Summary
के वृक्ष के समान द्रुमायण संवेदी न्यूरॉन्स
Protocol
अभिकर्मकों के 1.Preparation
- Ca + मुक्त HL3.1 28 खारा तैयार करें .
- मिमी में: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 sucrose, और 5 Trehalose, 7.2 पीएच. बाँझ फ़िल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस
नोट: Ca + + मुक्त समाधान विच्छेदन के दौरान मांसपेशियों में संकुचन रोकता है .
- मिमी में: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 sucrose, और 5 Trehalose, 7.2 पीएच. बाँझ फ़िल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस
- पाली एल lysine (पीएलएल) coverslips बनाओ.
- 4.2ml पानी में 100mg PLL भंग और -20 डिग्री सेल्सियस पर Eppendorf ट्यूबों और फ्रीज में 300μl aliquots
- इससे पहले कि कोटिंग coverslips, पहली पिघलना एक विभाज्य, इसे लाने DDH 2 हे में 10ml और फोटो फ़्लो कोडक के 20μl जोड़ने, अंतिम PLL एकाग्रता 0.7 मिलीग्राम / एमएल है.
- 30mins PLL के समाधान में डूब coverslips को हटाने, और शुष्क है, तो पानी और सूखी के साथ संक्षिप्त कुल्ला. दो बार दोहराएँ. इलाज coverslips पिछले लगभग एक महीने.
2. जेनेटिक पार
- टीओ MARCM क्लोन उत्पन्न. यहाँ एक उदाहरण एक पैन डीए 11,27 ड्राइवर का उपयोग कर पार है:
एक्स FRT2A hsFLP; Gal4 (2) 80 109, यूएएस mCD8: GFP, Gal80 - FRT2A/SM5-TM6B टब - FLP-बाहर क्लोन उत्पन्न. यहाँ एक उदाहरण चतुर्थ श्रेणी विशिष्ट-8 ड्राइवर का उपयोग कर पार है:
एक्स ppk - Gal4 YW, hsFLP, यूएएस FRT - CD2, y + बंद FRT - mCD8: GFP
3. भ्रूण के संग्रह
- एक संग्रह की बोतल में 25 ड्रोसोफिला पार रखें डिग्री सेल्सियस और खमीर 30,31 पेस्ट की एक पतली परत के साथ एक सेब का रस अगर प्लेट 29 प्रसार पर भ्रूण इकट्ठा.
4. हीट भ्रूण के सदमे उपचार
- सेब का रस अगर प्लेट पर जो भ्रूण रखे गए हैं के विरोध में एक खाली प्लेट रखें. Parafilm (छवि 2) के साथ इन दो प्लेटों के आसपास सील.
- गर्मी झटका दौरान डूब वेंपानी के स्नान में ई थाली और इसे नीचे पकड़ एक धातु वजन का उपयोग.
- MARCM भ्रूण के लिए
- 2 के लिए भ्रूण लीजिए और एक 10cm पेट्री द्वारा घिरे डिश में सेते 25 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 2 के लिए ऊतकों सिक्त.
नोट: गर्मी झटका प्रोटोकॉल समायोजित आवृत्ति, जिस पर क्लोन उत्पन्न कर रहे हैं बदल. - क्लोनों की एक छोटी संख्या 38 पर पृथक न्यूरॉन्स, डूब और 1 के लिए पानी के स्नान में गर्मी झटका लिए लक्ष्य डिग्री सेल्सियस के लिए
- क्लोनों की एक बड़ी संख्या के लिए 45mins के लिए 38 में गर्मी झटका डिग्री सेल्सियस, आरटी 30mins, तब गर्मी सदमे में फिर से ठीक एक अतिरिक्त 30mins के लिए.
- 2 के लिए भ्रूण लीजिए और एक 10cm पेट्री द्वारा घिरे डिश में सेते 25 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 2 के लिए ऊतकों सिक्त.
- FLP 24 घंटों के लिए भ्रूण लीजिए, और 1 के लिए 38 में गर्मी झटका डिग्री सेल्सियस
5. क्लोन के लिए स्क्रीनिंग
- गर्मी झटका के बाद, पानी तंग व्यवस्था के ढक्कन को हटा दें और सेब का रस सिक्त ऊतकों से घिरा एक 10cm पेट्री डिश में अगर थाली जगह. घूमना जब तक संस्कृति और 25 में बाद लार्वा ° सी भ्रूणआईएनजी 3 Rd instar.
नोट: संस्कृति की स्थिति, विशेष रूप से पोषण, डीए वृक्ष के समान कुंज 32,33 आकारिकी को बदल दिखाया गया है. यकीन है कि बढ़ती लार्वा सभी समय पर खमीर पेस्ट करने के लिए पहुँच है, निगरानी और पेस्ट के रूप में आवश्यक खमीर की भरपाई. - प्रोटोकॉल बाद में इस बिंदु से, धीरे कीट संदंश का उपयोग लार्वा हेरफेर.
- संक्षेप में और धीरे से नल के पानी में लार्वा, कुल्ला और फिर एक अगर थाली पर जगह है.
नोट: यह कदम भोजन या लार्वा सतह पर गंदगी से ऑटो प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि कम कर देता है. - एक शक्तिशाली प्रतिदीप्ति विदारक माइक्रोस्कोप के तहत लार्वा की जांच करना. GFP-सकारात्मक शरीर दीवार में न्यूरॉन्स / कोशिकाओं के साथ लार्वा को पहचानें.
6 में dendrites के vivo इमेजिंग
- 80% ग्लिसरॉल की एक छोटी सी बूंद के साथ एक अवसाद स्लाइड गिलास में लार्वा रखें. स्लाइड पर एक coverslip प्लेस लार्वा स्थिर. सुनिश्चित करें कि कोई हवा लार्वा और coversli के बीच रहता हैपी.
- धीरे coverslip पुश करने के लिए लार्वा रोल करने के लिए ब्याज के न्यूरॉन के दृश्य की अनुमति. छवि mCD8: GFP confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से वृक्ष के समान लेबल कुंज.
7. लारवल विच्छेदन
शुरुआत से पहले नोट: डीए न्यूरॉन dendrites विच्छेदन के दीक्षा के बाद तेजी से नीचा . 5min कम से कम में प्रत्येक व्यक्ति लार्वा काटना के लिए अच्छा dendrite आकारिकी सुनिश्चित है.
- Sylgard थाली के रूप में निम्नलिखित संशोधनों के साथ 34 पहले से वर्णित पर 3 Rd instar लार्वा भटक काटना:
- डीए न्यूरॉन अक्षतंतु टर्मिनी की इमेजिंग के लिए सुनिश्चित करें, कि सीएनएस बरकरार है और कमानी नसों नहीं टूट रहे हैं. लार्वा खोलने के बाद, पहली बार ध्यान से शरीर दीवार को सांस की नली कनेक्शन काट और फिर धीरे पूरे पेट को हटायें.
- इमेजिंग dendrites अगर अकेले, सीएनएस को हटाने के लिए एक चापलूसी बढ़ते की अनुमति.
8. Fixatआयन और लार्वा fillets के अवरुद्ध
- अभी भी Sylgard थाली टिकी लार्वा के साथ, आरटी पर एक धीरे घूर्णन हिलनेवाला पर 20mins के लिए पीबीएस में 4% पीएफए में यह तय है.
- निर्धारण के बाद लार्वा ऊतकों के निशान (वसा शरीर, ट्रेकिआ, आदि) निकालें.
- PBST में Sylgard प्लेट और एक प्रकार के बरतन धो 3x 10mins (0.1% ट्राइटन X-100 के साथ पीबीएस). यदि अक्षतंतु Termini जांच Sylgard थाली पर पट्टिका रखो. (धुंधला dendrites यदि यह संभव है इस 34 कदम पर एक 0.5 मिलीलीटर ट्यूब के लार्वा fillets के हस्तांतरण )
- 5% सामान्य गधा सीरम (एनडीएस) में एक प्रकार के बरतन पर PBST में आरटी पर 20mins के लिए लार्वा ब्लॉक.
9. लार्वा fillets के धुंधला
- अवरुद्ध समाधान और प्राथमिक एंटीबॉडी में सेते 4 बजे रात ° एक छोटे Tupperware कंटेनर से घिरा में सी ऊतकों सिक्त (5 / एनडीएस PBST%) निकालें.
- 4 ° C से ट्यूबों निकालें और आरटी पर एक अतिरिक्त घंटे सेते हैं.
- PBST में 6x 10mins धो लें. माध्यमिक antib जोड़ेंody (5% / एनडीएस PBST), और कवर fluorophore तस्वीर विरंजन 34 को रोकने के लिए.
- आरटी पर दो घंटे के लिए या तो सेते हैं या रात 4 बजे डिग्री सेल्सियस आरटी में एक घंटे के द्वारा पीछा किया.
- PBST में लार्वा 6x 10mins धो और बढ़ते के लिए आगे बढ़ना.
10. Dendrite कुंज की परीक्षा के लिए लार्वा fillets के बढ़ते
- प्रत्येक लार्वा के रूप में के रूप में फ्लैट पट्टिका संभव विदारक कैंची या एक स्केलपेल के लिए रवाना सिर, (मुंह हुक सहित) और (spiracles सहित) पीछे 34 में कटौती का उपयोग कर माउंट.
- स्लाइड नीचे छल्ली साइड पर लार्वा पट्टिका प्लेस, 80% ग्लिसरॉल में माउंट, और एक 'जल्दी' 34 माउंट के लिए नेल पॉलिश के साथ coverslip के पक्ष सील .
- एक स्थायी बढ़ते और एक स्पष्ट छवि के लिए
- Dissected लार्वा पट्टिका मांसपेशियों की ओर एक PLL coverslip पर पीबीएस की एक बूंद पर नीचे प्लेस, यह जल्दी coverslip करने के लिए पालन करना होगा.
- , Howeve बढ़ते के बाद संभव के रूप में ज्यादा तरल के रूप में निकालेंr यह पूरी तरह से सूखे करने के लिए अनुमति नहीं देते.
- 35% इथेनॉल, 50%, 70%, 95%, और अंत में 2x 100% इथेनॉल प्रत्येक 10 मिनट के लिए (2 100% EtOH समाधान अक्सर बदल किया जाना चाहिए द्वारा पीछा किया: (संलग्न लार्वा पट्टिका के साथ) एक श्रृंखला के माध्यम से इथेनॉल coverslip ले लो ), अंत में, Xylene में 2-3x 10mins धो.
- एक साफ स्लाइड पर DPX mountant (Distyrene plasticizer Xylene) की एक बूंद रखो और ध्यान से शीर्ष पर coverslip पट्टिका के पक्ष नीचे रखना . अंधेरे में रखें, और DPX के लिए एक दिन इंतजार इमेजिंग पहले सेट.
11. अक्षतंतु टर्मिनी की परीक्षा के लिए लार्वा fillets के बढ़ते
- कमानी नसों विच्छेदन निर्धारण के दौरान बरकरार पीएन और CNS के बीच चल रहा है, और परिधीय संवेदी न्यूरॉन सेल शरीर से VNC के axons की अनुरेखण की अनुमति धुंधला रखें.
- प्रत्येक लार्वा पट्टिका छल्ली साइड नीचे एक अवसाद स्लाइड में 80% ग्लिसरॉल में माउंट. डीए सेल शरीर से axons ट्रेसConfocal सूक्ष्मदर्शी के तहत VNC. नोट: प्रत्येक शरीर दीवार खंड परियोजना में VNC के आत्मीय खंड पीएन न्यूरॉन्स.
12. प्रतिनिधि परिणाम:
प्रतिनिधि परिणाम 3-5 के आंकड़े में दिखाया गया है. चित्र 3 चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन, vivo में कब्जा कर लिया confocal सूक्ष्मदर्शी के तहत पूरे कुंज से पता चलता है. चित्र 4 एक immunohistochemically लेबल तीसरी श्रेणी न्यूरॉन dendrite कुंज के भाग के करीब है कि सही ढंग से किया गया है आकारिकी के संरक्षण के लिए तय पता चलता है. इनसेट जुड़े गिरावट है कि एक असफल और (विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ दोनों दाग) निर्धारण विच्छेदन के बाद हो सकता है दिखाता है. चित्र 5 CNS में एक एकल चतुर्थ श्रेणी अक्षतंतु टर्मिनस (विरोधी GFP, हरा) से पता चलता है, सभी वर्ग चतुर्थ Termini विरोधी CD2 (मैजंटा) के साथ सह दाग.
चित्रा 1 प्रोटोकॉल सिंहावलोकन. क) लीजिए और फिर गर्मी झटका भ्रूण. ख) एक GFP सकारात्मक डीए न्यूरॉन क्लोन के साथ एक लार्वा, और तब छवि रहते लार्वा में GFP लेबल dendrite कुंज का चयन करें. ग) लार्वा टुकड़े करना, और तब पट्टिका immunohistochemically दाग. घ) दाग पट्टिका पर्वत, और फिर वृक्ष के समान कुंज और डीए न्यूरॉन क्लोन के axonal अनुमानों की छवि.
गर्मी सदमे के लिए सेब का रस अगर थाली के 2 तैयार चित्रा. प्लेट (सफेद तीर, अब) ले लो करने के लिए, शीर्ष (लाल तीर ख) पर एक दूसरे पेट्री डिश जोड़ने और Parafilm (नीले तीर, ख) के साथ चारों ओर सील.
MCD8 एक dendrite कुंज के vivo छवि में चित्रा 3:: GFP लेबल MARCM (2.1 के रूप में जीनोटाइप) क्लोन एक वर्ग चतुर्थ (v'ada) 3 Rd instar लार्वा के न्यूरॉन का प्रतिनिधित्व. स्केल बार 50μm है.
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चित्रा 4 mCD8: GFP लेबल एक वर्ग III (ddaA) न्यूरॉन विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ दाग सफल विच्छेदन और स्थिरीकरण (हरा) के बाद अच्छा आकारिकी दिखाने के MARCM क्लोन . इनसेट से पता चलता है dendrite (सफेद तीर) गिरावट के बाद असफल विच्छेदन और स्थिरीकरण (मैजंटा) होने वाली है. स्केल बार 25μm है.
5 चित्रा 3 Rd instar लार्वा VNC. FLP बाहर एक छठी कक्षा (vdaB) अक्षतंतु टर्मिनस (2.2 के रूप में जीनोटाइप) का एक क्लोन विरोधी GFP एंटीबॉडी (हरा) का उपयोग करने के लिए पता चला है. विरोधी CD2 सभी चतुर्थ श्रेणी टर्मिनी (मैजंटा) लेबल. स्केल बार 25μm है.
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Discussion
ड्रोसोफिला लार्वा डीए न्यूरॉन मॉडल एक उत्कृष्ट आनुवंशिक तंत्र की जांच प्रणाली प्रदान करता है कि नियंत्रण न्यूरॉन आकारिकी और सर्किट गठन. MARCM लेबलिंग के लिए और उत्परिवर्ती डीए न्यूरॉन क्लोन पैदा करने के लिए आम तौर पर प्रयोग किया जाता है. MARCM के लिए हम या तो एक (Gal4 C155 जैसे) अखिल तंत्रिका या महंगाई भत्ते न्यूरॉन विशिष्ट ड्राइवर का उपयोग करें. अखिल तंत्रिका चालक का प्रयोग सीधे कई सार्वजनिक शेयर केन्द्रों से व्यापक रूप से उपलब्ध शेयरों का उपयोग करने के लिए संभव है. हालांकि महंगाई भत्ते न्यूरॉन विशिष्ट चालक का उपयोग लाभप्रद हो सकता है क्योंकि चिह्नित क्लोन सीएनएस में उत्पन्न नहीं होगा, और इस तरह के क्लोन डीए axonal Termini के विश्लेषण जटिल हो सकता है हो सकता है. आमतौर पर इस्तेमाल किया डीए विशेष Gal4 लाइनों की एक सूची शिमोनो एट अल (2009) 27 में पाया जा सकता है. Flp बाहर विशेष रूप से उपयोगी है जब जांचकर्ताओं के लिए समन्वित रूप से ectopically एक एकल लेबल न्यूरॉन में एक द्विआधारी Gal4 यूएएस 35 प्रणाली और उपाय आकारिकी का उपयोग जीन व्यक्त करना चाहते हो सकता है. इमेजिंग के अलावायहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल जब डीए न्यूरॉन्स Gal4 - यूएएस प्रणाली 35 का उपयोग कर चिह्नित कर रहे हैं अकेले इस्तेमाल किया जा सकता है.
यदि एक अच्छा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन विदारक अनुपलब्ध है, यह एक सामान्य फ्लोरोसेंट खुर्दबीन और एक लंबे समय तक काम दूरी के साथ एक उद्देश्य पर क्लोन का उपयोग कर ले जाने के लार्वा का चयन करने के लिए संभव है. (धारा 6) dendrite कुंज के रहते इमेजिंग के दौरान हम नीचे coverslip द्वारा exerted बल के माध्यम से पूरी तरह लार्वा स्थिर. अन्य उपयोगों के जांचकर्ताओं के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन में भी 36,37 संज्ञाहरण के माध्यम से लार्वा को स्थिर कर सकते हैं.
Immunohistological धुंधला के दौरान, हम आम तौर पर न्यूरॉन लेबलिंग के लिए विरोधी GFP या विरोधी CD8 का उपयोग. में FLP प्रयोगों विरोधी CD2 अतिरिक्त सभी न्यूरॉन्स Gal4 चालक लाइन का इस्तेमाल किया जिसमें सक्रिय है (छवि 5) को चिह्नित कर सकते हैं. जब VNC में डीए अक्षतंतु टर्मिनलों की जांच, विरोधी Fasciclin2 एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए मील का पत्थर अक्षतंतु इलाकों उजागर 7,22,38 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
न्यूरॉन 32 आकारिकी बदल सकते हैं . इसके अलावा, डीए न्यूरॉन dendrites, विशेष रूप से उन वर्ग III और चतुर्थ श्रेणी के विच्छेदन की शुरुआत के बाद तेजी से नीचा दिखाना होगा. हम विदारक और सुझाव लार्वा व्यक्तिगत फिक्सिंग. फिक्सेशन शुरुआत विच्छेदन के 5mins के भीतर हो dendrite आकारिकी के अच्छे रखरखाव सुनिश्चित करना चाहिए. अंत में, के रूप में संभव के रूप में फ्लैट लार्वा बढ़ते बहुत बाद morphometric विश्लेषण में सहायता करेगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के वित्तपोषण के लिए आरआईकेईएन धन्यवाद. हम भी आनुवंशिक और immunohistochemistry प्रोटोकॉल पर चर्चा के लिए Cagri Yalgin, कैरोलीन Delandre, और जे Parrish धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZX16 fluorescence dissection microscope (with GFPHQ filter) | Olympus Corporation | SZX16 | |
| Live Insect Forceps | Fine Science Tools | 26030-10 | |
| 26mm x 76mm depression slide glass | Toshinriko Co. | T8-R004 | |
| Sylgard 184 (or Silpot 184) | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1524 | This product has proven most effective |
| DPX mounting medium | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Rabbit anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-CD8 | Caltag | 5H10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-CD2 | AbD Serotec | MCA443R | Dilution 1:700 |
| Mouse anti-Fasciclin2 | DSHB | 1D4 | Dilution 1:10 |
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