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Neuroscience

Análisis morfológico de Drosophila Larvas dendritas neurona sensorial periférica y axones Con mosaicos genéticos

doi: 10.3791/3111 Published: November 7, 2011

Summary

Arborización dendrítica de las neuronas sensoriales de la

Abstract

Desarrollo del sistema nervioso requiere de la especificación correcta de la posición de la neurona y de la identidad, seguido por el desarrollo neuronal dendríticas precisa específicos de la clase y el cableado axonal. Recientemente, la arborización dendrítica (DA), las neuronas sensoriales del sistema Drosophila larvas nervioso periférico (SNP) se han convertido en poderosos modelos de genética en la que para dilucidar los mecanismos generales y específicos de la clase de diferenciación de las neuronas. Hay cuatro clases principales de neuronas DA (I-IV) 1. Se nombran en orden creciente de complejidad dendrita cenador, y que clase de diferencias específicas en el control genético de la diferenciación de 2.10. El sistema de asimilación sensorial es un modelo práctico para investigar los mecanismos moleculares de control de la morfología dendrítica 11-13 debido a que: 1) se pueden aprovechar las poderosas herramientas genéticas disponibles en la mosca de la fruta, 2) la DA neuronal dendrita cenador se extiende en sólo dos dimensiones por debajo de un culo ópticamentear cutícula larval lo que es fácil de visualizar con alta resolución en vivo, 3) la diversidad específica de la clase en la morfología dendrítica facilita un análisis comparativo para encontrar los elementos clave que controla la formación de los árboles dendríticos muy simple vs ramificada, y 4) dendríticas cenador estereotipadas formas diferentes de neuronas DA facilitar morfométricos análisis estadísticos.

DA actividad neuronal modifica la salida de un generador de patrones de locomoción larvas centrales 14-16. Las diferentes clases de neuronas DA tienen distintas modalidades sensoriales, y su activación provoca diferentes respuestas conductuales 14,16-20. Además diferentes clases enviar proyecciones axonales estereotipada en el sistema nervioso central larvas de Drosophila en el cordón nervioso ventral (VNC) 21. Estas proyecciones terminar con representaciones topográficas de los dos DA modalidad de neurona sensorial y la posición en la pared del cuerpo del campo dendríticas 7,22, De 23 años. Por lo tanto, el examen de las proyecciones de DA axonal puede ser utilizado para dilucidar los mecanismos subyacentes de mapas topográficos 7,22,23, así como el cableado de un circuito simple locomoción de larvas de modulación 14-17.

Presentamos aquí una guía práctica para generar y analizar mosaicos genéticos 24 marcas a través de las neuronas DA MARCM (Análisis de mosaico con un marcador de células reprimibles) 1,10,25 y Flp-out 22,26,27 técnicas (que se resumen en la Fig. 1.).

Protocol

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1.Preparation de reactivos

  1. Prepare Ca + + libre HL3.1 solución salina 28.
    1. En mM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 de MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, sacarosa 115, y trehalosa 5, pH 7,2. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C.
      Nota: Ca + + sin solución impide la contracción muscular durante la disección.
  2. Hacer de poli-L-lisina (PLL) cubreobjetos.
    1. Disolver 100 mg de PLL en el agua 4.2ml y hacer alícuotas 300μl en tubos Eppendorf y se congela a -20 ° C.
    2. Antes de cubreobjetos de recubrimiento, descongelar primero una parte alícuota, traerlo hasta 10 ml en ddH2O y añadir 20μl de Kodak Photo-Flo, la concentración de PLL final es de 0,7 mg / ml.
    3. Cubreobjetos sumergir por 30 minutos en una solución de PLL, eliminar y seco, luego enjuague a fondo con agua y seca. Repita dos veces. Cubreobjetos tratados con una duración aproximada de un mes.

2. Cruces genéticos

  1. To generar clones MARCM. Aquí está una cruz de ejemplo utilizando un controlador de pan-DA 11,27:
    FRT2A x hsFLP; Gal4 109 (2) 80, UAS-mCD8:: GFP, bañera-GAL80 FRT2A/SM5-TM6B
  2. Para generar Flp-out clones. Aquí está una cruz de ejemplo utilizando una clase IV controlador específico 8:
    ppk-Gal4 x yw, hsFLP; UAS-FRT-CD2, y +-stop-FRT-mCD8:: GFP

3. Recolección de los embriones

  1. Mantenga cruza Drosophila en una botella de colección a 25 ° C y recoger los embriones en una placa de agar jugo de manzana 29 se extendió con una fina capa de pasta de levadura 30,31.

4. Tratamiento de choque de calor de los embriones

  1. Coloque un plato vacío en la oposición a la placa de agar de jugo de manzana en la que los embriones se han establecido. Selle alrededor de estas dos placas con Parafilm (Fig. 2).
  2. Durante el choque térmico, se sumergen ªplaca e en el baño de agua y se mantiene presionado con un peso de metal.
  3. Para los embriones MARCM
    1. Recoger los embriones durante 2 e incubar en un plato de petri de 10 cm rodeado por tejidos humedecido a 25 ° C durante 2 horas una adicional.
      Nota: Ajuste del protocolo de choque térmico altera la frecuencia con que se generan clones.
    2. Para un número menor de clones, con el objetivo de una sola neuronas aisladas, sumergirse y golpe de calor en el baño de agua durante 1 hora a 38 ° C.
    3. Para un mayor número de clones, choque térmico de 45 minutos a 38 ° C, a temperatura ambiente 30 minutos recuperarse, luego de choque térmico de nuevo durante otros 30 minutos.
  4. Recoger Flp-los embriones durante 24 horas, y el choque térmico de 1 hora a 38 ° C.

5. La detección de los clones

  1. Después del choque térmico, retire la tapa de la disposición hermético y coloque el jugo de manzana placa de agar en una placa de Petri de 10 cm rodeado por tejidos húmedos. La cultura los embriones y larvas posteriores a 25 ° C hasta que vaganING 3 º estadio.
    Nota: las condiciones de cultivo, en especial la alimentación, se han mostrado alteraciones en la morfología DA dendríticas cenador 32,33. Asegúrese de que las larvas en crecimiento tienen el acceso a la pasta de levadura en todo momento, controlar y reponer la pasta de levadura según sea necesario.
  2. Desde este punto en adelante, en el protocolo, manipular con cuidado las larvas de insecto con unas pinzas.
  3. En pocas palabras y enjuague suavemente las larvas en el agua del grifo, y luego colocar en una placa de agar.
    Nota: Este paso reduce el fondo de autofluorescencia de los alimentos o la suciedad en la superficie de las larvas.
  4. Examinar las larvas bajo un microscopio de fluorescencia de gran alcance de disección. Identificar las larvas con GFP-positivas las neuronas / células en la pared del cuerpo.

6. Imágenes in vivo de las dendritas

  1. Lugar de la larva en un portaobjetos de vidrio depresión con una pequeña gota de un 80% de glicerol. Coloque un cubreobjetos sobre el portaobjetos para inmovilizar la larva. Asegúrese de que no quede aire entre la larva y el coverslip.
  2. Empuje suavemente el cubreobjetos para rodar la larva para permitir la visualización de la neurona de interés. La imagen de la mCD8:: GFP-etiquetados cenador dendríticas a través de microscopía confocal.

7. Disección de las larvas

Tenga en cuenta antes de empezar: las dendritas de neuronas DA se degradan rápidamente después del inicio de la disección. Diseccionar cada larva individual en menos de 5 minutos para asegurar una buena morfología dendrítica.

  1. Diseccionar vagando 3 de larvas en un plato Sylgard como se describió previamente 34 con las siguientes modificaciones:
    1. Para la obtención de imágenes de las neuronas DA axón termini, asegúrese de que el SNC está intacta y los nervios segmentarios no están rotos. Después de la apertura de las larvas, primero corte cuidadosamente las conexiones de la tráquea a la pared del cuerpo y luego retire con cuidado el intestino completo.
    2. Si las dendritas imágenes solo, eliminar el sistema nervioso central para permitir a un plano de montaje.

8. Fixation y el bloqueo de los filetes de larvas

  1. Con la larva sigue clavado en la placa Sylgard, fijarlo en el 4% PFA en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador girar suavemente.
  2. Eliminar los restos de tejidos larvarios (grasa corporal, la tráquea, etc) después de la fijación.
  3. Lave en PBST (PBS con 0,1% Triton X-100) a 10 minutos 3 veces en la placa de Sylgard y agitador. Si el examen de terminales del axón, mantenga el filete en el plato Sylgard. (Si las dendritas tinción es posible la transferencia de los filetes de las larvas a un tubo de 0,5 ml en esta etapa 34)
  4. Bloquear las larvas por 20 minutos a temperatura ambiente en el 5% de suero normal de burro (NDS) en PBST en un agitador.

9. Tinción de los filetes de larvas

  1. Retire la solución de bloqueo y se incuban en anticuerpo primario (en el 5% NDS / PBST) durante la noche a 4 ° C en un pequeño recipiente Tupperware rodeado por tejidos humedecido.
  2. Retire los tubos de 4 ° C e incubar una hora más a temperatura ambiente.
  3. Lavado de 10 minutos 6 veces en PBST. Agregue el antib secundariaody (en el 5% NDS / PBST), y la cubierta para evitar la foto-blanqueo fluoróforo 34.
  4. Incubar ya sea a temperatura ambiente durante dos horas, o durante la noche a 4 ° C, seguida de una hora a temperatura ambiente.
  5. Lave el 10 minutos larvas 6x en PBST y proceder al montaje.

10. Montaje de los filetes de larvas para el examen de la glorieta dendrita

  1. Monte cada filete de larvas lo más plana posible utilizar unas tijeras de disección o un bisturí para cortar la cabeza (incluyendo los ganchos de la boca), y la posterior (incluyendo los espiráculos) 34.
  2. Coloque los filetes de larvas en la diapositiva de la cutícula hacia abajo, monte en el 80% de glicerol, y el sello de los lados del cubreobjeto con esmalte de uñas para un "rápido" de montaje 34.
  3. Para un montaje permanente y una imagen más clara
    1. Coloque el filete de músculo diseccionado larvas hacia abajo en una gota de PBS en un cubreobjetos PLL, rápidamente se adhieren a la cubreobjetos.
    2. Eliminar tanto líquido como sea posible después del montaje, however No deje que se seque por completo.
    3. Tomar el cubreobjetos (con filete de larvas adjunta) a través de una serie de etanol: 35% de etanol, seguido de 50%, 70%, 95% y el 100% de etanol, finalmente 2x cada uno durante 10 minutos (debe ser el segundo al 100% la solución EtOH cambiar con frecuencia ) y, por último, lavar 2-3x 10 minutos en xileno.
    4. Ponga una gota de DPX medio de montaje (xileno Distyrene plastificante) en un portaobjetos limpio y coloque cuidadosamente el cubreobjetos filete hacia abajo en la parte superior. Mantener en la oscuridad, y esperar un día para el DPX para establecer antes de exponer.

11. Montaje de los filetes de larvas para el examen de las terminales del axón

  1. Mantener los nervios segmentarios que corre entre el SNP y el SNC intacto durante la disección, fijación y tinción para permitir la localización de los axones de las células sensoriales periféricas del cuerpo de la neurona VNC.
  2. Monte cada filete de cutícula larval hacia abajo en glicerol al 80% en una diapositiva de la depresión. Rastro de los axones del cuerpo celular de la DAVNC en el microscopio confocal. Nota: las neuronas SNP en cada proyecto el cuerpo segmento de la pared en el segmento de cognado de la VNC.

12. Los resultados representativos:

Los resultados representativos se muestran en las figuras 3-5. Fig. 3 muestra la glorieta completa de una clase IV da la neurona, capturado en vivo bajo el microscopio confocal. Fig. 4 muestra un primer plano de parte de la glorieta dendrita de una neurona inmunohistoquímica etiqueta de clase III que se ha fijado correctamente para preservar la morfología. Los asociados recuadro muestra la degradación que puede ocurrir después de una disección y fijación sin éxito (ambos se tiñeron con anticuerpos anti-GFP). Fig. 5 muestra una sola clase IV terminal axonal en el SNC (anti-GFP, verde), todos los terminales de clase IV son co-teñidas con anti-CD2 (magenta).

Figura 1
Figura 1 Descripción general de Protocolo. a) Recoger y embriones de choque de calor. b) Seleccione una larva con una GFP-positivas las neuronas DA clon, a continuación, la imagen de la GFP-etiquetados dendrita cenador en la larva en vivo. c) Disección de la larva, y luego inmunohistoquímica mancha el filete. d) Monte el filete de colores, y luego la imagen de la glorieta dendríticas y proyecciones axonal de las neuronas DA de los clones.

Figura 2
Figura 2: Preparación de la placa de agar de jugo de manzana para el choque térmico. Tome la placa (flecha blanca, ab), añadir una segunda placa de Petri en la parte superior (rojo flecha B) y el sello alrededor con Parafilm (flecha azul, b).

Figura 3
Figura 3 en la imagen in vivo de la glorieta de una dendrita mCD8:: GFP-etiquetados clon MARCM (genotipo como en 2.1) que representa una clase IV (v'ada) las neuronas de una larva de 3 º estadio. Barra de escala es 50 micras.

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Figura 4 mCD8:: GFP-etiquetados MARCM clon de una neurona de clase III (ddaA) teñidas con anticuerpos anti-GFP, mostrando la morfología buen éxito después de la disección y fijación (verde). El recuadro muestra la degradación de las dendritas (flechas blancas) que ocurren después de la disección y fijación sin éxito (magenta). Barra de escala es 25μm.

Figura 5
Figura 5 El 3 de estadio larval VNC. Un clon Flp-de una sola clase axón terminal VI (VDAB) (genotipo como en el punto 2.2) se detecta el uso de anticuerpos anti-GFP (verde). Anti-CD2 etiquetas de toda clase IV termini (magenta). Barra de escala es 25μm.

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Discussion

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La Drosophila larvas DA modelo de neurona ofrece un excelente sistema genético para investigar los mecanismos que controlan la morfología neuronal y la formación de circuitos. MARCM se utiliza generalmente para el etiquetado y para la generación de mutantes DA clones neurona. Para MARCM que utilizar un pan-neural (por ejemplo, Gal4 C155) o DA neuronal específica del controlador. Utilizando un controlador de pan-neuronal, es posible utilizar directamente varias poblaciones ampliamente disponible en los centros públicos de acciones. Sin embargo, utilizando un controlador DA-neurona específica puede ser una ventaja, porque los clones de marca no se genera en el sistema nervioso central, y esos clones pueden complicar el análisis de los terminales DA axonal. Una lista de los comúnmente utilizados DA específicos Gal4 líneas se puede encontrar en Shimono et al (2009) 27. FLP-out puede ser particularmente útil cuando los investigadores desean concomitantemente ectópica expresan un gen utilizando el sistema binario Gal4-UAS 35 y la morfología de medida en una sola neurona etiquetados. Además de la imagenprotocolos que aquí se presenta puede ser utilizado cuando las neuronas DA están marcados con el sistema Gal4-UAS 35 solo.

Si un buen microscopio de fluorescencia de disección no está disponible, es posible seleccionar clones larva lleva utilizando en un microscopio normal de fluorescencia y un objetivo con una distancia de trabajo. En imágenes en vivo de la glorieta de dendritas (artículo 6) que inmovilizar la larva exclusivamente por la fuerza hacia abajo ejercida por el cubreobjetos. En la adaptación de este protocolo para que los investigadores otros usos también pueden inmovilizar las larvas a través de la anestesia 36,37.

Durante la tinción inmunohistoquímica, por lo general, el uso anti-GFP o anti-CD8 para el etiquetado de la neurona. En Flp-a cabo experimentos anti-CD2, además, puede marcar todas las neuronas en el que la línea piloto Gal4 utilizada es activa (Fig. 5). Al examinar DA terminales de los axones en el VNC, anti-Fasciclin2 etiquetado de anticuerpos puede ser utilizado para resaltar los tractos hito axón 7,22,38.

32. Además, las dendritas de neuronas DA, especialmente los de clase III y clase IV, se degradará rápidamente después del inicio de la disección. Le sugerimos disección y fijación de larvas de forma individual. La fijación debe ocurrir dentro de 5 minutos de la disección de la iniciación para asegurar el buen mantenimiento de la morfología de las dendritas. Finalmente, las larvas de montaje lo más plana posible en gran medida la ayuda posterior análisis morfométrico.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Los autores agradecen a RIKEN para su financiación. También agradecemos a Cagri Yalgin, Delandre Caroline, y Jay Parrish para las discusiones sobre los protocolos de genética e inmunohistoquímica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SZX16 fluorescence dissection microscope (with GFPHQ filter) Olympus Corporation SZX16
Live Insect Forceps Fine Science Tools 26030-10
26mm x 76mm depression slide glass Toshinriko Co. T8-R004
Sylgard 184 (or Silpot 184) Dow Corning 3097358-1004
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P-1524 This product has proven most effective
DPX mounting medium Sigma-Aldrich 44581
Rabbit anti-GFP Invitrogen A-11122 Dilution 1:500
Rat anti-CD8 Caltag 5H10 Dilution 1:200
Mouse anti-CD2 AbD Serotec MCA443R Dilution 1:700
Mouse anti-Fasciclin2 DSHB 1D4 Dilution 1:10

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Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics. J. Vis. Exp. (57), e3111, doi:10.3791/3111 (2011).More

Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics. J. Vis. Exp. (57), e3111, doi:10.3791/3111 (2011).

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