（抗GFP、緑色）、すべてのクラスIVの末端は、抗CD2（マゼンタ）と共染色される。
1プロトコルの概要を示します 。 A）を収集し、熱ショック胚。 B） GFP陽性DAニューロンのクローンと幼虫を選択し、[画像のライブ幼虫で樹状突起をGFPで標識した。 c）の幼虫を摘出し、免疫組織化学的にフィレットを染色。 D）染色したフィレットをマウントし、イメージ樹あずまやDAニューロンのクローンの軸索投射を。
熱ショック用リンゴジュース寒天プレートの2】図 。プレートを取る（白い矢印、AB）、（赤の矢印B）上に別のペトリ皿を追加し、パラフィルム（青矢印、B）の周りシール。
mCD8の樹状突起の in vivo画像で 図3：：第3齢幼虫のクラスIV（v'ada）ニューロンを示すGFP標識MARCMのクローン（2.1のように遺伝子型）。スケールバーは50μmのです。
d/3111/3111fig4.jpg"/>
図4 mCD8：：成功郭清と固定（緑）の後に良好な形態を示す、抗GFP抗体で染色されたクラスIIIニューロン（ddaA）のGFP標識MARCMのクローン。失敗した解剖と固定（マゼンタ）の後に発生する挿入図の樹状突起の劣化（白矢印）。スケールバーは25μmのです。
図5第3齢幼虫幼虫VNC。単一のクラスVI（VDAB）軸索の末端（2.2のような遺伝子型）のFLPアウトクローンを抗GFP抗体（緑）を使用して検出される。抗CD2は、すべてのクラスIV末端（マゼンタ）のラベルを付けます。スケールバーは25μmのです。
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Discussion
ショウジョウバエ幼虫のDAニューロンモデルは、制御のニューロンの形態と回路形成そのメカニズムを調べる一つの優れた遺伝システムを提供します。 MARCMは、一般的に標識のためにと体DAニューロンのクローンを生成するために使用されます。 MARCMのために私達はどちらか汎神経（例えば、Gal4の C155）またはDAニューロン固有のドライバを使用してください。汎神経ドライバを直接使用すると、株式公開センターから広く利用可能ないくつかの銘柄を使用することが可能です。しかし、DA -ニューロン固有のドライバを使用すると顕著なクローンはCNSで生成されないので、有利であることができる、そしてそのようなクローンはDA軸索末端の解析を困難にすることができます。一般的に使用されるDA固有のGal4の行のリストは、下野ら（2009）27で発見できます。 FLPアウトは、研究者が併用異所的に単一のラベルが付いたニューロンにGAL4 - UASのバイナリシステム35と測定の形態を用いて遺伝子を発現する際に特に有用である。加えてイメージングDAニューロンが単独でGAL4 - UASシステム35を使用してマークされているときにここで紹介するプロトコルを使用することができます。
良い蛍光解剖顕微鏡が使用できない場合、それは通常の蛍光顕微鏡と長作動距離対物に使用してクローンを運んで幼虫を選択することが可能です。樹状突起のライブイメージング中（セクション6）我々は単にカバースリップによって発揮される下向きの力によって幼虫を固定化する。他の用途の捜査のためのこのプロトコルの適応にも麻酔36,37を介して幼虫を固定することもできます。
免疫組織染色の間に、我々は一般的にニューロンを標識するための抗GFPまたは抗CD8を使用してください。 FLPアウトで実験抗CD2は、さらに使用されるGal4のドライバーラインナップが（図5）がアクティブであるすべてのニューロンにマークを付けることができます。 VNCにおけるDAの軸索末端を調べるときに、抗Fasciclin2抗体標識は、画期的な軸索 の広大7,22,38を強調するために使用する場合があります。
32を変えることができることに注意してください。また、特にDAニューロンの樹状突起、クラスIIIおよびクラスIVのものは、解剖の開始後に急激に低下します。我々は解剖と個々に幼虫の修正を示唆している。固定は樹状突起形態の良好なメンテナンス性を確保するために解剖を開始するの5mins内で発生する必要があります。最後に、可能な限り平坦な幼虫をマウントすると、大きく、その後の形態計測分析を支援します。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、資金調達のために理研に感謝。我々はまた、遺伝的および免疫組織化学プロトコルに関する議論のためにCagri Yalgin、キャロラインDelandre、とジェイパリッシュに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZX16 fluorescence dissection microscope (with GFPHQ filter) | Olympus Corporation | SZX16 | |
| Live Insect Forceps | Fine Science Tools | 26030-10 | |
| 26mm x 76mm depression slide glass | Toshinriko Co. | T8-R004 | |
| Sylgard 184 (or Silpot 184) | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1524 | This product has proven most effective |
| DPX mounting medium | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Rabbit anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-CD8 | Caltag | 5H10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-CD2 | AbD Serotec | MCA443R | Dilution 1:700 |
| Mouse anti-Fasciclin2 | DSHB | 1D4 | Dilution 1:10 |
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