Summary
De dendritiske arborization sensoriske neuroner i det
Abstract
Nervesystemets udvikling kræver den korrekte specifikation af neuron position og identitet, efterfulgt af præcise neuron klasse-specifikke dendritiske udvikling og axonal ledninger. For nylig dendritiske arborization (DA) sensoriske neuroner i det Drosophila larvestadiet perifere nervesystem (PNS) er blevet magtfulde genetiske modeller til at belyse både generelle og klasse-specifikke mekanismer neuron differentiering. Der er fire vigtigste DA neuron klasser (I-IV) 1. De er opkaldt efter stigende dendritceller Arbor kompleksitet, og har klasse-specifikke forskelle i den genetiske kontrol over deres differentiering 2-10. The Da sensoriske system er en praktisk model til at undersøge de molekylære mekanismer bag kontrol af dendritiske morfologi 11-13 fordi: 1) det kan drage fordel af den kraftige genetiske værktøjer til rådighed i bananfluen, 2) DA neuron dendritceller arbor breder sig i kun 2 dimensioner under et optisk Clear larver neglebånd gør det let at visualisere med høj opløsning in vivo, 3) den klasse-specifikke mangfoldighed i dendritiske morfologi letter en sammenlignende analyse for at finde centrale elementer styre dannelsen af simple vs stærkt forgrenede dendritiske træer, og 4) dendritiske arbor stereotype figurer af forskellige DA neuroner lette morfometriske statistiske analyser.
DA neuron aktivitet ændrer produktionen af en larvestadiet bevægelse central mønster generator 14-16. De forskellige DA neuron klasser har forskellige sanser, og deres aktivering udløser forskellige adfærdsmæssige reaktioner 14,16-20. Desuden forskellige klasser sende aksonal fremskrivninger stereotypically i Drosophila larvestadiet centrale nervesystem i ventrale nerve ledning (VNC) 21. Disse fremskrivninger opsige med topografiske fremstillinger af både DA neuron sensorisk modalitet og placeringen i kroppen væggen af dendritiske feltet 7,22, 23. Derfor undersøgelse af DA axonal fremskrivninger kan bruges til at belyse mekanismerne bag topografisk kortlægning 7,22,23, samt ledningsføring af et simpelt kredsløb modulerende larver bevægelse 14-17.
Vi præsenterer her en praktisk guide til at generere og analysere genetiske mosaikker 24 mærkning DA neuroner via MARCM (Mosaik analyse med en Repressible Cell Marker) 1,10,25 og FLP-out 22,26,27 teknikker (opsummeret i Fig. 1).
Protocol
1.Preparation af reagenser
- Forbered Ca + +-fri HL3.1 saltvand 28.
- I mm: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 saccharose, og 5 trehalose, pH 7,2. Filter steriliseres og opbevares ved 4 ° C.
Bemærk: Ca + +-fri løsning forebygger muskel sammentrækning under dissektion.
- I mm: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 saccharose, og 5 trehalose, pH 7,2. Filter steriliseres og opbevares ved 4 ° C.
- Gør poly-L-lysin (PLL) dækglas.
- Opløs 100mg PLL i 4.2ml vand og 300μl aliquoter i Eppendorf rør og fryses ved -20 ° C.
- Før belægning dækglas, først tø en alikvot, bringe det op til 10ml i Hedeselskabet 2 O og tilføjer 20μl af Kodak Photo-Flo, den endelige PLL koncentrationen er 0,7 mg / ml.
- Nedsænkes dækglas til 30 min i PLL løsning, fjerne og tørre, og derefter skylles kortvarigt med vand og tør. Gentag to gange. Behandlet dækglas vare cirka en måned.
2. Genetiske krydser
- To generere MARCM kloner. Her er et eksempel på tværs ved hjælp af en pan-DA-driver 11,27:
FRT2A x hsFLP; Gal4 109 (2) 80, UAS-mCD8:: GFP; TUB-Gal80 FRT2A/SM5-TM6B - For at generere FLP-out kloner. Her er et eksempel på tværs ved hjælp af et klasse IV-specifik driver 8:
PPK-Gal4 x YW, hsFLP; UAS-FRT-CD2, y +-stop-FRT-mCD8:: GFP
3. Indsamling af embryoner
- Hold Drosophila krydser i en samling flaske ved 25 ° C og indsamle æg på et æble juice agarplade 29 stryges med et tyndt lag af gær pasta 30,31.
4. Heat shock behandling af embryoner
- Placer en tom tallerken i opposition til æblejuice agarplade, hvorpå embryonerne er blevet lagt. Seal omkring disse to plader med Parafilm (fig. 2).
- I løbet af heat shock, th oversvømmee plade i vandbad og hold den ned ved hjælp af en metal vægt.
- For MARCM embryoner
- Saml embryoner til 2h, og inkuber i en 10 cm petriskål omgivet af fugtig væv ved 25 ° C for en yderligere 2h.
Bemærk: Justering af heat shock-protokollen ændrer den frekvens, som kloner er genereret. - For et mindre antal kloner, der sigter til enkelte isolerede neuroner, dykke og varme chok i vandbad i 1 time ved 38 ° C.
- For et større antal kloner, genvinde varme chok for t 45 min ved 38 ° C, ved RT 30 min, derefter varme chok igen for en ekstra 30 min.
- Saml embryoner til 2h, og inkuber i en 10 cm petriskål omgivet af fugtig væv ved 25 ° C for en yderligere 2h.
- Saml FLP-out embryoner til 24, og varme chok for 1 time ved 38 ° C.
5. Screening for kloner
- Efter heat shock, fjerne låget på vandtæt arrangement og placer æblesaft agarplade i en 10 cm petriskål omgivet af fugtet væv. Kultur embryoner og efterfølgende larver ved 25 ° C, indtil vandreING 3 rd instar.
Bemærk: dyrkningsbetingelser, især ernæring, har vist sig at ændre DA dendritiske lysthus morfologi 32,33. Sørg for, at voksende larver har adgang til gær pasta til enhver tid, overvåge og genopbygge gær pasta efter behov. - Fra dette punkt i protokollen og fremefter, manipulere larver forsigtigt ved hjælp af insekt pincet.
- Kortvarigt og forsigtigt skylle larver i vand fra hanen, og anbring derefter ud på en agarplade.
Bemærk: Dette trin reducerer baggrundsstøjen auto-fluorescens fra mad eller snavs på larver overfladen. - Undersøg larver under en kraftig fluorescens dissektionsmikroskop. Identificer larver med GFP-positive neuroner / celler i kroppen væggen.
6. In vivo billeddannelse af dendritter
- Placer larve i en depression slide glas med et lille fald på 80% glycerol. Læg et dækglas på dias for at immobilisere larve. Sørg for, at ingen luft forbliver mellem larve og coverslis.
- Skub forsigtigt dækglasset at rulle larve til at tillade visualisering af neuron af interesse. Billede af mCD8:: GFP-mærkede dendritiske Arbor ved hjælp af konfokal mikroskopi.
7. Larver dissektion
Bemærk, før du begynder: DA neuron dendritter nedbrydes hurtigt efter indledningen af dissektion. Dissekere hver enkelt larve på mindre end 5min for at sikre god dendritceller morfologi.
- Dissekere vandrer 3 rd instar larver på en Sylgard plade som beskrevet tidligere 34 med følgende ændringer:
- For billeder af DA neuron Axon Termini, sikre, at CNS er intakt, og segmentær nerverne er ikke brudt. Efter åbning af larver, forsigtigt først klippe det trakeale forbindelser til kroppen væggen og derefter forsigtigt fjerne hele tarmen.
- Hvis billeddannelse dendrites alene, skal du fjerne CNS til at tillade en fladere montering.
8. Fixation og blokering af larvestadiet fileter
- Med larve stadig fastgjort til Sylgard pladen, ordne det i 4% PFA i PBS til 20mins på RT på et blidt roterende shaker.
- Fjerne spor af larver væv (fedt kroppen, luftrør, osv.) efter optagelsen.
- Vask i PBST (PBS med 0,1% Triton X-100) 3x 10 min på Sylgard plade og shaker. Hvis undersøge Axon Termini, holde fileten på Sylgard plade. (Hvis farvning dendritter det er muligt at overføre larvestadiet fileterne til et 0,5 ml rør på dette trin 34)
- Bloker larverne til 20mins på RT i 5% normal æsel serum (NDS) i PBST på en shaker.
9. Farvning af larver fileter
- Den blokerende opløsning fjernes, og inkuber i primære antistof (i 5% NDS / PBST) natten over ved 4 ° C i en lille Tupperware beholder omgivet af fugtet væv.
- Tag rør fra 4 ° C, og inkuber en ekstra time ved RT.
- Vask 6x 10 min i PBST. Tilsæt sekundære antibody (i 5% NDS / PBST), og dække for at forhindre fluoroforen foto-blegning 34.
- Inkuber enten på RT i to timer, eller natten over ved 4 ° C efterfulgt af en time ved RT.
- Vask larverne 6x 10 min i PBST og gå videre til montering.
10. Montering af larver fileter til undersøgelse af dendritceller Lysthuset
- Mount hver larver filet så flad som muligt ved hjælp af dissekering saks eller en skalpel til at skære hovedet (herunder munden kroge), og den bageste (herunder Spirakler) 34.
- Placer Larvetilstand fileten på diaset neglebånd nedad, monteres i 80% glycerol, og forsegl sider af dækglasset med neglelak for en 'hurtig' mount 34.
- For en permanent montering og et klarere billede
- Placer dissekerede larvestadiet fileten muskel-side ned på en dråbe af PBS på en PLL dækglas, vil det hurtigt holde sig til dækglasset.
- Fjern så meget væske som muligt efter montering, however ikke lade det helt tørt.
- Tag dækglasset (med vedhæftet larver filet) gennem en ethanol-serien: 35% ethanol, efterfulgt af 50%, 70%, 95%, og endelig 2x 100% ethanol hver i 10 minutter (2. 100% EtOH løsning bør ændres hyppigt ), og endelig, vaske 2-3x 10 min i xylen.
- Put en dråbe DPX indlejringsolie (Distyrene blødgører Xylen) på et rent objektglas og omhyggeligt lægge dækglasset fileten-side-down på toppen. Opbevares i mørke, og vente en dag for DPX at sætte før billeddannelse.
11. Montering af larver fileter til undersøgelse af Axon endestationer
- Hold segmental nerver løber mellem PNS og CNS intakte under dissektion, fiksering og farvning til at tillade opsporing af axoner fra perifer sensorisk neuron celle krop til VNC.
- Mount hver larver filet neglebånd nedad i 80% glycerol i en depression dias. Tegn axoner fra DA cellen kroppen tilVNC under konfokal mikroskop. Bemærk: PNS neuroner i hvert organ vægsegment projekt til beslægtet segment af VNC.
12. Repræsentative resultater:
Repræsentative resultater er vist i figur 3-5. Fig. 3 viser hele løvhytte af klasse IV da neuron, fanget in vivo under konfokal mikroskop. Fig. 4 viser et nærbillede af en del af dendritceller løvhytte af en immunohistochemically mærket klasse III neuron, der er blevet korrekt fast på at bevare morfologi. De associerede indsatte viser nedbrydningen som kan opstå efter et mislykket dissektion og fiksering (begge farvet med anti-GFP antistof). Fig. 5 viser en enkelt klasse IV Axon endestation i CNS (anti-GFP, grønt), alle klasse IV endestationer er co-farvet med anti-CD2 (magenta).
Figur 1 Protokol overblik. a) indsamle og derefter varme-chok embryoner. b) Vælg en larve med GFP-positiv DA neuron klon, og så billedet af GFP-mærkede dendritceller lysthus i den levende larve. c) at dissekere den larve, og derefter immunohistochemically pletten fileten. d) Monter farvede mørbrad, og så billedet af dendritiske Lysthuset og aksonal fremskrivninger af DA neuron kloner.
Figur 2 Forberedelse af æblejuice agarplade for varme chok. Tag pladen (hvid pil, ab), tilføje en anden petriskål på toppen (rød pil b), og tætning rundt med Parafilm (blå pil, b).
Figur 3 in vivo billede af dendritceller løvhytten af en mCD8:: GFP-mærkede MARCM klon (genotype som i 2,1) svarende til en klasse IV (v'ada) neuron af en 3 rd instar larve. Skala bar er 50μm.
d/3111/3111fig4.jpg "/>
Figur 4 mCD8:: GFP-mærkede MARCM klon af en klasse III neuron (ddaA) farvet med anti-GFP antistof, der viser god morfologi efter vellykket dissektion og fiksering (grøn). De indsatte viser dendritceller nedbrydning (hvide pile) finder sted efter mislykket dissektion og fiksering (magenta). Skala bar er 25μm.
Figur 5 Den 3. instar larver VNC. En FLP-out klon af en enkelt klasse VI (VDAB) Axon Terminus (genotype som i punkt 2.2), påvises ved hjælp af anti-GFP antistof (grøn). Anti-CD2 etiketter alle klasse IV Termini (magenta). Skala bar er 25μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Drosophila Larvetilstand DA neuron model giver en fremragende genetiske system til at undersøge mekanismerne, der styrer neuron morfologi og kredsløb dannelse. MARCM er generelt bruges til mærkning og for at skabe mutant DA neuron kloner. Til MARCM bruger vi enten en pan-neurale (f.eks Gal4 C155) eller DA neuron-specifik driver. Ved hjælp af en pan-neurale driver det er muligt direkte at bruge flere lagre almindeligt tilgængelige fra offentlige lager centre. Men ved hjælp af en DA-neuron specifik driver kan være en fordel, fordi mærket kloner ikke vil blive genereret i CNS, og sådanne kloner kan komplicere analysen af DA axonal endestationer. En liste over almindeligt anvendte DA-specifikke Gal4 linjer kan findes i Shimono et al (2009) 27. FLP-out kan være særligt nyttigt, når efterforskerne ønsker at samtidig ectopically udtrykke et gen ved hjælp af Gal4-UAS binære system 35 og måle morfologi i en enkelt mærket neuron. Ud over de billeddannendeprotokoller, der præsenteres her kan bruges, når DA neuroner er markeret ved hjælp af Gal4-UAS systemet 35 alene.
Hvis en god fluorescerende dissektionsmikroskop ikke er tilgængelig, er det muligt at vælge larve transporterer kloner bruger på en normal fluorescerende mikroskop og et mål med en lang arbejdsdag afstand. Under live-billeder af de dendritceller Arbor (afsnit 6), vi immobilisere larve udelukkende gennem nedadrettet kraft, som dækglasset. I tilpasning af denne protokol til andre formål efterforskerne kan også immobilisere larver gennem anæstesi 36,37.
Under immunohistological farvning, vi generelt bruge anti-GFP eller anti-CD8 til mærkning af neuron. I FLP-out eksperimenter anti-CD2 kan desuden markere alle neuroner i hvilken Gal4 føreren anvendte linie er aktiv (Fig. 5). Ved behandlingen af DA Axon terminaler i VNC, kan anti-Fasciclin2 antistof mærkning være at bruges til at fremhæve skelsættende Axon skrifter 7,22,38.
32. Endvidere vil DA neuron dendritter, især dem af klasse III og klasse IV, nedbrydes hurtigt efter begyndelsen af dissektion. Vi foreslår, dissekere og fastsættelse larve individuelt. Fiksering skal ske inden 5mins at indlede dissektion at sikre en god vedligeholdelse af dendritceller morfologi. Endelig vil montering larver så flad som muligt i høj grad støtte efterfølgende morfometriske analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne takker Riken til finansiering. Vi takker også Cagri Yalgin, Caroline Delandre, og Jay Parrish til diskussioner om genetiske og immunhistokemi protokoller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZX16 fluorescence dissection microscope (with GFPHQ filter) | Olympus Corporation | SZX16 | |
| Live Insect Forceps | Fine Science Tools | 26030-10 | |
| 26mm x 76mm depression slide glass | Toshinriko Co. | T8-R004 | |
| Sylgard 184 (or Silpot 184) | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1524 | This product has proven most effective |
| DPX mounting medium | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Rabbit anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-CD8 | Caltag | 5H10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-CD2 | AbD Serotec | MCA443R | Dilution 1:700 |
| Mouse anti-Fasciclin2 | DSHB | 1D4 | Dilution 1:10 |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315, 232-242 (2008).
- Hattori, Y., Sugimura, K., Uemura, T. Selective expression of Knot/Collier, a transcriptional regulator of the EBF/Olf-1 family, endows the Drosophila sensory system with neuronal class-specific elaborated dendritic patterns. Genes Cells. 12, 1011-1022 (2007).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43, 809-822 (2004).
- Li, W., Wang, F., Menut, L., Gao, F. B. BTB/POZ-zinc finger protein abrupt suppresses dendritic branching in a neuronal subtype-specific and dosage-dependent. 43, 823-834 (2004).
- Zlatic, M., Landgraf, M., Bate, M. Genetic specification of axonal arbors: atonal regulates robo3 to position terminal branches in the Drosophila nervous system. Neuron. 37, 41-51 (2003).
- Grueber, W. B., Ye, B., Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Dendrites of distinct classes of Drosophila sensory neurons show different capacities for homotypic repulsion. Curr Biol. 13, 618-626 (2003).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112, 805-818 (2003).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Moore, A. W. Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology. Cell Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol. Cell. Neurosci. 35, 383-396 (2007).
- Nishimura, Y. Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model. J Neurogenet. 24, 194-206 (2010).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 5199-5204 (2007).
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19, 799-806 (2009).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (1), e85-e85 (2006).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Merritt, D. J., Whitington, P. M. Central projections of sensory neurons in the Drosophila embryo correlate with sensory modality, soma position, and proneural gene function. J Neurosci. 15, 1755-1767 (1995).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Wong, A. M., Wang, J. W., Axel, R. Spatial representation of the glomerular map in the Drosophila protocerebrum. Cell. 109, 229-241 (2002).
- Shimono, K. Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death. Neural Dev. 4, 37-37 (2009).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Kaczynski, T. J., Gunawardena, S. Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (46), e2150-e2150 (2010).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. J Vis Exp. , (2009).
- Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster. Genetics. 172, 2325-2335 (2006).
- Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress. J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sugimura, K. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
- Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites. Dev Biol. 260, 207-225 (2003).
