Summary
Den dendrittiske arborization sensoriske nevroner av
Abstract
Nevrologiske utvikling krever korrekt spesifisering av neuron posisjon og identitet, etterfulgt av nøyaktig neuron klasse-spesifikke dendrittiske utvikling og aksonal ledninger. Nylig dendrittiske arborization (DA) sensoriske nevroner av Drosophila larve perifere nervesystemet (PNS) har blitt kraftig genetiske modeller i å belyse både generelle og klasse-spesifikke mekanismer for neuron differensiering. Det er fire hoved DA neuron klasser (I-IV) 1. De er navngitt i rekkefølge av økende dendrite arbor kompleksitet, og har klasse-spesifikke forskjeller i den genetiske kontroll av sine differensiering 2-10. DA sensoriske systemet er en praktisk modell for å undersøke de molekylære mekanismene bak kontroll av dendrittiske morfologi 11-13 fordi: 1) det kan dra nytte av kraftige genetiske verktøy tilgjengelig i bananflue, 2) DA nervecellen dendrite arbor sprer seg i kun to dimensjoner under en optisk CLEar larve cuticle gjør det enkelt å visualisere med høy oppløsning in vivo, 3) klasse-spesifikke mangfold i dendrittiske morfologi muliggjør en komparativ analyse for å finne nøkkelelementer kontrollere dannelsen av enkle vs svært forgrenede dendrittiske trær, og 4) dendrittiske arbor stereotype figurer av forskjellige DA nevroner lette morfometriske statistiske analyser.
DA neuron aktivitet endrer produksjonen av en larve bevegelse sentralt mønster generator 14-16. De ulike DA neuron klasser har forskjellige sensoriske modaliteter, og deres aktivisering utløser forskjellige atferdsmessige responser 14,16-20. Videre forskjellige klasser send aksonal prognoser stereotypically i Drosophila larve sentrale nervesystemet i ventrale nerve ledningen (VNC) 21. Disse prognosene avslutte med topografiske representasjoner av både DA neuron sensorisk modalitet og stillingen i kroppen veggen av dendrittiske feltet 7,22, 23. Derfor undersøkelse av DA aksonal projeksjoner kan brukes til å belyse mekanismene bak topografisk kartlegging 7,22,23, samt kabling av en enkel krets modulerende larve bevegelse 14-17.
Vi presenterer her en praktisk guide til å generere og analysere genetisk mosaikk 24 merking DA nevroner via MARCM (Mosaic Analysis med en Repressible Cell Marker) 1,10,25 og Flp-out 22,26,27 teknikker (oppsummert i fig. 1).
Protocol
1.Preparation av reagenser
- Forbered Ca + +-free HL3.1 saltvann 28.
- I mM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 2 MgCl, 10 3 NaHCO, 5 HEPES, 115 sukrose, og 5 trehalose, pH 7,2. Filter sterilisere og oppbevar ved 4 ° C.
Merk: Ca + +-free løsning forhindrer muskel sammentrekning ved disseksjon.
- I mM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 2 MgCl, 10 3 NaHCO, 5 HEPES, 115 sukrose, og 5 trehalose, pH 7,2. Filter sterilisere og oppbevar ved 4 ° C.
- Gjør poly-L-lysin (PLL) Dekkglass.
- Løs opp 100mg PLL i 4.2ml vann og gjøre 300μl alikvoter i Eppendorf rør og fryses ved -20 ° C.
- Før belegg Dekkglass, først tine en delmengde, ta det opp til 10ml i DDH 2 O og legge 20μl av Kodak Photo-Flo, den endelige PLL konsentrasjonen er 0,7 mg / ml.
- Senk Dekkglass for 30 min i PLL løsning, fjerne og tørre, skyll deretter kort med vann og tørk. Gjenta to ganger. Behandlet Dekkglass vare rundt én måned.
2. Genetisk krysser
- To generere MARCM kloner. Her er et eksempel krysse ved hjelp av en pan-DA driver 11,27:
FRT2A x hsFLP; Gal4 109 (2) 80, UAS-mCD8:: GFP; tub-Gal80 FRT2A/SM5-TM6B - For å generere Flp-out kloner. Her er et eksempel krysse ved hjelp av en klasse IV-spesifikk driver 8:
PPK-Gal4 x YW, hsFLP; UAS-Frt-CD2, y +-stop-Frt-mCD8:: GFP
3. Innsamling av embryo
- Hold Drosophila kors i en samling flaske ved 25 ° C og samle embryo på et eple juice agar plate 29 spredt med et tynt lag med gjær lim 30,31.
Fire. Heat sjokk behandling av embryo
- Sett en tom plate i opposisjon til eplejuice agar plate hvorpå embryoene har blitt lagt. Seal rundt disse to platene med Parafilm (Fig. 2).
- Under varme sjokk, senk the plate i vannbad og hold den nede ved hjelp av et metall vekt.
- For MARCM embryo
- Samle embryoer for 2t og inkuberes i en 10cm petriskål omgitt av fuktig vev ved 25 ° C for en ekstra 2t.
Merk: Justering av heat shock protokoll endrer frekvensen som kloner er generert. - For et mindre antall kloner, sikter for enkelt isolerte nerveceller, senk og varme sjokk i vannbad for 1t ved 38 ° C.
- For et større antall kloner, varme sjokk for 45 minutter ved 38 ° C, gjenopprette kl 30 min RT, deretter varme sjokk igjen for ytterligere 30 min.
- Samle embryoer for 2t og inkuberes i en 10cm petriskål omgitt av fuktig vev ved 25 ° C for en ekstra 2t.
- Samle Flp-out embryo for 24, og varme sjokk for 1t ved 38 ° C.
5. Screening for kloner
- Etter varme sjokk, fjern lokket på vanntett arrangement og plasser eplejuice agar plate i en 10cm petriskål omgitt av fuktet vev. Kultur embryoene og påfølgende larver ved 25 ° C inntil vandreing 3. Instar.
Merk: kultur, særlig ernæring, har vist seg å endre DA dendrittiske lysthus morfologi 32,33. Kontroller at voksende larvene har tilgang til gjær lime inn hele tiden, overvåke og fylle gjær lime etter behov. - Fra dette punkt i protokollen framover, manipulere larver forsiktig med insekt tang.
- Kort og forsiktig skyller larvene i vann fra springen, og deretter plassere på en agar plate.
Merk: Dette trinnet reduserer bakgrunnsstøy auto-fluorescens fra mat eller skitt på larve overflaten. - Undersøk larvene under et kraftig fluorescens dissekere mikroskop. Identifiser larver med GFP-positive nevroner / celler i kroppen veggen.
Seks. In vivo avbildning av dendritter
- Plasser larve inn i en depresjon skyve glass med en liten dråpe 80% glyserol. Plasser et dekkglass på lysbilde for å immobilize larven. Sørg for at ingen luft forblir mellom larve og coverslis.
- Skyv dekkglass å rulle larven å tillate visualisering av nervecellen av interesse. Bilde av mCD8:: GFP-merket dendrittiske arbor via konfokalmikroskopi.
7. Larve disseksjon
Merk før du begynner: DA neuron dendritter nedbrytes raskt etter oppstart av disseksjon. Dissekere hver enkelt larve på mindre enn 5min å sikre god dendrite morfologi.
- Dissekere vandrende 3. Instar larver på en Sylgard plate som beskrevet tidligere 34 med følgende endringer:
- For avbildning av DA nervecellen axon Termini, sørge for at CNS er intakt og segmenter nervene er ikke brutt. Etter åpning larvene, først forsiktig kutte tracheal forbindelser til kroppen veggen og deretter forsiktig fjerne hele tarmen.
- Hvis bildebehandling dendritter alene, fjerne CNS å tillate en flatere montering.
8. Fixation og blokkering av larve filet
- Med larve fortsatt låst til Sylgard plate, fikse det i 4% PFA i PBS for 20mins ved RT på en forsiktig roterende shaker.
- Fjern rester av larve vev (fett kroppen, luftrøret, etc.) etter fiksering.
- Vask i PBST (PBS med 0,1% Triton X-100) 3x 10mins på Sylgard plate og shaker. Hvis undersøke axon Termini, holde fileten på Sylgard plate. (Hvis flekker dendritter det er mulig å overføre larve fileter til en 0,5 ml tube på dette trinnet 34)
- Block larvene for 20mins ved RT i 5% normal esel serum (NDS) i PBST på en shaker.
9. Farging av larve filet
- Fjern blokkering løsningen og inkuberes i primær antistoff (på 5% NDS / PBST) over natten ved 4 ° C i en liten Tupperware container omgitt av fuktet vev.
- Fjern rørene fra 4 ° C og inkuber en ekstra time på RT.
- Vask 6x 10mins i PBST. Legg den sekundære antibody (på 5% NDS / PBST), og dekke for å hindre fluoroforen foto-bleking 34.
- Inkuber enten ved RT i to timer eller over natten ved 4 ° C, etterfulgt av en time ved RT.
- Vask larvene 6x 10mins i PBST og videre til montering.
10. Montering av larver filet for undersøkelse av dendrite arbor
- Mount hver larve filet så flat som mulig med dissecting saks eller en skalpell til å kutte hodet (inkludert munn kroker) og bakre (inkludert spiracles) 34.
- Plasser larve fileten på lysbildet skjellaget-side ned, montere i 80% glyserol, og forsegle sidene av dekkglass med neglelakk for en "rask" mount 34.
- For en permanent montering og et klarere bilde
- Plasser dissekert larve fileten muskel-side ned på et fall på PBS på en PLL dekkglass, vil det raskt overholde dekkglass.
- Fjern så mye væske som mulig etter montering, however ikke la det tørke helt.
- Ta dekkglass (med vedlagt larve filet) gjennom en etanol-serien: 35% etanol, etterfulgt av 50%, 70%, 95%, og til slutt 2x 100% etanol hver på 10 minutter (den andre 100% EtOH løsning bør endres hyppig ), og endelig, vaske 2-3x 10mins i xylen.
- Legg en dråpe DPX mountant (Distyrene plasticizer Xylen) på en ren slide og forsiktig legge dekkglass fileten-side-ned på toppen. Oppbevares i mørket, og vente en dag for DPX å sette før bildebehandling.
11. Montering av larver filet for undersøkelse av axon Termini
- Hold segmental nervene kjører mellom PNS og CNS intakt under disseksjon, fiksering, og flekker å tillate sporing av axoner fra perifer sensorisk nevron celle kroppen til VNC.
- Mount hver larve filet cuticle-side ned i 80% glyserol i en depresjon lysbilde. Trace axoner fra DA celle kroppen tilVNC under confocal mikroskop. Merk: PNS nevroner i hver kropp vegg segment prosjektet til beslektet segmentet av VNC.
12. Representant Resultater:
Representative Resultatene er vist i figur 3-5. Fig. 3 viser hele arbor av en klasse IV da nervecellen, fanget in vivo under confocal mikroskop. Fig. 4 viser et nærbilde av en del av dendrite arbor av en immunohistochemically merket klasse III nervecellen som er korrekt fast for å bevare morfologi. Den tilhørende innfelt viser degradering som kan oppstå etter et mislykket disseksjon og fiksering (både farget med anti-GFP antistoff). Fig. 5 viser en enkelt klasse IV axon endestasjonen i CNS (anti-GFP, grønn); alle klasse IV Termini er co-farget med anti-CD2 (magenta).
Figur 1. Protokoll oversikt. a) Samle og deretter varme-sjokk embryoer. b) Velg en larve med GFP-positive DA neuron klone, og deretter bildet den GFP-merket dendrite storspole i live larve. c) dissekere larve, og deretter immunohistochemically beis fileten. d) Monter farget filet, og deretter bilde av dendrittiske arbor og aksonal projeksjoner av DA neuron kloner.
Figur 2 Forberedelse av eplejuice agar plate for varme sjokk. Ta plate (hvit pil, ab), legge til en andre petriskål på toppen (rød pil b) og forsegling rundt med Parafilm (blå pil, b).
Figur 3 in vivo bilde av dendrite arbor av en mCD8:: GFP-merket MARCM klone (genotype som i 2.1) representerer en klasse IV (v'ada) nervecelle til en 3. Instar larva. Scale bar er 50μm.
d/3111/3111fig4.jpg "/>
Figur 4 mCD8:: GFP-merket MARCM klone av en klasse III nevron (ddaA) farget med anti-GFP antistoff, viser god morfologi etter vellykket disseksjon og fiksering (grønn). Det innfelte viser dendrite nedbrytning (hvite piler) som oppstår etter mislykket disseksjon og fiksering (magenta). Scale bar er 25μm.
Figur 5 3. Instar larve VNC. En Flp-out klone av en enkelt klasse VI (vdaB) axon endestasjonen (genotype som i 2.2) er oppdaget ved hjelp av anti-GFP antistoff (grønn). Anti-CD2 etiketter alle klasse IV Termini (magenta). Scale bar er 25μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Drosophila larve DA neuron modellen gir en utmerket genetisk system for å undersøke mekanismer som styrer neuron morfologi og krets formasjon. MARCM er vanligvis brukt for merking og for generering mutant DA neuron kloner. For MARCM bruker vi enten en pan-nevrale (f.eks Gal4 c155) eller DA nevron-spesifikk driver. Ved hjelp av en pan-neural driver det er mulig å direkte bruke flere aksjer tilgjengelig fra offentlige lager sentre. Men ved hjelp av en DA-nevron bestemt driver kan være en fordel fordi merket kloner ikke vil bli generert i CNS, og slike kloner kan komplisere analysen av DA aksonal Termini. En liste over vanlig brukte DA-spesifikke Gal4 linjer kan finnes i Shimono et al (2009) 27. Flp-out kan være spesielt nyttig når etterforskerne ønsker å samtidig ectopically uttrykke et gen bruker Gal4-UAS binært system 35 og måle morfologi i en enkelt merket neuron. I tillegg bildebehandlingprotokoller som presenteres her kan brukes når DA nevroner er merket med Gal4-UAS systemet 35 alene.
Hvis en god fluorescerende dissekere mikroskop er utilgjengelig, er det mulig å velge larve bære kloner bruker på en vanlig fluorescerende mikroskop og et objektiv med lang avstand. Under leve avbildning av dendrite arbor (§ 6) vi immobilize larven utelukkende gjennom nedover makt utøves av dekkglass. I tilpasning av denne protokoll for annen bruk etterforskere kan også immobilize larvene gjennom anestesi 36,37.
Under immunohistological farging, vi vanligvis bruker anti-GFP eller anti-CD8 for merking nervecellen. I Flp-eksperimenter anti-CD2 kan i tillegg merke alle nevroner i hvor Gal4 driver linjen som brukes er aktiv (Fig. 5). Når undersøke DA axon terminaler i VNC, kan anti-Fasciclin2 antistoff merking være å brukes til å markere landemerke axon traktater 7,22,38.
32. Videre vil DA nervecellen dendritter, spesielt de av klasse III og klasse IV, nedbrytes raskt etter begynnelsen av disseksjon. Vi foreslår dissecting og fikse larva individuelt. Fiksering skal skje innen 5mins initiere disseksjon for å sikre godt vedlikehold av dendrite morfologi. Til slutt vil montering larver så flat som mulig stor hjelp senere morfometriske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne takker Riken for finansiering. Vi takker også Cagri Yalgin, Caroline Delandre, og Jay Parrish for diskusjoner om genetisk og immunhistokjemi protokoller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZX16 fluorescence dissection microscope (with GFPHQ filter) | Olympus Corporation | SZX16 | |
| Live Insect Forceps | Fine Science Tools | 26030-10 | |
| 26mm x 76mm depression slide glass | Toshinriko Co. | T8-R004 | |
| Sylgard 184 (or Silpot 184) | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1524 | This product has proven most effective |
| DPX mounting medium | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Rabbit anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-CD8 | Caltag | 5H10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-CD2 | AbD Serotec | MCA443R | Dilution 1:700 |
| Mouse anti-Fasciclin2 | DSHB | 1D4 | Dilution 1:10 |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315, 232-242 (2008).
- Hattori, Y., Sugimura, K., Uemura, T. Selective expression of Knot/Collier, a transcriptional regulator of the EBF/Olf-1 family, endows the Drosophila sensory system with neuronal class-specific elaborated dendritic patterns. Genes Cells. 12, 1011-1022 (2007).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43, 809-822 (2004).
- Li, W., Wang, F., Menut, L., Gao, F. B. BTB/POZ-zinc finger protein abrupt suppresses dendritic branching in a neuronal subtype-specific and dosage-dependent. 43, 823-834 (2004).
- Zlatic, M., Landgraf, M., Bate, M. Genetic specification of axonal arbors: atonal regulates robo3 to position terminal branches in the Drosophila nervous system. Neuron. 37, 41-51 (2003).
- Grueber, W. B., Ye, B., Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Dendrites of distinct classes of Drosophila sensory neurons show different capacities for homotypic repulsion. Curr Biol. 13, 618-626 (2003).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112, 805-818 (2003).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Moore, A. W. Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology. Cell Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol. Cell. Neurosci. 35, 383-396 (2007).
- Nishimura, Y. Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model. J Neurogenet. 24, 194-206 (2010).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 5199-5204 (2007).
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19, 799-806 (2009).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (1), e85-e85 (2006).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Merritt, D. J., Whitington, P. M. Central projections of sensory neurons in the Drosophila embryo correlate with sensory modality, soma position, and proneural gene function. J Neurosci. 15, 1755-1767 (1995).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Wong, A. M., Wang, J. W., Axel, R. Spatial representation of the glomerular map in the Drosophila protocerebrum. Cell. 109, 229-241 (2002).
- Shimono, K. Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death. Neural Dev. 4, 37-37 (2009).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Kaczynski, T. J., Gunawardena, S. Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (46), e2150-e2150 (2010).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. J Vis Exp. , (2009).
- Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster. Genetics. 172, 2325-2335 (2006).
- Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress. J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sugimura, K. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
- Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites. Dev Biol. 260, 207-225 (2003).
