Summary
의 돌기 arborization 감각 뉴런
Abstract
신경 시스템 개발은 정확한 신경 클래스 특정 돌기 개발 및 axonal 배선 다음 신경 세포의 위치와 정체성의 정확한 사양을 필요로합니다. 최근 Drosophila 애벌레 말초 신경계 (PNS)의 돌기 arborization (DA) 감각 뉴런은 신경 세포의 분화 모두 일반 클래스 구체적인 메커니즘을 명료하게하다하는 강력한 유전자 모델이되고 있습니다. 네 가지 주요 DA 신경 세포 클래스 (I - IV) 1이 있습니다. 그들은 증가 dendrite 아버 복잡한 순서에 따라 이름이, 그들의 분화 20-10의 유전자 컨트롤에 클래스 구체적인 차이점을 가지고 있습니다. 1) 그것이 검찰 신경 dendrite 아버가 확산 과일 파리에서 사용할 수있는 강력한 유전자 도구, 2)를 활용할 수 있기 때문에 검찰 감각 시스템은 돌기 형태 11-13의 통제 뒤에 분자 메커니즘을 조사하기 위해 실용적인 모델입니다 광학 CLE 아래에 단지 2 차원에AR 애벌레의 표피)는 쉽게 생체내, 3 고해상도로 시각화하고 있습니다 돌기 형태의 클래스 특정 다양성)은 단순한 대 고도로 분지 돌기 나무의 형성을 제어하는 핵심 요소를 찾을 수 비교 분석을 용이하게, 4 틀에 박힌 돌기 아버 다른 검찰 뉴런의 모양은 morphometric 통계 분석을 용이하게합니다.
DA 신경 세포 활동 애벌레 운동 중앙 패턴 발생기 14-16의 출력을 수정합니다. 다른 신경 세포 DA 수업은 독특한 감각 modalities를 가지고 있고, 자신의 정품 인증 14,16-20 다른 행동 반응을 elicits. 또한 다른 클래스는 복부 신경 코드에 Drosophila 애벌레 중추 신경계 (VNC) 21에 stereotypically axonal 전망을 보낼 수 있습니다. 이러한 예측은 돌기 분야 7,22의 본문 벽에 DA 뉴런 감각 양상과 위치를 모두 지형 표현과 종료, 23. DA axonal 추정치 그래서 시험은 지형 매핑 7,22,23뿐만 아니라, 간단한 회로 modulating 애벌레의 운동 14-17의 배선을 기본 메커니즘을 명료하게하다하는 데 사용할 수 있습니다.
우리는 여기서 MARCM (Repressible 세포 마커와 함께 모자이크 분석) 1,10,25과 Flp 아웃 22,26,27 기술 (그림 1.에 요약)를 통해 24 마킹 검찰의 뉴런을 생성하고 유전자 모자이크를 분석하는 실용적인 가이드를 제시한다.
Protocol
시약의 1.Preparation
- 칼슘 + + 무료 HL3.1 식염수 28 준비합니다.
- MM 년 : 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 자당, 5 trehalose, 산도 7.2. 소독 필터와 4 저장 ° C.
참고 : 칼슘 + + 무료 솔루션 해부하는 동안 근육 수축을 방지합니다.
- MM 년 : 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 자당, 5 trehalose, 산도 7.2. 소독 필터와 4 저장 ° C.
- 폴리 - L - 라이신 (PLL) coverslips하십시오.
- -20 ° C.에 4.2ml 물에 100mg PLL을 해산하고 Eppendorf 튜브 및 동결에 300μl aliquots을
- 코팅 coverslips 먼저 해동 나누어지는가 ddH 2 O에서 10ml로 불러 및 코닥 포토 플로의 20μl를 추가하기 전에, 마지막 PLL 농도는 0.7 MG / ML입니다.
- PLL 솔루션에서 30 분에 대한 잠수함의 coverslips은 제거하고 건조 후 물, 건조와 함께 간략하게 린스. 두 번 반복합니다. 치료 coverslips 지난 약 달.
2. 유전 십자가
- 티O는 MARCM의 클론을 생성합니다. 여기 팬 - DA 드라이버 11,27을 사용하여 예제 교차은 다음과 같습니다 :
FRT2A X hsFLP; Gal4 109 (2) 80, UAS - mCD8 : GFP, 욕조 - Gal80 FRT2A/SM5-TM6B - 클론을 Flp 아웃 생성합니다. 여기 클래스 IV - 특정 드라이버 8을 사용 예제 교차은 다음과 같습니다 :
PPK - Gal4 X yw, hsFLP, UAS - FRT - CD2, Y + - 중지 - FRT - mCD8 : : GFP
3. 배아의 수집
- 25 수집 병에 Drosophila의 십자가 유지 ° C와 효모 붙여넣기 30,31의 얇은 레이어와 사과 쥬스 한천 플레이트 29 확산에 배아를 수집합니다.
4. 배아의 열 충격 치료
- 배아가 마련되었습니다되었을 사과 쥬스 한천 플레이트에 반대 빈 접시를 놓습니다. Parafilm (그림 2)와 두 접시 주위에 인감.
- 열충격 동안 잠수함의 일전자 물에 목욕의 판 및 금속 무게를 사용하여 누르십시오.
- MARCM의 배아에 대한
- 2 시간에 대한 배아를 수집하고 둘러싸인 10cm 배양 접시에있는 부화가 추가로 2 시간 25 ° C에서 조직을 moistened.
참고 : 열 충격 프로토콜을 조정하는 것은 클론이 생성되는 빈도를 바꿀지도 모르겠어. - 38에 1 시간을위한 물 목욕의 단일 절연 뉴런, 잠수함 및 열 충격을 목표로 클론의 작은 숫자 ° C.에 대한
- 클론의 큰 번호를, 38에서 45mins에 대한 열 충격 ° C는 추가 30 분 후 다시 RT 30 분, 열 충격에 복구할 수 있습니다.
- 2 시간에 대한 배아를 수집하고 둘러싸인 10cm 배양 접시에있는 부화가 추가로 2 시간 25 ° C에서 조직을 moistened.
- 24 시간에 대한 배아를 Flp 아웃 모으고, 38에서 1 시간에 대한 열 충격 ° C.
5. 클론에 대한 심사
- 열 충격 후, 물을 꽉 배열의 뚜껑을 제거하고 moistened 조직으로 둘러싸인 10cm의 배양 접시에있는 사과 주스 한천 플레이트를 배치합니다. 문화 돌아다니다까지 배아 25시 이후의 유충 ° CING 3 층 instar.
참고 : 문화 환경, 특히 영양이 다 돌기 아버의 형태 32,33을 변경 표시되었습니다. 성장하는 애벌레 항상 효모 붙여넣기에 대한 액세스 권한이 있는지 확인, 필요에 따라 붙여 효모를 모니터링하고 보충. - 프로토콜 이후에이 시점에서, 부드럽게 곤충 집게를 사용하여 애벌레를 조작.
- 간단히 부드럽게 수돗물의 애벌레를 린스, 그리고 한천 플레이트에 놓습니다.
참고 :이 단계는 배경 애벌레 표면에 음식이나 먼지로부터 자동 형광을 줄여줍니다. - 강력한 형광 해부 현미경으로 애벌레를 검사합니다. 본문 벽에 GFP - 긍정적인 뉴런 / 세포와 애벌레를 식별합니다.
dendrites 6.에서는 생체내 이미징
- 80 % 글리세롤의 작은 방울로 우울증 슬라이드 유리에 유충을 넣습니다. 유충를 무력화하기 위해 슬라이드에 coverslip 놓으십시오. 공기 유충과 coversli 사이에 남아 없다는 것을 확인P.
- 부드럽게 관심의 신경 세포의 시각화 수 있도록 유충을 롤 coverslip 밀어. 이미지 mCD8 : 공촛점 현미경을 통해 GFP - 라벨이 돌기 아버.
7. 애벌레 해부
시작하기 전에 참고 : DA 신경 세포의 dendrites는 절개의 개시 이후 급격히 저하. 좋은 dendrite의 형태를 보장하기 위해 5 분 미만으로 각각의 유충을 해부하다.
- 다음과 같은 수정 이전 34 설명된대로 Sylgard 접시에 3 층 instar의 애벌레를 헤매고 해부하다 :
- DA 신경 세포 축삭 테르의 이미징 들어, CNS는 그대로이고 segmental 신경이 깨진되지 않도록. 애벌레를 연 후, 먼저 조심스럽게 몸 벽에 tracheal 연결을 절단하고 부드럽게 전체 창자를 제거합니다.
- 혼자 이미징 dendrites 경우, 아첨이 장착 있도록 CNS를 제거합니다.
8. Fixat애벌레 필레의 이온과 차단
- 여전히 Sylgard 판에 고정된 유충으로 부드럽게 회전 흔드는에서 RT에서 20mins 위해 PBS에 4퍼센트 PFA에서 문제를 해결.
- 고정 후 애벌레 조직의 성분 (지방 몸, 기관 등)를 제거합니다.
- Sylgard 접시와 뿌리에 3 배 상업 중심지 (0.1 % 트리톤 X - 100 PBS)를 PBST로 씻으십시오. 축삭의 테르를 검사하면, Sylgard 판에 필렛을 유지. (얼룩의 dendrites 경우이 단계 34에서 0.5 ML 관에 애벌레 필레을 전송 가능합니다)
- 뿌리에 PBST에 5퍼센트 정상 당나귀 혈청 (NDS)에 RT에서 20mins에 대한 애벌레를 차단합니다.
9. 애벌레 필레의 염색법
- 차 항체에 차단 솔루션과 부화를 둘러싸인 작은 파티 간다 구 컨테이너에 ° C가 조직을 moistened 4 박 (NDS / PBST 5 %)를 제거합니다.
- 4 ° C에서 튜브를 제거하고 RT에서 추가 시간을 품다.
- PBST에서 배의 상업 중심지 씻으십시오. 보조 antib 추가ody은 (5 %에서 NDS / PBST) 및 커버 형광단 사진 - 표백 34 방지할 수 있습니다.
- 두 시간 동안 RT에서 부화하거나, 또는 야간 4 ° C RT에서 한 시간 따라갔다.
- PBST에서 애벌레 배의 상업 중심지를 씻어 및 장착을 참조하십시오.
10. dendrite 아버의 시험 애벌레 필레의 마운트
- 해부 가위 또는 머리 (입 후크 포함), 34 (spiracles 포함) 뒷부분을 차단하기 위해 메스를 사용하여 가능한 한 평면 각 애벌레 필릿를 탑재합니다.
- 슬라이드 아래 표피 사이드에있는 애벌레 필릿를 놓고, 80 % 글리세롤에 마운트하고, '빠른'마운트 34에 대한 매니큐어로 coverslip의 측면을 봉쇄.
- 영구 장착하고 명확한 이미지
- PLL의 coverslip에 PBS의 드롭에 해부 애벌레 등심 근육 쪽을 아래로 놓고 빨리 coverslip을 준수합니다.
- howeve, 장착 후 가능한 한 많은 액체로 제거R은 완전히 건조하는 것을 허용하지 않습니다.
- 35 % 에탄올, 50 % 70 %, 95 %, 각 10 분 (2 백퍼센트 EtOH 솔루션 자주 변경해야 결국 2X 100 % 에탄올 다음 : 에탄올 시리즈를 통해 coverslip을 (첨부 애벌레 등심)를 타고 ) 결국, 크실렌의 2 배 상업 중심지를 씻는다.
- 깨끗한 슬라이드 DPX mountant (Distyrene의 가소제의 크실렌)의 방울을 넣고 조심스럽게 위에 등심 쪽 다운 coverslip을 믿는다. 어둠 속에서 계속 및 이미징하기 전에 설정하는 DPX 한 하루를 기다립니다.
11. 축삭 테르의 시험 애벌레 필레의 마운트
- segmental 신경 해부, 고정 기간 동안 그대로 PNS와 CNS 간의 실행 그리고 주변 감각 신경 세포 본체에서 VNC로 axons의 추적 수 있도록 염색법 유지.
- 우울증 슬라이드에 80 % 글리세롤의 각 애벌레 등심 표피 쪽을 탑재합니다. DA 세포 본체에서에 axons를 추적공촛점 현미경으로 VNC. 참고 : VNC의 기원 세그먼트에 각 바디 벽 세그먼트 프로젝트에 PNS의 신경.
12. 대표 결과 :
대표 결과는 수치 3-5에 표시됩니다. 그림. 3 공촛점 현미경 생체내에서 캡처한 클래스 IV DA 신경 세포의 전체 아버를 보여줍니다. 그림. 4 제대로 형태를 보존하기 위해 수정되었습니다 immunohistochemically 분류 클래스 III 신경 세포의 dendrite 아버의 일부까지 가까이를 보여줍니다. 관련 삽입은 (안티 GFP 항체와 함께 모두 스테인드) 실패 절개 및 고정 후 발생할 수있는 저하를 보여줍니다. 그림. 5 CNS의 단일 클래스 IV 축삭 말단 (안티 - GFP, 녹색)을 보여줍니다, 모든 클래스 IV의 테르는 반 CD2 (마젠타)와 공동으로 얼룩진 있습니다.
한 프로토콜 개요를 그림. A) 수집 후 열 충격 배아. B) 라이브 유충에 다음 GFP 양성 DA 신경 세포 복제와 유충 및 이미지 GFP - 라벨 dendrite 아버을 선택합니다. C) 유충을 해부하다, 그리고 immunohistochemically 등심을 얼룩. D) 스테인드 필릿를 탑재하고 이미지를 돌기 아버과 DA 신경 세포 클론의 axonal 예상합니다.
열 충격에 대한 사과 쥬스 한천 플레이트 2 준비 그림. 접시 (흰색 화살표, AB)를 타고, (빨간색 화살표 B) 위에 두 번째 페트리 접시를 추가하고 Parafilm (파란색 화살표, B)와 주변 인감.
mCD8의 dendrite 아버의 생체내 이미지 그림 3 : 제 3 instar의 유충의 클래스 IV (v'ada) 뉴런을 나타내는 GFP - 표시 MARCM 클론 (2.1에서와 같이 유전자형). 스케일 바 50μm이다.
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그림 4 mCD8 : 성공 절개 및 고정 (녹색) 이후 좋은 형태를 보여주는 안티 - GFP 항체 물들일 클래스 III 신경 세포 (ddaA)의 GFP - 표시 MARCM 클론. 실패 해부와 고정 (마젠타) 이후 발생 삽입 보여줍니다 dendrite 저하 (흰색 화살표). 스케일 바 25μm이다.
그림 5 제 3 회 instar 애벌레 VNC. 하나의 클래스 VI (vdaB) 축삭 말단 (2.2에서와 같이 유전자형)의 Flp 아웃 클론은 안티 - GFP 항체 (녹색)를 사용하여 감지됩니다. 안티 - CD2는 모든 클래스 IV 테르 (마젠타)를 표시합니다. 스케일 바 25μm이다.
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Discussion
Drosophila 애벌레 DA 신경 세포 모델은 메커니즘을 조사 한 우수한 유전자 시스템을 제공하는 제어 신경 세포의 형태 및 회로 형성. MARCM은 일반적으로 라벨 및 돌연변이 DA 신경 세포의 클론을 생성하는 데 사용됩니다. MARCM 위해 우리는 두 팬 - 신경 (예 : Gal4 c155) 또는 DA 뉴런 특정 드라이버를 사용합니다. 팬 - 신경 드라이버를 사용하면 직접 공개 주식 센터에서 널리 사용되는 몇 가지 주식을 사용하는 것이 가능합니다. 표시된 클론이 CNS에서 생성되지 않습니다, 그리고 클론이 검찰 axonal 테르의 분석을 복잡 수 있기 때문에 그러나 DA - 뉴런 특정 드라이버를 사용하면 유리한 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 DA - 특정 Gal4 라인의 목록은 시모노 외 (2009) 27에서 찾을 수 있습니다. Flp 아웃은 조사단이 concomitantly ectopically 단일 레이블 신경 세포에있는 Gal4 - UAS 바이너리 시스템 35 측정 형태를 사용하여 유전자를 표현하고자 할 때 특히 유용할 수 있습니다. 또한 이미징에게 있음DA의 뉴런이 혼자 Gal4 - UAS 시스템에게 35을 사용하여 표시하는 경우 여기에 제시 프로토콜은 사용할 수 있습니다.
좋은 형광 해부 현미경을 사용할 수있다면, 그것은 긴 작동 거리와 일반 형광 현미경과 목적에 사용하는 클론을 들고 유충을 선택할 수 있습니다. dendrite 아버의 라이브 이미징하는 동안 (섹션 6) 우리는 전적으로 coverslip에 의해 끼쳤다 아래 강제를 통해 유충을 고정. 다른 사용의 수사에 대해이 프로토콜의 적응도 마취 36,37 통해 애벌레를 무력화 할 수 있습니다.
immunohistological 얼룩 동안, 우리는 일반적으로 신경 세포를 라벨에 대한 안티 GFP 또는 방지 CD8을 사용합니다. 에서 Flp 아웃 안티 CD2는 또한 사용 Gal4 드라이버 라인 (그림 5)이 활성화되어있는 모든 뉴런을 표시할 수 있습니다 실험. VNC의 DA 축삭 단말기를 검사하면, 안티 Fasciclin2 항체 라벨은 획기적인 축삭의 책자에게 7,22,38를 강조하는 데 사용 될 수 있습니다.
32 변경할 수 있습니다. 또한, 특히 DA 신경 세포의 dendrites, 클래스 III 및 IV의 클래스들은, 해부의 시작 이후 급속하게 저하됩니다. 우리는 해부 개별적으로 유충을 고정하는 것이 좋습니다. 고정가 dendrite 형태를 잘 유지 보수를 위해 시작 해부의 5mins 이내에 발생한다. 마지막으로, 가능한 한 평면 애벌레를 장착하면 크게 후속 morphometric 분석을 지원합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 자금에 대한 RIKEN 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 유전과 immunohistochemistry 프로토콜에 대한 토론 Cagri Yalgin, 캐롤라인 Delandre, 그리고 제이 패리쉬 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZX16 fluorescence dissection microscope (with GFPHQ filter) | Olympus Corporation | SZX16 | |
| Live Insect Forceps | Fine Science Tools | 26030-10 | |
| 26mm x 76mm depression slide glass | Toshinriko Co. | T8-R004 | |
| Sylgard 184 (or Silpot 184) | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1524 | This product has proven most effective |
| DPX mounting medium | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Rabbit anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-CD8 | Caltag | 5H10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-CD2 | AbD Serotec | MCA443R | Dilution 1:700 |
| Mouse anti-Fasciclin2 | DSHB | 1D4 | Dilution 1:10 |
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