等离子体表面图案光刻技术的蜂窝网络创作

Summary

一个多功能等离子体光刻技术已经发展到稳定的表面图案为指导细胞附着生成。这种技术可用于创建网络，包括那些已用于研究几种，不同的细胞类型，模仿自然的组织和细胞。

Abstract

与微型和纳米级分辨率的细胞微环境的系统操作，往往需要破译各种细胞和分子的现象。为了满足这一要求，我们开发了一种等离子体的光刻技术来操纵创造与功能，范围从100纳米到毫米大小的图案表面的细胞微环境。这项技术的目标是可以学习的，在一个可控制的方式，单个细胞的行为，以及细胞和它们之间的相互作用的群体。

这种等离子体光刻方法的基础上选择性的表面化学修饰对基材通过屏蔽接触低温等离子体物理模具。这种选择性的屏蔽叶化学模式可以指导细胞粘附和运动。这种模式，或表面的模板，然后可以用于创建细胞，其结构可以模仿自然界中发现的的，并产生一个可控环境实验研究网络。该技术以及适合研究生物现象，因为它产生的生物相容性的方式透明的聚合物基材的稳定的表面图案。表面图案的最后几个星期到几个月，从而引导长的时间周期，这有利于长期的细胞过程，如分化和适应，研究细胞的相互作用。表面改性主要是化学性质，因此不引入地形或物理干扰结果的解释。它也不会涉及任何恶劣或有毒物质来实现图案和组织文化的兼容。此外，它可以应用于不同类型的聚合物基板，由于能力调整自己的属性是理想的，被广泛用于生物应用修改。分辨率可以实现也是有利的，如迁移，附着力强，或有约束力的具体过程的隔离允许离散明确的意见，在单一到多节水平。

该方法已涉及迁移，信号，组织的形成，和网络的行为和神经元的相互作用，在提审调查，形成不同网络的不同类型的细胞。

Protocol

1。创作的图案使用的模具

1. 概念设计的图案。创建模式，有助于形成细胞网络，控制细胞的接触，分离细胞，模仿自然的结构，或以其他方式指导细胞粘附和安置。
2. 计算机计算机辅助设计或CAD的光掩模的模式和创造的基础创造。所需的图案设计CAD软件如AutoCAD，然后将其发送给外部公司生产光罩。
3. 光刻生产主模式。玻片是一个薄薄的正面抵抗或厚厚的消极抵制取决于正在创建的结构尺寸与图案。玻片用于其好处是成本低，比硅片强，而不是生产尽可能多的灰尘，当断。另外，其他方便的结构，如衍射光栅，可作为主图案。
4. 图案的幻灯片是一叠没有图案的幻灯片。所有步骤都执行一个干净的流罩内，以尽量减少灰尘。
5. 创建主模具。锡箔比一叠幻灯片略大一些的容器创建持有30克的聚二甲基硅氧烷（PDMS）中，然后倒在光刻图案的表面，以创建一个初始的模具。 PDMS的是脱气，并允许一到两天治愈。
6. 一旦固化的PDMS揭下主模式和形式，为下一步的一个模具。
7. 6 G是2部分的环氧树脂（DEVCON＃14310（6克）的混合1分钟，然后倒入母模，脱气，可以治愈。脱气环氧树脂必须迅速完成（<8分），使用了很多的泡沫破周期使用之前，它只是薄薄的一层环氧套和泡沫去除，就不可能消除气泡。6克用于生产薄薄的一层，这有利于快速的泡沫去除。
8. 一个小时后，第2部分的环氧树脂将部分治愈更多的环氧树脂可以在上面增加而脱气产生较厚的结构，这是easer在以后的步骤处理。环氧树脂是可以治愈一到两天。
9. 一旦固化，环氧树脂被删除从PDMS母模和胶带包裹，形成一个容器周围的环氧树脂模具。然后创建一个工作模浇注到环氧树脂模具硅橡胶，脱气的PDMS，并固化为一到两天。
10. 一旦固化，模具的工作是剥落的环氧树脂和储存，以保持清洁。

2。表面图案与细胞指导模具

1. 模具工作的小部分被切断，并放置到聚苯乙烯培养皿。这些模具部分的位置标记。
2. 形成了从三脚架的小部分和加权，以确保形模具之间的工作和在培养皿表面接触。盘底部可观察到安置好。
3. 大会是放入等离子室。等离子体处理是发起并持续在29.6瓦（最大功率）10分钟使用空气等离子在150帕斯卡。
4. 等离子体处理后，模具和重量提审都被删除。
5. 在培养皿放在紫外光下10分钟内的生物安全柜消毒和储存在那里，直到种子细胞。

3。播种与细胞表面

1. CRL - 2266的SH - SY5Y人神经母细胞瘤或其他细胞培养的细胞类型中使用标准协议。
2. 合流的SH - SY5Y的CRL - 2266人神经母细胞瘤细胞测量视觉上的图案的表面上，播种前。
3. 标准的细胞分裂是开展以消除他们的培养皿的表面细胞。
4. 图案培养皿的表面上的细胞，一旦自由浮动，种子被摊薄后达到预期的汇合时，图案的表面上放置。
5. 这些细胞被允许定居和附着于表面。
6. 图案的培养皿中培养几个小时到几天，而细胞聚集到血浆创建的模式。
7. 当培养的神经母细胞瘤，维甲酸（10μM）是每天补充，以诱导细胞分化成神经元样的状态。维甲酸此外，在黑暗中。
8. 维甲酸是添加了好几天，每天分化后，将观察到的。
9. 媒体是取代每隔3-4天。

4。观察和分析

1. 随着时间的推移，以观察细胞的行为采取定期的活细胞或视频图像。对于实时图像，细胞置于显微镜舞台顶部保持在37℃，湿度为100％，5％的CO ₂细胞的孵化器。细胞也可以固定和染色在荧光下观察

5。代表性的成果：

实施等离子体光刻技术的一个典型的结果是形成一个细胞，这些细胞类似于一些任意的或自然的结构模式。这被认为是在图1A - B线和神经元的网络已经建立。可用于其他类型的细胞， 以及图1C - D，这说明人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和C2C12骨骼肌细胞形成电网。材料，如聚- L -赖氨酸，也可以是图案，图1e，以方便某些类型的细胞和作其他用途的附件。在显示神经元的情况下，创建的细胞，它们之间的连接网络。这复制在大脑中神经元之间的离散连接邻近的细胞，从而影响大脑的运作的自然会发生什么。随着这种结构在实验室的创建，连接的数量，位置，频率和其他因素，可以得到系统的控制。这些传讯的结果可直观地测量和额外投入，如化学或电刺激可实施探测网络的行为。

一个消极的结果将是一个杂草丛生的或不完整的的模式或受污染的样品。不完整或杂草丛生的模式会导致要么太少或太多的细胞不会提供一个理想的细胞量的格局，从播种基材。此外，如果不正确的设计模式（例如，线条过于狭窄）的细胞不会被它成功地附着和生长。在受污染的样品情况下，适当的清洁不会一直保持在步骤之一，但适当的细胞培养协议，由于血浆图案也消毒基板时，这是罕见的的。

图1。细胞和蛋白质的图案。

Discussion

这里介绍的调查方法使细胞的多细胞网络，模仿生物结构以及复杂的图案创作提供了一种方法来产生刺激的性质，然后方便两个分组的细胞的行为和环境因素的单细胞反应的调查亚细胞。使用这种方法是简单而强大的的，在相同的细胞培养实验室，因为它可以迅速地进行低成本设备。这也是强烈的细胞敏感，可以便于观察由此产生的行为和性质稳定的长的时间周期，这使得长期的细胞行为的调查。此外，它允许多元化的，因为它是兼容多种细胞类型，并可以创建任意模式进行的实验。该技术的长期稳定派生从表面功能的血浆传授，是表面的一部分，而不是涂层或其他层，它可以被删除或降级的事实。如果保存液下，这种类型的修改，可以保留其细胞数月的指导能力。

必要的实验，以确保有意义的结果，最关键的部分是创建主模式，最终将被用于细胞指导。如果这种模式是不正确的设计，细胞不会妥善应对的格局，并可能不会产生有益的行为。如线的宽度，图案间距，和其他的参数，可以大大影响与特定的模式的细胞相容性，通常是这样的参数的范围，可以筛选最合适的设计初始光掩膜创建。

出图案的账面相关的其他重要参数包括模具创造，保持无尘环境中，细胞种植和细胞培养一般不育。可透过各种传输采取步骤，以允许重复的PDMS铸造环氧树脂模具模具创造。环氧树脂模具创建，因为它不会以同样的方式降低作为抵制与小，高宽比结构，根据反复铸造模具。如果做得正确，传递模塑的尺寸和产量不会受到影响，但如果做得不正确，如脱气很差，固化不完全，或过度加热，气泡，表面粗糙度和模式的可发生变形，从而影响最终的结果。关于保持无尘环境，模具必须保持尽可能干净的任何灰尘会干扰工作的PDMS模具和表面，从而适当的等离子体屏蔽和化学图案之间的适当联系。细胞的播种密度，还必须进行优化，以确保既不太少或太多的细胞居住格局区域必须保持无菌，以避免细菌和其他污染所使用的细胞。

该技术也可以被纳入与其他元素，如微流体，微电极，和机械探头。这提供了额外的刺激细胞，为了更好地复制实验和今后的工作过程中的各种生理条件，重点是学习这些组合的效果